子宫内膜癌端粒酶活性研究.doc

子宫内膜癌端粒酶活性研究中华肿瘤杂志 1998年第6期第0卷 临床研究作者：周春晓孙建衡金顺钱刘海玲陆士新单位：100021 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤医院肿瘤研究妇瘤科(周春晓、孙建衡)，病因室陆士新(责任作者)、刘海玲，肿瘤生物学检测中心(金顺钱)关键词： 子宫内膜肿瘤；端粒酶；聚合酶链反应 【摘要】目的探索端粒酶活性与子宫内膜癌发生发展的关系。方法采用PCR-TRAP方法检测34例子宫内膜癌和6例正常子宫内膜组织的端粒酶活性。结果在34例子宫内膜癌中，28例端粒酶活性阳性；6例正常子宫内膜组织中，有1例端粒酶活性阳性。结论端粒酶激活与子宫内膜癌的发生发展有密切关系，并有可能成为子宫内膜癌的临床肿瘤标记物。 Telomerase activity in human primary endometrial carcinomaZhou chunxiao, Sun Jianheng, Jin Shunqian, et al. Cancer Hospital (Institute), Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021 【Abstract 】ObjectiveTo investigate the possible relationship between telomerase expression and progression of endometrial carcinoma.MethodsThirty-four primary endometrial carcinoma and 6 normal endometrial tissue specimens were examined by means of telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay for telomerase activity.ResultsOf 34 endometrial cancer specimens, 28 (82.4%) showed telomerase activity, whereas 1 of 6 (16.7%) benign endometrial tissues exhibited telomerase activity. ConclusionTelomerase expression might contribute to the progression of endometrial carcinoma and could be used as its tumor marker.【Subject words 】Endometrial neoplasmsTelomerasePolymerase chain reaction最近的研究结果表明，端粒酶(telomerase)与细胞的分裂、增殖和永生化有密切关系，在肿瘤的发生、发展中起重要作用1。我们采用以PCR技术为基础的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)方法对子宫内膜癌组织进行检测，以了解端粒酶与子宫内膜癌发生发展的关系。材料与方法1.标本来源：34例子宫内膜癌组织和6例正常子宫内膜组织均取自我院妇瘤科手术标本并经我院病理证实。患者术前未接受任何治疗，标本均取于离体后1小时内，液氮速冻，保存-70冰箱。2.端粒酶提取：每份标本取50100 mg组织，用液氮在研钵内研成粉末后转至1.5 ml离心管中，立即加入500 l预冷的蛋白洗液(10 mmol/L Hepes-KCl，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT)充分混匀后，冰上静置10分钟，2 500 r/min 4离心5分钟，弃上清液，加入预冷的端粒酶裂解液200 l(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，5 mmol/L二巯基乙醇，0.5% CHAPS 10%甘油)混匀，放置冰上裂解30分钟，13 000 r/min 4离心30分钟，吸取上清转至另一预冷的离心管中。采用BCA方法进行蛋白含量测定。放置-80冰箱冻存。3.引物设计：根据文献1选用下列引物：TS 5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3，CX 5-CCCTTACCCT-TACCCTTACCCTAA-3，上述引物均由中国科学院微生物所合成。4.端粒酶检测：采用PCR-TRAP法检测端粒酶活性2，反应混合液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，1 mmol/L MgCl2，63 mmol/L KCl，0.005% Tween 20, 1 mmol/L EGTA, 50 mol/L dNTP, 1 g T4基因蛋白，0.1 g/ml BSA，2 U Taq DNA聚合酶，0.1 g TS引物和6 g端粒酶提取物，加双蒸水至终体积25 l混匀后，上层覆盖石蜡油于30 保温30分钟。90 2分钟灭活端粒酶，加0.1 g CX引物在DNA扩增仪(PE公司)如下循环：94 40秒，50 40秒，72 50秒，31个循环后，72延伸5分钟。取10 l PCR产物，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后，凝胶与X线片置-80放射自显影，2448小时显示结果，当出现6 bp的梯形带时结果为阳性(附图)。每次检测以6 g宫颈癌Hela细胞蛋白做阳性对照，反应混合液中不加蛋白提取物作为阴性对照。5.统计学处理：2检验进行统计学处理。P：宫颈癌细胞系为阳性对照；L：端粒酶裂解缓冲液为阴性对照；110：子宫内膜癌标本，其中18道为端粒酶阳性，9道为端粒酶阴性附图子宫内膜癌端粒酶检测结果结果1.子宫内膜癌中端粒酶的表达：34例子宫内膜癌中有28例端粒酶表达阳性，阳性率为82.4%；6例正常子宫内膜组织中，有1例端粒酶阳性。子宫内膜癌中端粒酶的表达明显高于正常子宫内膜组织(附表)。附表子宫内膜癌端粒酶的表达与临床病理因素分析临床病理因素例数端粒酶表达阳性阴性阳性率(%)病理诊断腺癌2822678.6腺鳞癌220100透明细胞癌110100乳头状腺癌330100正常内膜组织61516.7病理分级G11210283.3G2119281.8G3119281.8手术分期2117481.076185.754197.1110100合计3428682.42.端粒酶表达与组织分级的关系：34例子宫内膜癌中，组织分级G1、G2和G3的端粒酶阳性率分别为83.3%、81.8%和81.8%，经统计学处理差异无显著性(P0.05)。3.端粒酶表达与手术分期的关系：本组病例采用1989年FIGO提出的手术病理分期，期患者的端粒酶阳性率差异无显著性(P0.05)。讨论端粒是真核细胞染色体末端含有简单重复序列的特殊结构，它能防止染色体发生降解、端-端融合、重组和染色体丢失，在细胞分裂时，由于染色体复制的自身缺陷，随着细胞分裂次数的增加其端粒逐渐缩短，最终使细胞进入危机期，并导致细胞死亡。端粒酶于1985年由Greider等3从四膜虫的细胞提取物中首次发现，它是由RNA和蛋白体组成的核糖核蛋白体，属一种专一的依赖RNA的逆转录酶，能以自身的RNA为模板，从头合成染色体末端的端粒，以补偿细胞分裂时端粒的缩短，维持端粒的长度，保持染色体的动态平衡。目前，测定端粒酶的活性主要采用Kim等2建立的高效、灵敏的以PCR为基础的TRAP方法。通过近几年应用此项技术的研究发现，端粒酶和肿瘤细胞之间存在相互激发的关系，它通过合成端粒DNA而稳定端粒长度，使肿瘤细胞无限制地分裂、增殖1，2，4。Shay等5根据文献报道，总结归纳了人类20余种恶性肿瘤组织端粒酶活性的资料，发现在895例癌组织标本中，端粒酶的阳性率为85%；而在654例相应的癌旁和正常组织中，仅有9%的组织有端粒酶活性，提示端粒酶有可能成为某些肿瘤特异性的标记物和基因治疗的新靶点。妇科肿瘤与其他人体实体瘤一样，其端粒酶的表达也有较高的阳性率，如卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌的阳性率分别为86%、83%和92%6。我们的实验结果表明，在34例子宫内膜癌中，共发现28例端粒酶阳性，阳性率为82.4%；在6例正常子宫内膜组织中，仅发现1例端粒酶阳性，结果与文献报道相近，说明端粒酶在子宫内膜癌的发生发展中可能起到某种重要的作用。肿瘤组织端粒酶的活性与临床病理因素和预后的关系尚无明确结论7，Hiyama等8认为，乳腺癌和胃癌的端粒酶活性与肿瘤的大小和淋巴结转移有关，可作为一个判定预后的指标。Kyo等9发现在妇科肿瘤中，端粒酶活性与患者临床病理因素无关。在我们这组病例中也未发现端粒酶的表达与患者的手术分期和组织分级有关，但6例特殊类型的子宫内膜癌均有端粒酶表达，而且手术分期较晚的患者其端粒酶阳性率有相对增加的趋势。另外，因我们没有建立PCR-TRAP定量系统，而未能进一步分析端粒酶的活性高低与患者临床病理因素的关系。过去采用低灵敏度的端粒酶检测方法，认为端粒酶表达仅限于生殖细胞和永生化细胞，而在正常的体细胞无活性。随着PCR-TRAP方法的应用，人们发现在某些类型的体细胞也有端粒酶的活性表达，如造血干细胞、淋巴细胞、炎性白细胞和增生的前列腺等8，9。最近有人发现某些绝经期前的正常内膜标本有端粒酶活性，提示雌、孕激素可能影响端粒酶的激活和表达9，10。我们所检测的6例正常子宫内膜组织中，3例绝经前增殖期的子宫内膜组织中有1例端粒酶阳性，2例绝经后和1例分泌期子宫内膜端粒酶阴性，与国外报道基本一致。因此，正常内膜组织中端粒酶表达的临床意义和在子宫内膜癌发生中的作用有待进一步研究。根据上述初步研究结果和有关文献资料，我们认为有必要建立端粒酶定量检测系统，进一步开展端粒酶和端粒在子宫内膜癌和子宫内膜组织中的研究，以期全面了解端粒酶与子宫内膜癌发生发展的关系。参考文献1de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:2882-2885.2Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 226:2011-2015.3Greider CW, Blackburn EH. A telomeric sequence in the RNA of tetrahymena telomerase reguired for telomere repeat synthesis. Nature (Lond). 1989, 337:331-337.4Counter CM, Hirte HW, Bacchetti S, et al. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:2900-2904.5Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. E J C, 1997, 33:787-795.6Kyo S, Kanaya T, Ishikawa H, et al. Telomerase activity in gynecological tumors. Clin Cancer Res, 1996, 2:2023-2028.7Engelhardt M, Langenfeld J, Han W, et al. High telomerase activity in primary lung cancers: association with increased cell proliferation rates and advanced pathologic stage. J Nat Cancer Inst, 1997, 89:1609-1615.8Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1996, 56:3258-3262.9Kyo