金黄色葡萄球菌检测.doc

金黄色葡萄球菌检测1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1.1 恒温培养箱：361。1.2 冰箱：25。1.3 恒温水浴箱：3765。1.4 天平：感量0.1g。1.5 均质器。1.6 振荡器。1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。1.8 无菌锥形瓶：容量100ml、500ml。1.9 无菌培养皿：直径90mm。1.10 注射器：0.5ml。1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。2 培养基和试剂2.1 Baird-Parker 琼脂平板：见附录中1。2.2 脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录中2。2.3 兔血浆：见附录中3。2.4 营养琼脂小斜面：见附录中4。2.5 无菌生理盐水：见附录中5。3 操作步骤3.1 样品的稀释3.1.1 固体和半固体样品称取25g样品置盛有225ml生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min均质1min2min，或置盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1：10的样品匀液。3.1.2 液体样品以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。3.1.3 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。3.1.4 按3.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1ml无菌吸管或吸头。3.2 样品的接种根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液以0.3ml、0.3ml、0.4ml接种量分别加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在2550的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。3.3 培养在通常情况下，涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱361培养1h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 1培养，45h48h。3.4 典型菌落计数和确认3.4.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。3.4.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU200 CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：a）只有一个稀释度平板的菌落数在20CFU200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20CFU200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；以上按公式（1）计算。e）2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU200 CFU 之间，按公式（2）计算。3.4.3 鉴定从Baird-Parker平板中任选5个可疑菌落（小于5个全选），分别接种到5mlBHI和营养琼脂小斜面，361培养18h24h。取新鲜配置兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2ml0.3ml，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mlBHI，361培养18h48h，重复试验。4 结果计算公式（1）：式中：T样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A某一稀释度典型菌落的总数；B某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；d稀释因子。公式（2）：式中：T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A1第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；A2第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；B1第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；C1第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；C2第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；1.1计算系数；d 稀释因子（第一稀释度）。5 结果与报告根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按4中公式计算，报告每g（ml）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g(ml)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。附录 培养基和试剂1 Baird-Parker琼脂平板1.1 成分胰蛋白胨 10.0g牛肉膏 5.0g酵母膏 1.0g丙酮酸钠 10.0g甘氨酸 12.0g氯化锂（LiCl6H2O） 5.0g琼脂 20.0g蒸馏水 950mlpH 7.00.21.2 增菌剂的配法30%卵黄盐水50ml与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾10ml混合，保存于冰箱内。1.3 制法将各成分加到蒸馏水中，加入煮沸至完全溶解，调节pH。分装每瓶95ml，121高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50，每95ml加入预热至50的卵黄亚碲酸钾增菌剂5ml摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。2 脑心浸出液肉汤（BHI）2.1 成分胰蛋白质胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.5g葡萄糖2.0g牛心浸出液500mlpH7.40.22.2 制法加热溶解，调节pH，分装16mm160mm试管，每管5ml置121，15min灭菌。3 兔血浆取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100ml，溶解后过滤，装瓶，121高压灭菌15min。兔血浆制备：取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置（或以3000r/min离心30min），使血液细胞下降，即可得血浆。4 营养琼脂小斜面4.1 成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.020.0g蒸馏水1000mlpH7.27.44.2 制法将除琼脂以外的