丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响.doc

丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷 短篇论著作者：李明王强杨春欣陈蕾秦万章单位：李明王强陈蕾秦万章(200032 上海医科大学中山医院皮肤科)；杨春欣(中草药制剂室)丹参治疗系统性硬皮病(SSc)有较好的疗效。我们曾观察到丹参可抑制SSc患者皮肤成纤维细胞增殖，降低细胞培养基中可溶性胶原的含量，但引起胶原合成减低的作用机制尚不清楚。我们以SSc患者皮肤成纤维细胞为研究对象，通过观测丹参加入细胞培养基后对该细胞、型前胶原及胶原酶mRNA含量的影响，从胶原基因表达方面对丹参治疗SSc的药理机制进行探讨。一、材料与方法(一)丹参制剂：丹参注射液是上海第一制药厂产品(批号95038，每mL折合丹参生药1.5g)；丹参素购自上海医科大学天然药化教研室；原儿茶醛(3，4-二羟基苯甲醛)系上海试剂一厂产品(批号86-07-01）。制剂配制见参考文献。、型前胶原及胶原酶cDNA探针的制备：所采用的3个质粒分别是含有人型前胶原1链cDNA片段(670bp)的质粒PHCALIU，含人型前胶原1链cDNA片段(705bp)的质粒PHFS3，以及含胶原酶cDNA片段(1.7kb)的质粒PUC19。3种探针的序列、合成、定性在上述文献中有详述。所有质粒都转化在大肠杆菌中，用标准方法扩增，碱裂解法提取质粒，PEG8000纯化质粒DNA，EcoR对3种质粒进行酶切，使之线性化。用地高辛随机寡核苷酸引物合成均一标记的cDNA探针，并检测标记效果。(三)皮肤成纤维细胞培养：在局麻下分别切取1例22岁女性肢端型SSc患者前臂外侧活动性硬化皮损边缘皮肤以及1例整形外科手术取之青年女性前臂外侧皮肤。按LeRoy法进行皮肤成纤维细胞原代培养并传代增殖。实验选用第36代细胞。培养瓶底面积175cm2，待细胞接近融合时，更换培养基，加入丹参药液， 每个浓度重复3瓶。阴性对照组加入DMEM培养基，阳性对照组加入地塞米松使浓度为1g/mL。加药后24h收获细胞。(四)总RNA的提取和斑点杂交：采用TRIZOL制剂(Life Technologies)，按改良胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA。测定RNA含量，估算其纯度。将RNA点样于硝酸纤维素薄膜上，每点含量20g。将薄膜在80烘箱烘干2h后封入塑料袋中，加入预杂交液(High SDS Buffer)，50预杂交1h后改换有探针的杂交液，杂交过夜。第2天取出薄膜，进行洗脱，用Blocking Reagent封闭后，放入含地高辛抗体稀释液中振荡孵育，再洗脱后加入显色液中静置暗处显色，当斑点出现后，适时用TE终止反应。将结果在图像分析仪上进行灰度数字转换。实验数据用t检验进行分析。二、结果(一)丹参对SSc患者皮肤成纤维细胞、型前胶原和胶原酶mRNA表达的影响测定结果：丹参水溶性提取物丹参注射液、丹参素及原儿茶醛作用于SSc患者皮肤成纤维细胞24h后，对该细胞、型前胶原mRNA的表达具有显著抑制作用，对胶原酶mRNA的表达则具有显著促进作用。阳性对照地塞米松(1g/mL)则对该细胞、型前胶原和胶原酶mRNA的表达均具有显著抑制作用。详见表1。表1丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞、型前胶原及胶原酶mRNA表达的影响（s）组别型前胶原mRNA（n=3）型前胶原mRNA（n=3）胶原酶mRNA（n=3）阴性对照107.3016.18489.5032.54304.4024.26地塞米松（1g/mL）4.992.170.890.36101.6012.17丹参注射液5mg/mL13.162.5110.224.212304.1476.352.5mg/mL22.430.5942.995.11820.1063.25丹参素50g/mL8.233.9411.222.79970.3053.1525g/mL11.461.752.151.15554.6034.67原儿茶醛100g/mL12.712.638.033.1106.908.2250g/mL22.994.47369.1026.68522.1055.7725g/mL16.284.36253.6030.251026.3694.25注：表中数值为杂交斑点实际积分吸光度值；丹参制剂与阴性对照比较，P均0.01；丹参制剂与地塞米松比较，P0.01，P0.05(二)丹参对正常人皮肤成纤维细胞、型前胶原和胶原酶mRNA表达的影响测定结果：丹参注射液(5mg/mL)、丹参素(25g/mL)及原儿茶醛(25g/mL)作用于正常人皮肤成纤维细胞24h后，对该细胞、型前胶原mRNA表达具有显著抑制作用，对胶原酶mRNA表达具有显著促进作用。地塞米松的作用与对SSc成纤维细胞的相似。三、讨论本文结果提示丹参治疗SSc的作用机制之一与减低成纤维细胞胶原基因的转录，从而抑制了胶原的合成有关。同时，丹参制剂尚能增加该细胞胶原酶基因的转录，可能使胶原酶合成增加，从而可能促进体内沉积胶原的分解，这可能是丹参治疗SSc的另一作用机制。地塞米松对上述前胶原基因的抑制作用比丹参制剂显著增强，但其对胶原酶基因也有抑制作用则是与丹参制剂的不同之处。故临床上用丹参制剂治疗水肿期和硬化期SSc患者有效，小剂量糖皮质激素合并丹参注射液滴注治疗早期SSc患者，疗效显著。卫生部科研基金资助课题参考文献苏立德, 薛伟, 仇家琴. 中西医结合治疗系统性硬皮病180例临床观察. 中华皮肤科杂志, 1985，18:215-218.李明, 王强, 杨春欣, 等. 丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响. 中华皮肤科杂志, 1998,31:22-24.Makela JK, Raassina M, Virta A, et al. Human pro1() collagen: cDNA sequence for the c-propetide domain. Nucleic Acids Res, 1988,16:349.Sandberg M, Makela JK, Multimaki P, et al. Construction of a human pro1() collagen cDNA clone and localization of type collagen expression in human fetal tissues. Matris, 1989,9:82-91.Brinckerhoff CE, Ruby PL, Austin SD, et al. Molecular cloning of human synovial cell c