血凝(HA)和血凝抑制试验(HI).ppt

血凝 HA 和血凝抑制试验 HI 主要内容 一 基本概念二 HA和HI实验在禽病诊断中的作用三 基本操作四 注意事项 一 基本概念 1 血凝试验 HA 1 1定义某此病毒或病毒的血凝素 能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集 这种凝集红细胞的现象称为血凝 hemagglutination HA 也称直接血凝反应 利用这种特性设计的试验称血凝试验 HA 常见于正粘病毒 如AIV 副粘病毒 如NDV 和某些黄病毒 如JEV 痘病毒 以及经过处理过后的IBV 1 2血凝类型 1 可逆转型血凝素与病毒颗粒易分开 经超速离心后 病毒颗粒沉淀于管底 血凝素则游离于上清液内 这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆的 即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的血凝素后 可再与该血凝素发生凝集 如天花 鼠疫等病毒 2 不可逆转型血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密 不经过特殊处理血凝素不能与病毒颗粒分开 这种病毒引起的红细胞凝集 是不可逆转的 在一定的温度 37 下 病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键的N 乙酰神经氨酸酶 当病毒颗粒从红细胞表面游离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集病毒的能力 如流感病毒 鸡新城疫病毒等 3 凝集条件严格型有些病毒及其血凝素凝集红细胞的条件很严格 不仅对不同种动物的红细胞有严格的选择 即是对同种动物 由于性别和年龄的不同 对红细胞的凝集性能亦有差异 如JEV对公鹅的红细胞凝集性能比对经产老龄母鹅的红细胞凝集性能好 除此之处 还对缓冲液的pH值 温度及盐浓度等的要求均很严格 1 3原理血凝的原理因不同的病毒而有所不同 如 痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身 而是痘病毒的产物 类脂蛋白的作用 流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的 2 血凝抑制试验 HI 2 1定义当病毒的悬液中先加入特异性抗体 且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素 则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触 这时红细胞的凝集现象就被抑制 称为红细胞凝集抑制 hemagglutinationinhibiion HI 反应 也称血凝抑制反应 利用这种特性设计的试验称血凝试验 HI 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法 2 2原理特异性抗体与相应病毒结合 使病毒失去凝集红细胞的能力 从而抑制血凝现象 二 HA和HI实验在禽病诊断中的作用 1 用于禽流感 新城疫等具有血凝性病毒的鉴定根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理 给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清 相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力 因此 可利用从发病的鸡 鸭 鹅体内分离的病毒作HA和HI试验 病毒悬液能凝集红细胞 并且能被已知的抗血清 阳性血清 所抑制 那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒 如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性 那么 这个未知病毒培养物就是新城疫病毒 如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞 但不能被鸡新城疫血清所抑制 说明不是鸡新城疫病毒 可能是其他有血凝性的病毒 2 HI试验可用于发病禽群的诊断鸡 鸭 鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫 但往往有部分家禽由于各种原因免疫力水平达不到要求 因而造成某些传染病的流行 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型 给确诊带来困难 采用HI试验对鸡群中禽流感 新城疫等抗体进行测定 依据抗体滴度的高低和离散性有助于诊断 例如 经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群 新城疫抗体水平平均为7Log2 8Log2 最高为10Log2 而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高达11Log2 13Log2 就抗体分布而言 鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈正态分布 HI抗体在10Log2以上者仅占10 以下 4Log2以下者在1 以下 而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群 HI抗体中10Log2以上者占25 以上 而4oLg2以下者在10 30 之间 因此 依据禽群的抗体水平高低和分布 结合临床症状和病 死鸡的剖检变化 可诊断禽群是否患有新城疫或禽流感等 3 对禽群的免疫状态进行评价禽群或个体血清中的HI抗体水平与疫苗的免疫和对相应强毒侵袭的抵抗力都有密切关系 以新城疫为例 当HI抗体在7Log2以上进行活苗免疫时 由于高抗体可中和绝大部分的疫苗病毒 产生的免疫力很弱 HI抗体在5Log2 6Log2时 活苗免疫效果也受到一定的干扰 当HI抗体在4Log2以下时 活苗免疫效果良好 但对强毒感染抵抗力下降 一般认为 成年鸡新城疫的HI抗体水平在5Log2以上时 保护率在90 以上 4Log2以下时只有50 的鸡对强毒有抵抗力 2Log2以下时80 以上的鸡易感染新城疫 由于雏鸡母源抗体对疫苗首次免疫效果影响很大 了解母源抗体水平对疫苗免疫有重要意义 研究表明 母鸡血清抗体 卵黄抗体和5日龄雏鸡母源抗体三者之间有相关性 卵黄抗体与母鸡血清抗体基本一致 而1日龄雏鸡血清抗体低于卵黄抗体一个滴度 可检测种鸡卵黄抗体 估测1日龄雏鸡母源抗体水平 雏鸡新城疫母源抗体半衰期约为5天 免疫临界点为3Log2 这样可依据抗体水平 确定最佳免疫时间 三 实验步骤 以禽流感为例 参照禽流感防治技术规范 1阿氏 Alsevers 液配制称量葡萄糖2 05g 柠檬酸钠0 8g 柠檬酸0 055g 氯化钠0 42g 加蒸馏水至100mL 散热溶解后调pH值至6 1 69kPa15min高压灭菌 4 保存备用 21 鸡红细胞液的制备2 1采血用注射器吸取阿氏液约1mL 取至少2只SPF鸡 如果没有SPF鸡 可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡 采血约2 4mL 与阿氏液混合 放入装10mL阿氏液的离心管中混匀 2 2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500 1800r min离心8分钟 弃上清液 沉淀物加入阿氏液 轻轻混合 再经1500 1800r min离心8分钟 用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜 再重复2次以上过程后 加入阿氏液20mL 轻轻混合成红细胞悬液 4 保存备用 不超过5天 2 310 鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞 在锥形刻度离心管中离心1500 1800r min8分钟 弃去上清液 准确观察刻度离心管中红细胞体积 mL 加入9倍体积 mL 的PBS 用吸管反复吹吸使PBS与红细胞混合均匀 2 41 鸡红细胞液取混合均匀的10 鸡红细胞悬液1mL 加入9mLPBS 混合均匀即可 3抗原血凝效价测定 HA试验 微量法 3 1在微量反应板的1孔 12孔均加入25 LPBS 换滴头 3 2吸取25 L病毒悬液加入第l孔 混匀 3 3从第1孔吸取25 L病毒液加入第2孔 混匀后吸取25 L加入第3孔 如此进行对倍稀释至第11孔 从第11孔吸取25 L弃之 换滴头 3 4每孔再加入25 LPBS 3 5每孔均加入25 L体积分数为1 鸡红细胞悬液 将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入 3 6振荡混匀 在室温 20 25 下静置40min后观察结果 如果环境温度太高 可置4 环境下反应1小时 对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底 3 7结果判定将板倾斜 观察血凝板 判读结果将板倾斜 45度左右 观察血凝板 判读结果 红细胞全部凝集 均匀铺于孔底 即100 红细胞凝集 红细胞凝集基本同上 但孔底有大圈 红细胞于孔底形成中等大的圈 四周有小凝块 红细胞于孔底形成小圆点 四周有少许凝集块 红细胞于孔底呈小圆点 边缘光滑整齐 即红细胞完全不凝集能使红细胞完全凝集 100 凝集 的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价 此效价为1个血凝单位 HAU 注意 对照孔应呈现完全不凝集 否则此次检验无效 4 血凝抑制试验 HI试验微量法 4 1根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原 以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点 终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数 例如 如果血凝的终点滴度为1 256 则4HAU抗原的稀释倍数应是1 64 256除以4 4 2在微量反应板的1孔 11孔加入25 LPBS 第12孔加入50 LPBS 4 3吸取25 L血清加入第1孔内 充分混匀后吸25 L于第2孔 依次对倍稀释至第10孔 从第10孔吸取25 L弃去 4 41孔 11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25 L 室温 约20 静置至少30min 4 5每孔加入25 L体积分数为1 的鸡红细胞悬液混匀 轻轻混匀 静置约40min 室温约20 若环境温度太高可置4 条件下进行 对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底 4 6结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度 只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2 阳性对照孔血清误差不超过1个滴度 试验结果才有效 HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性 HI价等于31og2为可疑 需重复试验 HI价大于或等于41og2为阳性 四 注意事项 目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题 会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果 1 注意抗原相的差异 实践中 经常会出现不同厂家生产的相同亚型的禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同 这是由于禽流感病毒变异较快 存在抗原相的差异 禽流感病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和力不同而分为三种类型 对本株和异株免疫血清均呈较高效价的为 R 相 对本株效价高对异株低的为 P 相 对本株及异株均低的为 Q 相 如果在试验中出现相的差异 所测结果会相差2 3个滴度 所以在血凝抑制试验操作时 挑选亲和相毒株作为测定抗原较好 这样会提高诊断的灵敏度 2 注意消除非特异性因素 禽类血清中 尤其是水禽血清 往往含有非特异性血凝抑制因子 在做禽流感血凝抑制试验时会出现2 3孔有凝集现象 因此 在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前 有必要对血清中非特异性因子进行排除 常用消除方法 FAO推荐 1 鸡的红细胞吸附法1 1试剂鸡的红细胞 要充分洗涤 PBS pH7 5 4 保存 阳性对照血清 阴性对照血清 1 2方法加入25 L鸡的红细胞到100 L血清中 4 用微量振荡器振荡20 30min 加入100 L灭菌PBS 用RDE处理的血清除外 4000转离心1min 取出上清 进行HI试验 用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应 2 RDE 受体裂解酶 消除法2 1试剂 RDE 用20mL无菌PBS稀释 小量分装 20 保存一周 注意避免反复冻融 PBS pH7 5 4 保存 阳性对照血清 阴性对照血清 2 2方法 2 2 1鸡血清加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中 充分混合 56 水浴30 60min 加入6倍体积于血清体积的PBS 2 2 2其它禽类血清依据用RDE处理鸡血清方法处理后 继续按下列方法进行 用25 5 L鸡的红细胞到500 L血清中 4 用微量振荡器振荡20 30min 4000转离心1min 3 热灭活法3 1鸡血清取100 L血清样品放入一灭菌离心管中 各取100 L阳性血清和阴性血清加入到另2个灭菌离心管中 56 水浴30min 3 2其它禽类血清血清用鸡的红细胞处理后 分别取100 L样品 阳性血清 阴性血清放入灭菌离心管中 56 水浴30min 热灭活是一种排除非特异性因子的有效方法 但对特异性抗体破坏较大 采用1 同源禽种红细胞作为指示细胞进行水禽血清抗体效价测定 将结果降低1个滴度作为测定结果 朱燕秋等 中国兽医杂志 2009 45 2 42 43 3 注意抗原的标定 在禽流感血凝抑制试验中抗原标定至关重要的一个环节 抗原配制完后 需对所配制的抗原进行标定 看所配制的抗原是否达到所需标准 如工作抗原效价过高或过低对结果都有一定的影响 过高 测定抗体效价偏低 过低 测定效价过高 甚至很高 所以在禽流感血凝抑制试验中必须对抗原进行标定 4 注意严格规范操作 在进行试验操作时很容易出现错误 所以进行实验时一定要严格操作 每次测定应有严格的温度范围和作用时间 出现错误时要认真查找原因 以免类似错误再次出现 以下是容易出现的错误 1 对照孔凝集盐类凝集 所谓盐类凝集即稀释液中氯化钠达至一定高浓度时 即使没有血清抗体也能发生凝集反应 当生理盐水被细菌污染时也可出现对照孔凝集 血清变质或受细菌污染 2 全部凝集当红细胞受细菌污染或保存时间过长可出现此现象 抗原滴加时出现失误 工作抗原效价过高 生理盐水受细菌污染或其它因素 3 红细胞全部下滑 当配制抗原时 配制工作抗原效价过低 不足以凝集鸡红细胞 加样时所有孔全部加成生理盐水亦出现全部下滑现象 4 不同来源 不同浓度的红细胞会使结果差异很大 所以红细胞来源一定要相同 一般需要3只或3只以上公鸡来提供红细胞 将3只以上公鸡红细胞混合在一起 有抗体鸡提供的红细胞