「蛋白酶活性测定方法」.doc

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理 每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入26冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4冷却去离子水稀释，4下离心20min（13，000g），上清液标号分装，并与4冰箱中冷却保存，24Hr待测。将肝胰脏及肠道组织用4去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。按样品重量加10倍的4冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴）。匀浆液在4下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。酶粉及饲料：取20克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解, 并放在40水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。方法：福林酚试剂法1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用分光光度计测定。1.2蛋白酶活性单位： 1克食靡或组织在30，PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。1.3试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。3. 0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。4. L酪氨酸。5. 缓冲液：磷酸二氢钙氢氧化钠缓冲液。A：0.2mol/L KH2PO4 (ml): 50;B：0.2mol/L NaOH(ml) 29.63C：水（ml） 120.37 PH（20）： 7.0 6酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N 氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可加入12滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4保存一周，变质后不能使用。1.4标准酪氨酸曲线的绘制1. 将精确称取L酪氨酸（先在105干燥23Hr）100mg小心地溶于60ml 0.1mol/L HCL 中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级别，一定要酪氨酸完全溶解，并且用去离子水稀释至1L ，该溶液含酪氨酸100微克/毫升。2. 根据下面的规定，从上述储备溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、70、80微克/毫升。3. 移取上述溶液2ml，加入一系列试管中，加5ml 0.4M Na2CO3然后加稀释的福林试剂1ml至各试管，立即混合均匀，并在30恒温水浴中显色20min，以721型（或72型）分光光度计在波长680nm处测定光密度（O。D值）。4. 计算K值；以OD值为纵坐标，酪氨酸溶度为横坐标，绘制标准曲线，微克数，确定K值。 1.5 操作步骤 将酪蛋白溶液放入30恒温水浴中预热5min，取1ml酶液注入试管中，按以下程序操作。 酶液1ml在30恒温水浴中预热12min + 2%酪蛋白1ml加入时立即记时，精确反应10min +0.4MTCA 2ml立即摇匀，终止反应。将各管剧烈混合并在30保持30min，以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。从水浴中取出静止10min过滤（11cm的whatman43#滤纸） + 滤液1ml + 0.4M Na2CO3 5ml + 稀释福林试剂1ml 摇匀，30恒温水浴显色20分钟 测定OD 值用720型分光光度计测定（波长680nm） 空白试验：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。1.6 计算公式 （公式1） 活力单位=4/10KODn/m 其中：4反应总体积为4ml10反应的时间为10minK比色计常数n酶液稀释倍数m-样品的质量（g）（公式2） 活力单位=4n/10/m 其中：酶活力测定的光密度值，在标准曲线上查得响应的酪蛋白的微克数。 4反应的总体积 10反应10分钟 n 酶稀释倍数 m-样品的质量（g）2碘淀粉比色法测定淀粉酶21原理 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算AMS 的活力。22试剂1 0.4mg/ml 底物缓冲液： 60ml2瓶，4冰箱保存。20.1mol/L 碘储备液：7ml2瓶，4避光保存。0.01mol/L 碘应用液的配制：将储备液：蒸馏水=1：9稀释，4避光保存。23操作测定管（u管）空白管（o）管底物缓冲液(ml)30预温5分钟1.01.0酶液（ml）0.02 混匀，30水浴， 准确反应7.5分钟碘应用液(ml)1.01.0蒸馏水6.06.02混匀在660nm波长，1cm光径，蒸馏水调零测光密度。24活性单位：（空白管吸光度测定管吸光度）0.41min 4 F空白管吸光度 1.07.5min0.02M 1克食靡或组织中AMS，在30与底物作用1min，水解1mg淀粉为1个单位。25计算公式 AMS u/dl=注：0.4- 底物缓冲液浓度1.0- 活性单位定义水解1mg淀粉量4- 酶液稀释了4倍0.02 - 酶液F- 测定时稀释的倍数W- 样品重量（g）3脂肪酶活性测定加5mL 0.025 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液和4mL聚乙烯醇橄榄油乳化液于100 mL锥形瓶中，置反应温度（37）水浴中预热510min，然后加入匀浆粗酶液1mL，准确反应30min后，立即加入95%乙醇1