胶体金标记工艺汇总.doc

精品文档免疫金的特性胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。来源：Gold 2免疫金的制备1用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。 在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再调胶体金的pH值。2将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应25min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。3加入浓度为0.2的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。4离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。5轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤24次。以彻底除去未结合的蛋白质。6免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。 免疫胶体金制备、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取 0.1ml(含蛋白质 540ug)加到 1ml 胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入 0.1ml 10NaCl 溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10即为最佳标记蛋白量。、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。下述标记步骤最为常见：用 0.1mol/L K2CO3 或 0.1mol/L HCl 调节金溶胶至所需 pH(标记SPA时调到 pH6.0)。于 100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为23ml），搅拌23分钟。加入 5ml 1 PEG20000 溶液。于 10000100000g 离心 3060 分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。将沉淀悬浮于一定体积含 0.20.5mg/ml PEG20000 的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 1cm/540nm=1.5 左右为宜，以 0.5mg/ml 叠氮钠防腐，置 4保存。包被后的金溶胶也可浓缩后于 Sephadex G-200 柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1BSA的缓冲溶液洗脱。通常用 IgG 包被的金溶胶洗脱液 pH 为 8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为 pH7.0。以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。胶体金标记蛋白质的纯化纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。（一）超迷离心法根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心（20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4离心1h,20nm和40nm金标记物用14000g于4离心1h.小心地吸出上清，将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量，平衡过夜后，重复离心2次，最后一次洗涤离心的沉淀，再用1%牛血清白蛋白缓冲液（含0.02mol/LNaN3）稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。制备的胶体金-蛋白探针可保存于4，如加入50%甘油可贮于0以下（-18）1年以上。以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金，按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同，用不同离心转速分离纯化，以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白，用125000g离心；抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白，用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀，其上为较疏松的红色沉积物，再上为透明的上清液。附贴管底的沉淀无用，以后操作步骤中不要搅起来，仍保持其贴于管底。弃去上清液后，用等体积的0.0lmol/LPBS（pH7.2）溶解疏松红色沉积物，同上重复离心1次，小心移去上清液，剩余0.5ml上清液，将疏松红色沉积物溶解后，即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。（二）凝胶过滤法凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。将前述胶体金-蛋白质复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液，以15000r/min离心15min（或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化）。吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400,Pharmacia公司产品，Sweden）色谱柱上分离纯化。柱床高20cm,直径0.8cm,加样体积为柱床体积的1/10.用0.02mol/LTBS液（内含0.1%BSA,0.05mol/LNaN3,pH8.2者用于胶体金标记IgG,pH7.0者用于胶体金标记蛋白A）洗脱，流速为8ml/h,按红色深浅分管收集洗脱液。可见先滤出的液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质。纯化的金标记蛋白滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明，此后为略呈黄色的未标记蛋白组分。表中列出胶体金与蛋白质结合后，用离心法纯化的条件。表6-8列出几种免疫金探针离心纯化的条件，仅供参考。超迷离心转速与金颗粒直径的关系颗粒直径/nm离心力/g 颗粒直径/nm离心力/g 2-3 12500010415640004-451200001520140006-48100000 几种免疫金探针离心纯化条件胶体金颗粒/nm pH 标记蛋白质离心力/g时间/min59.0羊抗人IgG 4500045 108.2McAb4500030156.5链霉亲和素120000 45 206.0SPA120000 30109.0羊抗兔IgG120000 60来源：赵 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.蛋白 与胶体金结合的最佳pH测定：取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次；每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH。最小蛋白用量的确定：光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45g/ml。 来源： 胶体金标记的实验操作（1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。1）待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4离心1h，去除聚合物。2）待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.96.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至910。由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。（2）蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5g/ml50g/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加1020。将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质540ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。（3）标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。（4）胶体金标记蛋白的纯化1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。用BSA做稳定剂的胶体金羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4离心1h；20nm40nm胶体金结合物，14 000g，4离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液（含0.02%NaN3），将沉淀重悬为原体积的1/10，4保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18保存一年以上。为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/51/10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4保存。最终可得到70%80%的产量。胶体金蛋白结合物的质量鉴定（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1%BSA，0.02%NaN3）将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD5200.25左右。一般应用液的OD520应为0.20.4。（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MFIGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。来源：胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原胶体金-抗HBs结合物的制备：其步骤为：超纯水溶解氯金