第四章 无性系的快速繁殖.doc

第四章 无性系的快速繁殖 许多栽培植物都是靠无性系来繁殖的，例如果树（柑橘、苹果）花卉等。这些植物的基因是高度杂合的，为了在栽培过程中保持住品种的原有品质，只有通过无性繁殖才能达到目的。 其次，有些栽培植物在长期进化和人工选择的过程也形成了无性繁殖的能力，但无性繁殖的倍数较低，为了满足生产需要，我们要大量地繁殖优良种苗。有些优良新品种为了在生产中迅速推广，也需要尽快扩大群体，所以，就有了以组织培养为手段的植物无性系的快速繁殖技术。 快速繁殖的高速度是由以下3种因素构成的：1较高的繁殖倍数，2较短的繁殖周期，3周年生产。 4-6周一个继代周期，3-4倍的增殖倍数，由一个个体可以繁殖出6000-6000万个个体，生产潜力巨大。第一节 无菌培养的建立一、外植体的选择根据培养目的和所涉及的植物种类进行选择，一般确定原则为：1、较大的草本或木本植物：茎段。2、较小的或丛生的草本植物：叶片、花梗、花瓣等。二、外植体的采样和灭菌采样即从原始植株上采取相应的器官作为接种的外植体。采样的部位、地点和采样时的气候对外植体的灭菌都会产生影响；外植体本身的发育状况也会对灭菌产生影响。三、首次接种污染率的估算和对策 为了保持外植体的生命力，外植体的灭菌时间是有限制的，这就不可避免地带来首次接种的污染问题，有时污染率还会很高，限制无菌系的建立。 灭菌效果为50%时，若每瓶接种3个外植体，则无污染的概率为0.53=0.125,有污染的概率为0.875。 最有效最经济的办法就是采用小容器单瓶单个接种，这可以最大限度地获得无菌系。第二节 诱导外植体生长和分化 再生力强的材料，获得了无菌材料就等于建立了无菌培养系，而对于再生能力差的材料来说，获得了无菌材料还不等于建立起了无菌培养系，必须诱导外植体生长和分化。一、顶芽和腋芽的发育（茎尖培养）植物再生的第一种方式（一）、小茎尖的培养外植体为茎顶0.2-0.3mm的区域，包含茎尖生长点和12对叶原基，外植体需要在解剖镜下切割。（二）普通茎尖培养外植体为比较大一些的茎尖，5-20mm的芽尖、侧芽或带节的茎切段。操作简便，易于成活，成苗时间短。（三）、外植体的发育和增殖途径单个芽接种到培养基上之后，可以萌生出单个的苗或多个苗，后者在整体植株上可能决不发生。抑制顶端优势或诱导侧芽萌动，需要在培养基中添加细胞分裂素，促使外植体形成芽丛。如果在培养过程中，茎尖或腋芽不易伸长，可加适量的赤霉素予以克服，赤霉素还能减少茎基部的愈伤组织，提高芽的成活率。如果观赏植物的观赏性是由于病毒感染造成的，则不宜用小茎尖培养。如显脉天竺葵。二、诱导不定芽的产生(植物再生的第二种方式)外植体为不含茎尖或腋芽的植物器官或组织。（一）、不定芽的形成途径1、由愈伤组织发生（器官发生型的再生方式）外植体失去原有轮廓，形成愈伤组织，在愈伤组织上发生不定芽。2、由外植体表面直接发生（器官型的再生方式）由外植体脱分化的细胞直接分化形成不定芽，没有经过愈伤组织阶段。例如：百合、贝母、非洲紫罗兰等3、外植体的发育过程：脱分化再分化（芽、根）（二）激素调节愈伤组织的器官发生生长素诱导脱分化、细胞分裂素诱导芽的形成。愈伤组织的形成、分化和器官发生受生长素/细胞分裂素比值的影响。比值高时，利于外植体的脱分化，形成愈伤组织；比值低时，利于芽的形成；比值适中，愈伤组织不分化，按原有方向生长；在脱分化之后， 生长素/细胞分裂素比值高时，利于不定根的形成。一般先诱导形成芽，在诱导形成根，比较适宜。（三）、不定芽发育对无性系后代性状表现的影响不通过愈伤组织阶段（器官型的再生方式）而直接在器官表面形成不定芽的途径，对保持原有品种的特性更有利。愈伤组织会使不定芽发生突变的几率增加。但并不是器官型的再生方式总能保持原有品种的特性，对于叶色嵌合体，愈伤组织途径和茎尖培养更有利。三、体细胞胚状体的发生与发育（植物的第三种再生方式）目前已经有50余科120余种的植物被诱导出了胚状体。（一）、胚状体的发生途径1、由外植体的表皮细胞直接产生胚状体2、由外植体组织内部的细胞产生胚状体3、由愈伤组织的表面细胞产生胚状体4、由胚性细胞复合体的表面细胞产生胚状体5、由单个的游离细胞直接产生胚状体石蜡切片、跟踪观察方可确定胚状体的发生方式（二）、胚状体与茎尖培养和不定芽再生植株方式的差异1、胚状体多来自单细胞，嵌合体少。2、胚状体很早就有两极分化、是器官分化齐全的微型植株。3、胚状体与母体植株的结构联系少，无共同的维管束相连，容易分离。（三）、胚状体的发生外植体（脱分化培养2、4-D，IAA等）愈伤组织（悬浮震荡培养）悬浮单细胞或小细胞团（撤除生长素）胚状体胚状体的形成量很大，反复继代培养后，形态发生能力逐渐丧失四、原球茎的发育（兰科植物的再生方式）（一）原球茎的概念原球茎最初是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造，种子萌发初期，并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端胀破，膨大的胚成小圆锥状，称原球茎。（二）、原球茎培养的意义兰花高度杂合，种子繁殖会失去兰花固有的品质和风格。将兰花的茎尖作为外植体接种到培养基上后，在茎尖基部形成原球茎，将原球茎切割，会进一步地形成原球茎，在一年内，可以由一个个体繁殖出400万株基因型一致的兰花个体，导致产生“兰花工业”。原球茎培养已经成为目前兰花繁殖的标准方法。第三节 促进中间繁殖体的增殖在诱导外植体生长和发育过程所获得的芽、不定芽、胚状体和原球茎叫中间繁殖体。在一定时期内，让培养材料以几何级数递增，叫中间繁殖体的增殖。增殖阶段所用的培养基，一般与诱导外植体生长和分化用的培养基相同。在无性系的快速繁殖过程中，无菌系的建立和外植体的分化再生只是快速繁殖的两个必不可少的环节，但不是经常要做的，而中间繁殖体的增殖却从不停顿，视生产需要，确定生产规模。第四节 壮苗与生根第五节一、生根培养（一）生根培养基1、无机营养1/4-1/2高浓度的无机营养有利于茎叶的分化，低浓度的无机营养有利于根的分化。2、糖1/2，利于组培苗由异养、半自养向自养转化3、激素去掉细胞分裂素或只用低浓度的细胞分裂素，生长素的浓度升高，一般使用NAA。二、光照1000-3000Lux，增强组培苗对水分胁迫和对疾病的抵抗力。三、开瓶练苗增强对移栽后空气湿度的适应性。第五节 组培苗出瓶种植和苗期管理一、水分1、半盆栽培 2、地膜覆盖 3、加湿装置二、栽培介质疏松透气，适宜的保水性，容易灭菌，不利于杂菌孳生草炭、珍珠岩、粗砂、谷壳、锯末、炉灰渣等，按比例混合三、防止杂菌孳生百菌清、甲基托布津、多菌灵等土壤处理或叶面喷洒移栽前的根部清洗四、光照前期遮光、后期光照充足，散射光为好，照度为4000-1000Lux。五、温度15-25，与整体植株一致。第六节 增殖率的估算及试管繁殖的限制一、无性系快速繁殖增殖率的估算，其中：Y为年增殖率，x为每周期的繁殖倍数，n为每年繁殖的周期数。二、实际可能性污染、场地、人员三、无性系快速繁殖的限制1、市场需求2、成本核算3、新种类的开发4、一些植物在培养中发生变异5、培养技术存在的问题：酚污染、玻璃苗、管理及生产人员的素质第七节 影响植物快速繁殖成功的因素一、培养基1.无机盐浓度的影响，如越橘的嫩茎在1/4浓度的MS培养基上生长好，在完全浓度的MS培养基上生长受限制。2.糖浓度培养基的渗透压对培养组织的生长发育、器官发生影响很大，糖是渗透压的调节剂。加大渗透压，可以抑制百合产生小鳞茎，可以促使桃幼胚进行“胚性生长”。3.维生素核黄素对烟草的愈伤组织生长有抑制作用，硫胺素则又是必须的。4.生长素和细胞分裂素1）在诱导愈伤组织时，生长素是脱分化培养基中必须的成分。2）单子叶植物和双子叶植物对激素的反应差异单子叶植物能耐受较高浓度的生长素，使用浓度可达1-10mg/L，双子叶植物则对生长素敏感，使用浓度仅为0.01-1.0mg/L。单子叶植物和双子叶植物对细胞激动素的反应无差别，使用浓度为0.5-2.0mg/L。3）对激素的反应同植物的基因型有关4）“驯化”现象：在组培时会发现，有些中间繁殖体在经过高世代的继代培养后，即使在培养基中不在加入激素也能进行正常的增殖和生长的现象。二、外植体（一）外植体的大小：影响污染率和成活率（二）外植体的来源：来源不同，形态发生能力不同。“条件化”效应：从培养条件下的植物上取得的外植体，已具有被促进了的形态发生的能力，对其进行继代培养时，很容易再生出相应的器官来，这种现象称为“条件化”。，（三）生理学年龄1、沿植物体的主轴而论，越向上的部位，其生长时间越短的，即形成较晚的组织，其生理的（或发育的）年龄越老，即越接近发育上的成熟。2、幼年的组织比老年的组织具有较高的再生能力。例：常春藤幼年的组织、胚和胚器官，具有较高的再生能力。3、植物器官在发育过程中，器官或组织与整体植株分离得越早，再生的可能性越高。例：蕨类植物幼小的叶原基可以转变为芽，但是稍晚些时期的幼叶切下培养则只能形成叶片4、再生能力指先发生愈伤组织，再从它诱导形态发生的能力。（四）外植体的极性效应极性效应在唐菖蒲、石刁柏的培养中被发现。例：虎尾兰的叶块顺着形态学方向放置时，发生的不定芽多，水仙的花葶切段倒接在培养基上，才会发生不定芽，不同的植物反应不同。三、光照（一）光周期（光照的长度）1、对诱导花芽分化的影响：与整体植株的反应一致。2、对于诱导芽的形成随植物分类地位的不同而不同。一般采用16小时的光照8小时的黑暗均适宜。（二）光的波长（光质）光质对诱导愈伤组织或器官再生的影响，虽然依植物种类的不同、外植体不同而表现出极大的差异，但这种差异却完全无规律性可寻。（三）光强度培养的植物材料、植物的形态建成对光强的要求不严格，300-500lux即可。生根和壮苗阶段，宜提高光强到3000lux左右。四、温度（一）最适宜温度因植物种类而异，一般培养温度为25。（二）温度对培养物的影响高温影响控制茎叶的生长的生理系统。昼夜交替的变温培养对菊芋的生根有非常好的影响。（三）不同温度处理1、低温处理对提高花药的出愈率有非常好的效果。4，48-72小时。2、高温处理对植物脱病毒培养有效。37-38，4-6周。五、气体状况（一）氧气的影响植物呼吸需要氧气，应增加培养基中氧气的量。氧气可能对器官发生起调节作用。在氧气缺乏时，利于悬浮培养的胡萝卜细胞形成胚状体。（二）乙烯的影响培养物在生长过程中会产生乙烯，高浓度的乙烯对形态发生是不利因素。选用透气的封口物，利于气体交换。培养基中添加AgNO3，可以抑制乙烯的产生。1-2mg/l。六 、继代培养（一）以顶芽或腋芽增生方式繁殖在继代培养许多代之后，仍然能够保持着形态发生的能力。如月季，利用茎尖培养可以连续继代五年以上仍保持形态发生的能力。（二）细胞培养或愈伤组织培养形态发生的能力在继代培养几代之后常常丧失。（三）形态发生能力丧失的原因1、愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器官中心（分生组织），当重复继代时会逐渐减少甚至丧失。天竺葵。2、形态发生潜力的丧失，可能由于内源生长调节物质的减少，如胡萝卜培养，其内源生长调节物质在离体条件下不再合成，导致形态发生能力的丧失。3、不正常染色体的聚集可能会抑制发育过程，如染色体畸变：易位、缺失、等臂等。（四）培养中发生的变异染色体变异导致不正常植株的频率增加，嵌合体的芽变、新性状的产生。七、基因型分类地位不同的植物，对培养条件的要求有许多差别，往往同一属的不同植物在相同的培养条件下反应却很不一致。分类地位相距甚远的若干种植物，又可能对同一培养基表现适应。基因型反应的原因尚未完全研究清楚。八、季节影响形态建成和污染率。生长期采样再生能力强，休眠期采样再生能力弱，污染率高。第四章-复习思考题1、说明单子叶植物和双子叶植物对植物细胞分裂素和生长素的反应有何异同？2、说明利用组织培养法进行植物快速繁殖时，离体材料对光照和温度的反应与整体植株有何异同？3、什么是酚污染？防止酚污染的措施的有哪些？4、说明快速繁殖的高速度是由那些因素决定的？并写出理论上年增殖率的估算公式。5、如何降低