γ－生育三烯酚对人结肠癌HT29细胞中DNA损伤作用的研究.doc

生育三烯酚对人结肠癌HT29细胞中DNA损伤作用的研究【摘要】目的探讨生育三烯酚对结肠癌细胞中DNA的损伤作用。方法生育三烯酚与结肠癌HT29细胞共培养，采用单细胞电泳法检测生育三烯酚对HT29细胞中DNA的损伤程度。结果生育三烯酚对人结肠癌细胞株HT29细胞中DNA分子有较大程度的损伤，且与处理的浓度存在一定的相关性。结论生育三烯酚对结肠癌细胞具有很强的细胞毒作用，在生育三烯酚作用下HT29细胞的DNA断裂损伤增加，可能就是生育三烯酚抗肿瘤效应的重要作用机制之一。 【关键词】 生育三烯酚类； 结肠肿瘤； DNA损伤【基金项目】 国家自然科学基金(30471444)Study on γTocotrienol induced DNA damage in human colon carcinoma HT29 cellsXU Weili, CHEN Bingqing, WANG Qi, LIU Huikun, SUN Xiangrong, SUN Wenguang.School of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081, China【Abstract】 Objective To study the effect of γTocotrienol on the DNA damage of colon cancer HT29 cells. Methods The colon cancer HT29 cells were cultured with γTocotrienol in vitro. The DNA damage of colon cancer cells was determined by the single cell gel electrophoresis assay. Results γTocotrienol could induce the DNA damage of colon cancer celllines HT29 and show doseresponse relationship. Conclusions The γTocotrienol has great cytotoxic effect on colon cancer cells, the results indicating that the increasing of DNA damage in colon cancer may be a very important mechanism of γTocotrienol antitumor effects.【Key words】 γtocotrienol; Colon cancer; DNA damageHerbert M. Evans于1922年在加利福尼亚大学实验室里发现了Vitamin E1，它是一种重要的脂溶性抗氧化剂。Vitamin E化合物家族有生育酚和生育三烯酚2个亚型。至少有种具有Vitamin E生物活性的异构体从植物中被分离出来：即α，β，γ，δ生育酚和α，β，γ，δ生育三烯酚。其中，生育三烯酚来源广泛，在棕榈油和米糠中含量较高，其他天然来源包括椰子油、可可油、豆油、大麦和麦芽。此外，肉和蛋中也检测到生育三烯酚的存在。而向日葵、花生、胡桃、芝麻和橄榄油中，则只含有生育酚1。 生育三烯酚由1个色原烷醇核和1个不饱和侧链(形成异戊二烯链)组成。生育三烯酚不同的异构体在色原烷醇核上的甲基取代基不同，α型有3个甲基，而β和γ有2个，δ型只有1个甲基。γ生育三烯酚的结构式见图1。图1 γ生育三烯酚的结构式（略）Figure 1 γTocotrienol structure 体内外实验表明，γ生育三烯酚具有控制肿瘤细胞生长，降低或延缓体内肿瘤发生的作用26。但生育三烯酚的抗癌作用机制至今还不十分明确，随着分子生物学和细胞生物学的发展，γ生育三烯酚抗肿瘤作用机制的研究成为新的研究热点。本文通过体外培养人结肠癌HT29细胞，观察γ生育三烯酚对人结肠癌细胞中DNA 的损伤作用，探讨γ生育三烯酚抗肿瘤的作用机制，从而为通过膳食干预而预防某些常见癌症的发生提供试验依据。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 仪器 Labo AutoCLAve高压灭菌器、Program Oven干热灭菌箱(日本SANYO公司)；E600型Nikon ECLIPSE生物显微镜(日本尼康公司)；AllegraTM64R型低温高速离心机(美国Bechman Company)；MODEL 5410 CO2培养箱(NAPCO公司)。1.1.2 试剂 溴化乙锭(EB)Fluka公司分装；RPMI 1640培养基、小牛血清、Tris均购自Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO，Acs Grade)、Triton X100、低熔点琼脂糖(Biotechnology Grade)、Amresco分装；正常熔点琼脂糖 Spanish分装；其余试剂均为分析纯。 纯度99的γ生育三烯酚购自新加坡Davoslife公司。1.1.3 细胞株 HT29细胞由哈尔滨医科大学公共卫生学院毒理教研室惠赠。1.2 方法1.2.1 细胞培养 HT29细胞培养在含青链霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(含谷氨酰胺)中，于37 ，5% CO2培养箱中培养，用0.02% EDTA/0.25%胰酶消化，传代。1.2.2 药物处理 将γ生育三烯酚溶于无水乙醇中，分别配成1×106和4×106 μmol/L的贮备液；贮存于-20 备用。根据细胞毒性试验，确定用于培养HT29细胞的γ生育三烯酚终浓度为0、15、30和60 μmol/L。以无水乙醇作为溶剂对照，终浓度为0.15%(V/V)。培养48 h后收集各组细胞，分散成单个，悬浮于200 μl pH 7.4 PBS中，此步在暗室及较低温度下进行(为了避免额外的DNA损伤)。1.2.3 玻片制备 清洁剂中清洗，酒精浸泡过夜，取出后烘干备用。1.2.4 铺胶 用pH 7.4 PBS配制0.8%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.8%低熔点琼脂糖(LMPA)各5 ml。取100 μl NMPA滴加在磨砂载玻片上，用盖玻片使胶均匀展开，置4 固化5 min，然后去除盖玻片，即第一层胶；取新鲜制备的细胞悬液样品5 μl与95 μl 0.8%NMPA在37 下充分混匀，迅速铺于第一层胶上，盖上盖玻片，4 固化5 min。1.2.5 裂解 取下盖玻片，将凝胶载玻片缓缓浸入新鲜配制的4 预冷的细胞裂解液(2.5 mol/LNaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L Tris、1%肌氨酸钠，pH=10；使用前加入1% Triton X100和10%的DMSO)中，4 裂解2 h。1.2.6 DNA解旋 取出玻片，用去离子水洗去过多的盐，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的预冷电泳缓冲应用液(电泳缓冲应用液：10 N NaOH 30.0 ml；200 mmol/L EDTA 5.0 ml；定容至1 000 ml，混匀，电泳前新鲜配制)，高于胶面2 mm，无气泡。避光放置30 min，使DNA解链。1.2.7 电泳 恒压25 V，300 mA电泳30 min。1.2.8 EB染色、镜检及结果评价 切断电源，从电泳槽中取出玻片，去离子水清洗干净。20 μg/ml溴化乙锭(EB)染色，用去离子水洗净，盖上新盖玻片，于荧光显微镜下观察。未受损细胞表现为圆形荧光核心(即彗星头部)，没有尾巴。受损细胞则有彗星尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。×200倍拍摄。采用Kinetic Imaging Comet 4.0软件进行数据图像分析。每个样品中随机挑选100个细胞计算拖尾率。1.2.9 统计分析 分别对各指标进行方差分析，各剂量组同对照组的比较采用Dunnettt检验,显著性水平均取0.05。用最小二乘法分别建立各指标对剂量的线性回归方程。以上分析均采用SPSS 13.0 软件进行。2 结果2.1 γ生育三烯酚对HT29细胞作用后电泳图谱 γ生育三烯酚(浓度为0、15、30、60 μmol/L)处理HT29细胞48 h，电泳后于荧光显微镜下观察，结果见图2。由图2可见，对照组在电泳图谱上仅出现荧光团，无拖尾现象。γ生育三烯酚处理HT29细胞后，在荧光团后面出现较长的拖尾现象，高剂量组荧光团明显减小，说明γ生育三烯酚对HT29细胞中DNA具有损伤作用。2.2 不同浓度γ生育三烯酚对HT29细胞DNA的损伤影响 分别用15、30、60 μmol/L的γ生育三烯酚处理HT29细胞48 h后，采用单细胞电泳技术观察不同浓度的γ生育三烯酚对人结肠癌HT29细胞DNA的损伤情况。由表1可见，不同浓度的γ生育三烯酚对HT29细胞中DNA的损伤作用存在差异性。随着γ生育三烯酚处理浓度的增加，细胞拖尾率及平均尾长均增加(拖尾率从4.5%增加到83.5%,平均尾长由1.35增加到22.4)，回归分析(Tail DNA=0.913×group+3.744,F=71.755,P0.01; Tail Length=0.362×group+0.5, F=49.655,P0.01;Tail Extent Moment=0.227×group-0.975,F=44.196,P0.01)说明γ生育三烯酚对DNA的损伤作用随其剂量增大而增强。图2 结肠癌HT29细胞的单细胞电泳图（略）Figure 2 Comet assay of HT29 cells表1 γ生育三烯酚作用48 h后对HT29细胞DNA损伤的影响（略）Table 1 Effect of γT3 on DNA damage in HT29 cellsNote：*P0.05；F Test: Tail DNA F=54.276，P0.01；Tail Length F=14.917，P0.01；Tail Extent Moment F=15.940，P0.013 讨论 γ生育三烯酚属于类异戊二烯植物化学物，具有广泛的生理功能，其潜在的肿瘤预防作用已受到广泛关注。许多细胞学研究证实，γ生育三烯酚对体外多种癌细胞的生长有抑制作用，而且与癌细胞株、生长状态、接种浓度、γ生育三烯酚的用量和作用时间有直接的关系。γ生育三烯酚抗肿瘤作用机制可能与诱导肿瘤细胞发生凋亡、影响细胞增殖周期等有关。 单细胞凝胶电泳法是20世纪80年代建立并逐步发展起来的一种快速检测细胞DNA 断裂损伤的方法7。该文采用碱性单细胞凝胶电泳技术8，研究发现结肠癌HT29细胞经γ生育三烯酚处理后出现了彗星拖尾现象，表明γ生育三烯酚对结肠癌细胞中DNA分子有损伤作用，并且存在剂量效应关系。因此，提示γ生育三烯酚抗结肠癌可能是通过对其细胞中遗传物质DNA的损伤作用途径来实现的。孙文广等人的研究结果已证实，γ生育三烯酚能够诱导SGC7901细胞DNA损伤9。这些研究结果为消化道癌症患者的膳食干预以及功能食品的开发提供了实验依据。 综上所述，从细胞分子水平研究γ生育三烯酚对人癌细胞染色质DNA的断裂作用,从染色质DNA的角度探讨γ生育三烯酚的抗癌机制,以期为γ生育三烯酚预防癌症提供更充足的理论依据。【参考文献】 1Packer L, Weber SU, Rimbach G. Molecular aspects of alphatocotrienol antioxidant action and cell signalling J. J Nutr, 2001,131(2):369S373S.2Mo H, Elson CE. Apoptosis and cellcycle arrest in human and murine tumor cells are initiated by isoprenoids J. J Nutr, 1999,129(4):804813.3Sakai M, Okabe M, Tachibana H, et al. Apoptosis induction by gammatocotrienol in human hepatoma Hep3B cells J. J Nutr Biochem, 2006,17(10):672676.4Shah SJ, Sylvester PW. Tocotrienolinduced cytotoxicity is unrelated to mitochondrial stress apoptotic signaling in neoplastic mammary epithelial cells J. Biochem Cell Biol, 2005,83(1):8695.5Sylvester PW, Shah SJ, Samant GV. Intracellular signaling mechanisms mediating the antiproliferative and apoptotic effect