细菌药物敏感性试验及标准化0ppt课件.ppt

抗生素及抗生素敏感试验 药敏试验的意义 查出耐药 减少治疗错误 便于医生选择个体化疗方案 节省费用进行耐药监测 为医院感染控制部门提供防治依据 为经验用药提供可靠依据 2006细菌数据 xiugai xls利用耐药监测结果控制抗菌药物应用 减少耐药菌株的出现 延长新药使用寿命 为新药的研究和评估提供有价值的信息 药物敏感试验规则 我国主要以临床实验室标准委员会 CLSI NCCLS 2007英文版 M100S17E pdf的规则为规则德国 欧洲标准 根据主要作用靶位的不同 抗菌药物的作用机制可分为 干扰细菌细胞壁的合成 使细菌不能生长 繁殖 损伤细菌细胞膜 破坏其屏障作用 影响细菌细胞蛋白质的合成 使细菌丧失生长 繁殖的物质基础 影响核酸的代谢 阻碍遗传信息的复制 其他 抗生素的作用机制 表1抗菌药物的主要作用部位 抗菌药物品种 1 内酰胺类2 氨基糖甙类3 喹诺酮类4 大环内酯类5 多肽类6 抗真菌类 内酰胺类抗生素包括青霉素类 头孢霉素和不典型的 内酰胺类抗生素 主要抑制粘肽合成的第3步 阻止粘肽链的交叉连接 使细菌无法形成坚韧的细胞壁 第二代头孢菌素的抗菌谱比头孢唑林 cefazolin 等第一代头孢为广 对耐药金葡菌等革兰阳性菌的抗菌作用稍次于第一代 但对革兰阴性菌的作用更强 头孢呋辛 cefuroxime 是第二代头孢中较好的品种 第三代头孢菌素的主要特点是对各种革兰阴性杆菌包括绿脓杆菌的抗菌作用突出 肾毒性低 对 内酰胺酶稳定 头孢噻肟 cefotaxime 对肠杆菌科细菌的作用优于其他第三代品种 对酶稳定 毒性低 但在体内代谢 抗菌作用减弱 严重感染用药量需高 此外 对绿脓作用较差 头孢他啶 ceftazidime 是头孢菌素中对绿脓杆菌作用最优的品种 对不动杆菌属 葡萄糖不发酵革兰阴性杆菌也有一定作用 毒性低 几无肾毒性 对 内酰胺酶稳定 对免疫功能不全者感染具有良好疗效 第四代头孢菌素主要特点抗菌谱广 如头孢吡肟 对肠杆菌科细菌的抗菌活性要强于头孢他啶 对铜绿假单胞菌活性要优于头孢噻肟 但略低于头孢他啶 对革兰阳性球菌 特别是其中的耐青霉素肺炎链球菌的杀菌活性较第三代头孢菌素明显增强 但对厌氧菌和甲氧西林耐药的金葡菌 MRSA 作用仍不理想 非典型 内酰胺类 主要包括头霉素 头孢烯类 碳青霉烯类 单环 内酰胺类和 内酰胺酶抑制剂等 头孢西丁 cefoxitin 并非头孢菌素 实属头霉素类 其抗菌谱与第二代头孢相似 但对包括脆弱类杆菌在内的各种厌氧菌具良好的抗菌活性 毒性低 对酶非常稳定 适用于腹部外科 妇产科 口腔科等的需氧菌与厌氧菌的混合感染 氨曲南 aztreonam 属单环 内酰胺类 其抗菌谱狭窄 对肠杆菌科细菌 气单胞菌属 流感杆菌 淋球菌等具相当强的抗菌作用 但不动杆菌属 产碱杆菌和各种厌氧菌对本品的敏感性差 主要用于严重的革兰阴性菌感染 对伴有粒细胞减少和脓毒症的癌症患者感染也可获良好的疗效 克拉维酸 clavulanicacid 和舒巴坦 sulbactam 他唑巴坦三种 内酰胺类的抑制剂 与青霉素或头孢菌素类联合应用时 可保护 内酰胺类药物不被酶破坏 扩大临床应用适应症 克拉维酸 替卡西林酶抑制剂舒巴坦 头孢哌酮他唑巴坦 哌拉西林 氨苄西林 舒巴坦 unasyn 优力新 主要用于产酶的流感杆菌 淋球菌 卡他布拉汉菌 肠杆菌科细菌 金葡菌 表葡菌 肠球菌属 脆弱类杆菌等感染 该静脉注射与肌注制剂在国内临床应用 取得良好疗效 碳青霉烯类抗生素 亚胺培南 imipenem 抗菌谱极广 抗菌活性甚强 对革兰阴性菌和阳性菌 需氧菌和厌氧菌 以及多重耐药或产 内酰胺酶的细菌皆有良好的抗菌作用 其毒性低 适用于严重的革兰阴性菌感染 混合感染和免疫功能缺陷者感染 亚胺培南的独特结构特异的 反式结构 羟乙基侧链 内酰胺环 此侧链正好遮挡了细菌的 内酰胺酶结合点 细菌产生的多种酶不能与内酰胺环结合 因此不被分解 阿米卡星的抗菌谱与庆大霉素相似 其抗菌活性优于卡那霉素 但次于庆大霉素 其肾毒性与耳蜗及前庭功能损害与庆大霉素无明显差别 氨基糖甙类 奈替米星的抗菌作用与庆大霉素相似 对各种氨基糖甙类钝化酶较稳定 但不如阿米卡星 故耐庆大霉素菌株的作用不如阿米卡星 其耳 肾较庆大霉素为低 主要用于严重的革兰阴性杆菌感染 氟喹诺酮类 抗菌谱广 对革兰阴性杆菌包括绿脓杆菌均具良好抗菌活性 对革兰阳性菌也有一定作用 对临床分类的耐药菌株呈一抗菌活性 口服生物利用度较高 组织分布好 细菌内穿透力强 适用于细胞内感染 第一代 萘啶酸第二代 氧氟沙星 环丙沙星第三代 左氟沙星 帕珠沙星第四代 加替沙星 莫西沙星 氟喹诺酮类主要适应症为 1 泌尿系感染 单纯性 复杂性尿路感染 细菌前列腺炎 淋病等 2 胃肠道感染 菌痢 旅游者腹泻 胃肠炎等 3 耐药菌株所致伤寒及其他沙门菌属感染 4 呼吸系感染 革兰阴性菌支气管及肺部感染 鼻咽部耐甲氧西林金葡菌带菌者 5 革兰阴性杆菌骨髓炎 关节炎 6 革兰阴性杆菌所致其他感染 如皮肤软组织感染 五官与伤口感染等 7 联合用药用于不能耐受万古霉素的耐甲氧西林金葡菌感染 亦用于沙眼衣原体 支原体 耐药结核杆菌和其他分支杆菌感染等胞内感染 临床广泛应用后必然导致耐药性的提高 应引起高度重视 大环内酯类 阿齐霉素 azithromycin 克拉霉素 clarithromycin 抗菌作用不如红霉素 但半衰期较长 每日只需服药2次 除一般革兰阳性菌感染外 可用于支原体 军团菌 衣原体等引起的特殊感染 大环内酯类抗生素 多肽类 万古霉素 去甲万古霉素的抗菌谱与药理特点相似 后者的作用较万古霉素略强 主要对革兰阳性菌有强大抗菌活性 特别耐甲氧西林金葡菌 MRSA 与表葡菌 MRSE 及肠球菌属对本品非常敏感 几无耐药菌株 本品有明显的耳 肾毒性 轻症感染者不宜选用 多肽类抗生素 临床常用稳可信具有独特的作用机制 1 抑制细菌细胞壁的合成 2 损害细菌细胞膜 改变细胞膜通透性 破坏其屏障作用 3 阻碍细菌RNA的合成影响遗传信息的复制 抗真菌药 咪唑类 氟康唑 fluconazole 不仅抗真菌谱广 而且口服吸收迅速而完全 血药浓度高 蛋白结合率低 12 组织分布好 可透过血脑屏障 临床上已用于各种真菌深部感染 包括败血症 脑膜炎等可获良好疗效 达托霉素为脂肽类抗生素 其抗菌谱与万古霉素和替考拉宁相似 但对MRSA有效 主要作用机制是扰乱细胞膜对氨基酸的转运 从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的合成 以及改变细胞膜的性质 为浓度依赖型抗生素 其抗菌作用比万古霉素及替考拉宁高 雷莫拉宁雷莫拉宁 ramoplanin 属于缩酚酞类 depsipeptide 抗生素 对艰难梭菌 耐万古肠球菌 VRE 和MRSA有效 将成为抗耐药菌的有效药物 阳离子多肽与其它抗菌药物相比 其体外抗菌活性几乎无区别 但其对一些耐药菌 如绿脓杆菌 不动杆菌 嗜麦芽窄食单胞菌 MRSA VRE 产ESBLs的大肠菌和多重耐药革兰阴性杆菌的抗菌活性相比 可与目前最好的抗菌药物相媲美 其MIC为1 8 g ml 且耐药菌与敏感菌无区别 恶唑烷酮类抗菌药物20世纪80年代后期 杜邦公司开发了恶唑烷酮类抗菌药物 其后普强公司合成了两个新的化合物 即羟哌恶酮 eperezolid 和吗啉恶酮 linezolid 具有很好的治疗效果 吗啉恶酮于2000年上市 吗啉恶酮和吗啉恶酮对许多革兰阳性菌有抗菌活性 表 5 链阳性素 streptogranin RP59500是一种由两个半合成的链阳性菌素组成 即由链阳性菌素B 喹奴普宁 quinupristim 和链阳性菌素A 达福普宁 dalfopristim 以30 70比例组成的化合物 可治疗各种耐药菌所引起的重症感染 包括MRSA菌血症 肠球菌性菌血症 不良反应少 可作为万古霉素的替代药物 用于治疗不能耐受万古霉素治疗的病人 课间休息 感恩的心 mp3感恩 ppt 细菌药物敏感性试验及其标准化 方法分类 纸片扩散法 耐药监测常用方法 肉汤 宏量和微量 和琼脂稀释法Etest法仪器法 操作方法 原理培养基的制备及注意事项接种物的制备及接种贴药敏纸片孵育判读 纸片扩散法 Kindy Bauer KB法 K B法原理 按说明书配制一定浓度的培养基原液 高压灭菌 冷却至50摄氏度左右调节pH至7 2 7 4 加添加剂 制板 厚度为4mm 水平 冷却至室温使用或储存 注意事项 1 全程无菌操作2 湿度控制3 胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影响4 培养基用水5 质控 操作流程 培养基 Mueller Hinton琼脂培养基 非苛氧菌 HTM培养基 其组成成分如下 M H琼脂粉 15 ml牛羟基血红素 PH7 2 7 4 NCCLS不推荐用M H巧克力培养基作嗜血杆菌药敏试验 嗜血杆菌 GC琼脂 此补充品 1升水中加入1 1gL 胱氨酸 0 03g盐酸鸟嘌呤 3mg盐酸硫胺 13mg对鞍基苯甲酸 0 01g维生素B12 0 1g辅羧酶 0 25gNAD 1 0g腺嘌呤 10gL 谷氨酰胺 100g葡萄糖 和0 2g硝酸铁 是在GC琼脂高压灭菌后加入的 淋病奈瑟菌 5 7 脱纤维羊血的M H琼脂 链球菌 培养基厚度 4mm是影响KB法准确性最重要的因素 接种物的制备 1 直接菌落悬液法多用 广泛2 生长法少用 局限性3 注意事项 嗜血杆菌 淋球菌配制菌悬液必须采用巧克力培养基上的菌落作直接悬浮法 菌液浓度应严格要求0 5麦氏单位 接种物浊度调整好后 最好在15分钟内接种 用无菌棉拭子蘸取调好的菌液 在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次 挤出多余的接种菌液 用棉拭子在无菌的稍干燥的M H琼脂表面划线接种 再重复操作两次 每次将平板转动约60度 保证接种物均匀分布 最后用棉拭子涂抹琼脂的边缘 在加含药的纸片之前 可以将培养皿盖半开3 5分钟 但不超过15分钟 促使表面过多的水分被吸收 试验平板的接种 常规药敏试验的选药原则 基本原则 临床标本不能直接做药敏试验目的 以准确结果回报临床不应在同一平板做混合菌药敏试验与感染无关菌株 定植菌 不做药敏试验判断标准 一菌一药一规则 选择原则应考虑到药物临床疗效 耐药菌株流行情况 预防耐药菌株产生和经济的综合因素 最终目的是达到控制感染 选择抗菌药物进行常规药敏试验时应考虑 所选药物应包含于本单位的处方手册中结合所在医疗机构的类型 规模及病人的构成的情况针对具有不同耐药机制的菌种的最适抗菌药物也不同 恰当限制常规药敏试验中药物的数目 目前应用于临床的抗生素的数目不断增多 大多数实验室不可能将所有的药物均同时进行药敏试验 恰当限制常规药敏试验中药物的数目 抗生素的不合理应用导致新的耐药机制不断被发现 使药物选择更加困难 预测药物 同一类药物中 有很多具有相同或相似的体外活性 其差别主要在药代动力学 毒性等方面 因此很多情况下一种抗菌药可作为其它一种或几种密切相关的药物的代表进行常规药敏试验 常用实验药物及其代表的药物 根据抗生素的作用特点选择抗生素 青霉素类 根据抗生素的作用特点选择抗生素 头孢菌素 一些特殊菌株引起的感染在选药时有特殊的要求例如 沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种第三代头孢菌素的敏感性对与肠球菌属 头孢菌素类 氨基糖甙类 复方新诺明和克林霉素在体外可能有活性 但在临床上耐药 所以不能报告对这些药物敏感 常见耐药菌的筛选药物 药物敏感试验的规则 目前 我国绝大多数临床微生物实验室均参考美国国家临床实验室标准委员会 NCCLS NCCLS 2007英文版 M100S17E pdf出版的对各类细菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南 NCCLS推荐的选药标准 NCCLS推荐的选药标准 序 每个实验室都应决定表中的哪些药物用于常规报告 A组 哪些仅选择性报告 B组 但当临床需要时也应该提供B组常规报告的药敏结果 将事先确定的抗微生物药组合的纸片分贴到接种好菌的琼脂平板表面 每个纸片应与琼脂表面完全接触 并且应均匀分布 使其中心间距不小于24mm 贴完纸片后 应在15分钟内 将平板反转过来 置于35 孵箱中 在接种好的琼脂平板上贴加纸片 注意事项 1 150mm平板所贴纸片不应超过12个 100mm的不应超过5个 嗜血杆菌要求150mm平板贴纸片不应超过9张 100mm平皿贴纸片不应超过4张2 纸片一但接触了琼脂表面 就不应再挪动位置3 除嗜血杆菌 淋球菌 链球菌等外 平板不应在CO2含量高的空气中孵育 因为其解释结果是根据普通空气中的孵育结果研究出的 而CO2会显著改变某些药物的抑菌圈大小 药物选择注意 参考推荐表标志性药物不可少 如 OX STAPH CN120 ENTEROCOCCI纸片顺序可做调整 如 测定E coli和Klebsiellapneumoniae时CAZ CTX纸片贴在含酶抑制剂的纸片如AMC旁边 初步提示是否产ESBLs A 内酰胺类药物纸片应密封包装并冷冻 少量正用的纸片可冷藏 4 8 C 一周 某些不稳定的药物 如亚胺培南 头孢克洛 克拉维酸复合药等 也应冷冻保存直至用的当天 以尽量保持其稳定性 B 平衡至室温后使用防止热空气接触冷纸片时产生冷凝水C 装有纸片的塑胶管从密封包装中取出后应至于密封的干燥容器中 在使用纸片分配器时 应注意干燥剂指示剂颜色的变化 D 过期纸片均应弃去 药敏纸片的保存 孵育16 18小时后 检查每一块平板 如果平板划线满意 接种物准确无误 抑菌圈应为正圆形 菌落应相互融和生长 如果出现明显的单个菌落 则接种量太少 必须重复试验 注意 联合药敏试验葡萄球菌或肠球菌变形杆菌属用加血培养基测试链球时甲氧苄啶和磺胺 判读平板和解释结果 caz amc CTX CAZ AMC CTX 测量工具 游标卡尺 图 普通直尺 KB试验中常见的错误来源 抄录质控数据时的书写错误测量抑菌圈直径的读数错误菌株有污染错误的孵育温度或气体试验用培养基的质量不合格 尤其厚度纸片在试验室取用或贮存的过程中失效 接种菌悬液太浓或太淡判读标准错误 质控的重要意义 监测药敏试验的精密度和准确性监测试验所用试剂质量监测进行试验和判读结果的工作人员的操作是否正规使用ATCC菌种进行质量保证 其目的是训练操作人员如何准确地进行药敏试验并得到可靠的结果 保证每个操作者具有正确进行药敏试验的能力 同时 可用以评价结果的准确性 质控内容 A 关于仪器孵育箱 冰箱 CO2孵育箱 自动化仪器B 关于试剂C 操作方法规范化 质控操作 同日常工作 操作 药敏纸片 培养基等 质控频率 质控菌株大肠埃希菌ATCC25922大肠埃希菌ATCC35218 仅被推荐用于B 内酰胺霉抑制剂复合药 如含克拉维酸 舒巴坦和三唑巴坦的复合药的试验质控 铜绿假单胞菌ATCC27853金黄色葡萄球菌ATCC25923粪肠球菌ATCC29212 可用于监测M H琼脂中药物抑制剂的水平是否低得可以接受 也可用于高含量氨基糖苷类纸片的质控 流感嗜血杆菌ATCC49247 HTM时用 流感嗜血杆菌49766 HTM时用 淋病奈瑟菌ATCC49226 GC琼脂时用 肺炎链球菌ATCC49619 M H羊血琼脂时用 Dilutionsusceptibilitytestbrothdilutiontestagardilutiontest agardilutiontest 抗生素稀释梯度不同抗菌药物对不同的特定细菌所设置的抗菌药物梯度不同 抗生素浓度梯度应包含临床有价值的稀释浓度其最高浓度应高于血液或局部组织液的峰值 最低浓度应低于对照菌的MIC值 321684210 50 25 agardilutiontest 倾注平板将配置好的不同浓度的抗菌药物按预置比例加入已平衡温度 45 55 琼脂液中 使其成为不同浓度梯度测试系列 agardilutiontest 菌悬掖配制将待测菌配制成1 5 108 ml浓度 用多头接种器或加样器在每一浓度梯度的肉汤或琼脂中加入菌悬液使其达最终浓度 琼脂稀释法为104 点 置35 培养18 24小时 观察结果 agardilutiontest 结果的解释最低抑菌浓度 minimalinhibitionconcention MIC 以能抑制细菌生长的抗菌药物的最低浓度MIC90能抑制90 被测细菌的抗生素的浓度 MIC50能抑制50 被测细菌的抗生素的浓度 最低杀菌浓度 MBC 将最低抑菌浓度和低两个梯度培养液转种到琼脂或血平皿 置35 培养18 24小时 观察有无细菌生长 最低抗菌药物浓度不生长细菌的浓度为 结果报告应将MIC值和 解释 标准同时报告给临床医生 如 0 03 ml 敏感 Brothdilutiontest 将抗生素按不同浓度加到肉汤中接种相同量的菌量孵育判读 质控菌株大肠埃希菌ATCC25922大肠埃希菌ATCC35218铜绿假单胞菌ATCC27853金黄色葡萄球菌ATCC29213金黄色葡萄球菌ATCC43300粪肠球菌ATCC29212粪肠球菌ATCC51299流感嗜血杆菌ATCC49247 HTM时用 淋病奈瑟菌ATCC49226 GC琼脂时用 流感嗜血杆菌ATCC49766 HTM时用 链球菌ATCC49629 CAMHB时用 Etest试验 原理步骤 同纸片扩散法 酵母样真菌药敏试验 简介 1 ATB FUNGUS由法国生物梅里埃公司生产销售 药敏试条由16对小孔组成 第一对小孔不含任何抗菌药物 作正常生长的对照孔 另14对小孔含6种抗真菌药物 最后一对小孔为空白 将被测细菌悬浮在蒸馏水或生理盐水中 定量加入到生长培养基 并将其接种到药敏试条中 于30 18 24小时孵育后用肉眼或ATB仪器自动观察生长与否 根据测定孔与对照孔生长程度比较确定待测菌的敏感性 2 Etest依照说明书操作 3 纸片法 几个公司不同 特殊耐药机制的检测 1 了解临床常见菌种天然或固有耐药性 2 发现异常和罕见的细菌耐药表型 3 了解对特殊菌种易引起选择性耐药的抗菌药物 建议临床医生尽可能不用或避免长期使用 4 认识代表性药物在药敏试验中的作用 1 葡萄球菌的耐药机制 金葡菌和路邓葡萄球菌判定标准纸片法 mm 苯唑西林MIC g ml RISRS头孢西丁纸片 19 20 4 2苯唑西林纸片 1011 12 13 4 2 纸片法 mm 苯唑西林MIC g ml RISRS头孢西丁纸片 24 25 0 5 0 25苯唑西林纸片 17 18 0 5 0 25 凝固酶阴性葡萄球菌判定标准 葡萄球菌中用头孢西丁查mecA 介导的耐药性 头孢西丁抑菌圈 mm ResSusc金葡菌 19 20 CoNS 24 25 报告苯唑西林耐药 报告苯唑西林敏感 CLSI NCCLSM100 S15Table2C M2 M7 44 报告 MRS 包括MRSA和凝固酶阴性的葡萄球菌 无论其体外试验的结果敏感与否 应报告对所有的 内酰胺类抗生素耐药 包括头孢菌素和亚胺配南 因为大多数MRS感染者临床上对上述抗生素没有反应 方法VISAVRSA纸片法不能检测抑菌圈内有稀薄的生长微量肉汤稀释法可检测可检测琼脂稀释法可检测可检测E试验 培养24h 可检测可检测自动化鉴定系统结果不满意结果不满意 VISA VRSA检测方法 Inducibleclindamycinresistance erm mediated anotherexample DTest positivereaction 15 26mm PhotoscourtesyofJ JorgensenandK Fiebelkorn DTest negativereaction NOinduction msrA mediatederythromycinresistance 2 PRSP 过筛试验 苯唑青霉素纸片 1 g ml MHA 5 羊血 菌落直接接种 35 5 CO2 20 24hQC SPNATCC49619确定试验 稀释法测定青霉素等的MIC或用E testCAMHB LHB 2 5 v v 菌落直接接种 35 20 24hQC SPNATCC49619 ECOATCC35218 测定 Lac 酶抑制剂 3 肠球菌 PEN AMPR低亲和力PBPs产 内酰胺酶 少数 HLAR氨基糖苷类钝化酶APH 2 AAC 6 VRED 丙氨酸 D 丙氨酸变成D 丙氨酸 D 乳酸 VANA B D 或变成D 丙氨酸 D 丝氨酸 VANC E HLAR和VRE意义 GEN STR HLAR筛选试验R 对作用于细胞壁的抗生素 e g AMP PEN和VAN 无协同作用 S 对作用于细胞壁的抗生素 e g AMP PEN和VAN 有协同敏感作用 VRE筛选试验阳性做MIC确认 并观察动力和色素鉴别菌种 以区分获得性耐药 VanA和VanB 及某些菌种存在的固有的中介 8 16 耐药 VanC 后者在感染控制中的意义与VRE不同 ESBLs extendspectrumlase 的检测 ESBL表型检查程序 NCCLS筛查试验MIC 2 g ml纸片法头孢泊肟头孢泊肟 22mm头孢他啶头孢他啶 22mm氨曲南氨曲南 27mm头孢噻肟头孢噻肟 27mm头孢曲松头孢曲松 25mm 21 NCCLS表型确证试验肉汤稀释法纸片法头孢他啶0 25 128 g ml头孢他啶30 g头孢噻肟0 25 64 g ml头孢噻肟30 g加入4 g克拉维酸加入10 g克拉维酸MIC 3稀释孔抑菌环增大 5mm ESBL表型检查程序