遗传学实验 用GUS基因表达观察启动子功能.doc

用GUS基因表达观察启动子功能摘要 通过GUS基因表达染色程度判定启动子关键序列。1.引言在真核生物中，主要通过顺式调控元件启动子和反式作用因子转录因子的相互作用，对基因表达进行调控。启动子的功能可以利用报告基因进行检测。报告基因GUS基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码-葡萄糖苷酸酶。-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。科研工作中发现，盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVP1）在除了种子以外的所有组织中都有活性，它的活性在根和叶中能被盐诱导，尤其在根尖中。为了研究启动子的关键序列，构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVP1）不同长度启动区控制的-葡萄糖苷酸酶（GUS）载体pCAMBIA1391z（PTsVP:GUS），转染拟南芥，获得转基因拟南芥PT1，PA1和P7。发现PT1，PA1和P7具有不同的GUS活性及盐诱导活性。表明启动区长度对启动子功能有影响，由此推测启动子的关键序列及诱导特点。2.实验材料2.1实验材料2.1.1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82.1.1试剂配制MS培养基所需的母液，琼脂，蔗糖，1 mol/L的NaOH溶液，70乙醇，无菌水， 10次氯酸钠，琼脂粉，NaCl，1mol/L GUS染色液。2.1.1器具量筒，移液枪，烧杯，天平，玻璃棒，滴管，pH计，500 mL锥形瓶，高压蒸汽灭菌锅，培养皿，EP管，人工培养箱，吸管，吸水纸。2.2实验方法2.2.1配制MS培养基MS培养基：Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。MS培养基组成：成分分子量使用浓度 (mg/L)大量元素硝酸钾 KNO3101.111900硝酸铵 NH4NO380.041650磷酸二氢钾 KH2PO4136.09170硫酸镁 MgSO4.7H2O246.47370氯化钙 CaCl2.2H2O147.02440微量元素碘化钾 KI166.010.83硼酸 H3BO361.836.2硫酸锰 MnSO4.4H2O223.0122.3硫酸锌 ZnSO4.7 H2O287.548.6钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O241.950.25硫酸铜 CuSO4.5 H2O249.680.025氯化钴 CoCl2.62237.930.025铁盐乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA372.2537.3硫酸亚铁 FeSO24.7H2O278.0327.8有机成分肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素 VB10.1盐酸吡哆醇 VB60.5烟酸 VB5 或 VPP0.5蔗糖 sucrose342.3130g/L琼脂 agar7 g/L配制母液的优点是：1、避免每次配制培养基都要对几十种成分进行称量。2、减少了称量微量元素造成的误差。配制MS培养基：（1）用量筒和移液枪从各种母液中分别取出所需的用量：母液（大量元素 20）为10 mL，母液（微量元素 200）、（铁盐 200）、（有机成分 200）各1mL，加入烧杯中，再加入蔗糖6g，加蒸馏水至175mL左右。（2）用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH计测培养液的pH，一直到pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。（3）在大量筒中定容至200mL，倒入锥形瓶，加入1.6g琼脂粉。（4）同样的方法配制200mL含盐的培养基，在第（1）步中加入2.34g NaCl。（5）称0.005g左右的琼脂粉与10mL蒸馏水混合，配成0.05%琼脂液。（6）高压灭菌 第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼脂液等。第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 下，灭菌20 min。第四，灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固，或立即倒平板。2.2.2培养拟南芥幼苗（1）培养皿分装培养基将锥形瓶中的培养基加热融化，在超净工作台上将其趁热倒入四个培养皿，令其自然冷却凝固。（2）种子灭菌种子在EP管内经体积分数70乙醇漂洗l min，无菌水洗l次，等量无菌水和10次氯酸钠混合浸洗10 min，无菌水洗5遍，最后加入质量分数005的琼脂液悬浮，分别均匀撒于平板上。（3）适宜环境培养培养条件：在人工气候室培养，调节温度20，湿度75%,光照300mol/s m2，光周期16h光照/8h黑暗（4）盐处理将MS培养基上培养一周多的植株取10株左右转移到含有200mmolL-1NaCl的培养基上相同条件下培养16小时，剩下一半原条件继续培养。3.结果PT1染色深于PT2，说明PT1中启动子多于PT2的序列能增强GUS基因的表达。而PT2的小叶未被染色，说明PT2缺失的部分基因可能与GUS基因在小叶中的表达有关。PT7染色与PT2相似，说明PT7相对PT2缺失的启动子序列对于GUS基因表达作用效果影响相对较小。但是PT7中小叶染色，因此说明在所缺失中的启动子序列中存在调控GUS基因在小叶中表达的序列，同时根据PT2与PT1的对比，说明PT2相对PT1中缺失的序列与PT7相对PT2缺失的序列共同影响GUS基因在小叶中的表达。PT8相对PT7染色较浅，说明PT8相对PT7缺失的序列对GUS表达有增强作用。而PT8中根基本无染色，说明缺失部分序列对GUS基因表达影响较大。PT2经盐处理后，染色明显加深，而且小叶中也出现轻微染色，说明盐处理能促进GUS基因的表达。PT7经过盐处理后，染色也出现明显的加深，说明GUS基因的启动子仍然活性较强。PT8经盐处理后，染色稍加深，但对比不明显，说明