培养基促生长实验操作.doc

1 目的制订培养基灵敏度实验操作，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。2 范围 适用于所有配制好并灭菌的培养基。3 编写依据EP6.54 术语无5 职责QC卫检组人员负责培养基的配制、灭菌、灵敏度实验。6 内容6.1 使用的设备、器具生物安全柜、无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯等6.2 使用的菌株EP检测用ATCC的菌株:金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538大肠埃希菌Escherichia coli ATCC 8739铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 枯草芽孢杆菌 Bacilllus subtilis ATCC 6633沙门氏菌Salmonella enterica subsp ATCC 14028白色念珠菌Candida albicans ATCC 10231黑曲霉Aspergillus niger ATCC 16404培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代, 并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。6.3 检测频率每批配制、灭菌后的培养基均应做灵敏度测试。6.4 操作方法6.4.1 对照标准培养基用已经过实验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基.6.4.2 实验培养基 将琼脂类的实验培养基加热融化后，冷却至45左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入1520ml，备用。液体类的培养基直接使用。6.4.3 菌悬液的制备6.4.3.1 细菌菌悬液的制备方法一：取细菌的斜面培养物1耳匙接种在酪蛋白大豆消化肉汤培养基中3035培养1824h，取上述培养物用无菌水按10倍系列稀释，分别制成10-710-8的菌悬液备用。6.4.3.2 霉菌菌悬液的制备取白色念珠菌的斜面培养物1耳匙接种在沙氏琼脂斜面上于2025培养2448h，加入无菌水4ml制成原液，取上述原液按10倍系列稀释，分别制成10-610-7的菌悬液备用。取黑曲霉的斜面培养物加入无菌水4ml制成孢子悬液，取上述孢子悬液按10倍系列稀释，分别制成10-610-7的菌悬液备用。方法二：直接用杭州微球生物技术有限公司的产品-培养基灵敏度指示剂，该产品已经帮我们精确控制了细菌数量，只要直接拿稀释液稀释下就可以直接取到10100CFU试验菌。使用方便，数量精确。推荐用此方法操作。6.4.4 培养基的生长促进实验6.4.4.1 琼脂类培养基的生长促进实验 每株菌用2个实验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种0.10.5ml的菌悬液（约10100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养,取出平皿点计菌落数。实验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录1）6.4.4.2 液体类培养基的生长促进实验 每株菌用2管（或瓶）实验培养基，接种0.10.5ml的菌悬液（约10100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养,对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。6.4.5 培养基的生长促进和抑制特性试验6.4.5.1 液体培养基的生长促进特性试验 接种0.10.5ml的菌悬液（约10100CFU试验菌）于一定量适合的培养基。在特定温度下培养，培养时间不超过试验中规定的最短期限。与对照标准的培养基获得的微生物生长相比，接种微生物的生长应明显。6.4.5.2 固体培养基的生长促进特性试验采用表面涂布法，在每一块平皿上接种0.10.5ml的菌悬液（约10100CFU试验菌）适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间不长于试验中规定的最短期限。接种微生物的生长与对照标准的培养基获得的微生物生长相当。6.4.5.3 液体或固体培养基的抑制特性试验用适当培养基接种至少100 CFU适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间至少为试验中规定的最长期限。无受试微生物生长。（注：每种培养基生长促进和抑制特性试验的具体菌株见附录1）7 附录附录1 培养基生长促进和抑制特性表附录1：培养基的生长促进、抑制特性表培养基特性受试菌株培养时间培养温度酪蛋白大豆消化琼脂生长促进金黄色葡萄球菌 3天30-35铜绿假单胞菌 3天30-35枯草芽孢杆菌 3天30-35白色念珠菌 5天30-35黑曲霉 5天30-35酪蛋白大豆消化肉汤生长促进金黄色葡萄球菌 3天30-35铜绿假单胞菌 3天30-35枯草芽孢杆菌 3天30-35沙氏葡萄糖琼脂生长促进白色念珠菌 5天20-25黑曲霉 5天20-25R2A生长促进金黄色葡萄球菌 3天30-35铜绿假单胞菌 3天30-35枯草芽孢杆菌 3天30-35大肠埃希菌 3天30-35麦康凯肉汤生长促进大肠埃希菌 3天42-44抑制金黄色葡萄球菌 3天42-44麦康凯琼脂生长促进大肠埃希菌 3天30-35氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌液生长促进沙门氏菌 3天30-35抑制金黄色葡萄球菌 3天30-35木糖、赖氨酸、脱氧胆酸盐琼脂生长促沙门氏菌 3天30-35抑制大肠埃希菌 3天30-35甘露醇高盐琼脂生长促进金黄色葡萄球菌 3天30-35抑制大肠埃希菌 3天30-35微生物限度检查用培养基的灵敏度检查方法1）用于菌数计数的半固体琼脂培养基的灵敏度检查方法a取配制好的琼脂培养基平皿3个，在每块平板表面上用表面涂布法接种30-100个试验菌；同时用已确认的同型号培养基平皿3个做对照试验。B等待培养基表面的菌液风干后，将培养皿倒置，于培养基的使用温度下培养4872小时，取出培养皿点计菌落数。C样品培养基上微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70，则该培养基灵敏度视为合格。2）用于控制菌检查