链霉素抗性筛选吸水链霉菌高产农用抗生素菌株.doc

链霉素抗性筛选吸水链霉菌高产农用抗生素菌株彭祎 黄永春* 蔡延明 曹仁林（农业部环境保护科研监测所，天津，300191）摘 要：本文从海南土壤中筛选出一株吸水链霉菌.以经过自然分离和2次紫外诱变的S6-7为出发菌株，经过紫外光照射辅以链霉素抗性筛选后，从62株随机挑选的单菌落中初筛出7株较好菌株，经斜面连续传代3次后复筛，发现5株菌株具有较好的正突变，正突变率可达到8.06%，效价最高提高25.11%。关键词：链霉菌, 农用抗生素, 紫外诱变, 链霉素.由于化学农药大量使用导致农产品中农药残留量增加，以及通过食物链传递在人体内逐渐蓄积给人体健康造成的危害，已经引起世界各国的广泛关注。农用抗生素作为一类生物农药，它具有使用剂量低，环境相容性好，选择性强的特点1，因此受到普遍重视。目前已发现的天然抗生素有约三分之二来源于链霉菌2。利用链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系来定向筛选正向突变株，是目前农用抗生素科研领域的研究热点3-4。我们从海南岛土壤中筛选出一株抗生素产生菌，经鉴定为吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)，发现其发酵液中次级代谢产物对多种常见作物病害如白粉病、灰霉病、褐霉病等都具有较好的防治效果，具用良好的农用抗生素应用前景，但此产生菌的原始菌株效价较低，本文在紫外诱变提高菌株产素能力的基础上5，进一步加入链霉素抗性筛选进行复合诱变提高菌株的产素能力。1 材料与方法1.1 菌种以吸水链霉菌海南变种S101菌株经自然分离并经过连续2次紫外诱变后获得的S6-7菌株为出发菌株。指示菌为小麦赤霉菌（本试验室收藏）。1.2 培养基斜面、平板培养基：可溶性淀粉15g；酵母膏4g；K2HPO41g；MgSO47H2O1.5g；复合维生素片：1/4片；葡萄糖2.5g；蛋白胨2.0g；玉米浆：14mL；麦芽膏2.5g，加水至1L，调节pH=6.5。发酵培养基：可溶性淀粉15g；酵母膏4g；K2HPO41g；MgSO47H2O1.5g；复合维生素片：1/4片；葡萄糖2.5g；蛋白胨2.0g；玉米浆：14mL；麦芽膏2.5g，加水至1L，调节pH=6.0。土豆培养基：土豆去皮后切碎，称取400g，放入锅中加入自来水，煮沸1h，经双层纱布过滤后收集土豆汁2000mL，向其中加入葡萄糖40g,琼脂粉40g，分装于三角瓶中，121灭菌20min后备用。1.3 孢子悬液的制备将成熟孢子斜面加入无菌水，洗下孢子，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，于28、200r/min振荡25-30min，使孢子分散活化，经灭菌漏斗过滤，制得单孢子悬液，用血球计数板计数，控制孢子浓度为107个/ml，备用。1.4 紫外诱变吸取15ml上述孢子液于直径9cm的无菌培养皿中，置于小型脱色摇床上控制80r/min， 本研究受中央公益性科研院所基本科研业务费（农业部环境保护科研监测所）专项资助。彭祎，1979生，男，重庆人，硕士，长期从事生物农药方向研究; *为通讯联系人紫外照射（功率30W，距离30cm）60s。照射后立即避光保存，备用。并同时取未经紫外照射的孢子悬液作CK对照。1.5 链霉素致死浓度筛选分别吸取100L经紫外照射的单孢子悬液于添加有不同浓度链霉素的平板培养基上，并用刮铲涂布均匀，28下倒置培养5天。1.6 初筛采用琼脂块抑菌圈法4，对诱变株进行初筛。待单菌落长出后，用直径5mm 的打孔器打孔后，移种于涂布有小麦赤霉菌孢子的土豆培养基上，24倒置培养48h，测量抑菌圈大小。挑选抑菌圈较大的菌落转接于斜面培养基上。待斜面完全被孢子覆盖后，置于4冰箱保存。1.7 复筛采用二级摇瓶复筛法，即将培养好的斜面菌种挖块接种于装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶，28，240r/min振荡培养24h。吸取15ml种子培养液转接入含有80ml发酵培养基的500ml三角瓶中。28，240r/min振荡培养96h。1.8 发酵液效价测定取发酵液0.3ml于经灭菌后的直径9cm培养皿中，向其中加入14.7ml的土豆培养基稀释50倍，混匀。用直径5mm打孔器对生长满赤霉菌丝的土豆培养基打孔，并将菌丝面朝下接种于混有发酵液的培养基上。并同时向未添加发酵液的15ml土豆培养基上接种小麦赤霉菌琼脂块作阴性对照，每个样品重复3次，24倒置培养72h，测量菌斑直径，按如下公式计算抑制率。a=测定直径(mm)-5, b=阴性对照测定直径(mm)- 5,抑制率=（b-a）/b100% 。2. 结果与讨论2.1 紫外线照射剂量与致死率的关系紫外线的照射时间与孢子的致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着照射时间的延长致死率逐渐提高，当照射时间达到60s时，致死率已超过90%，如下图1所示。本试验选用60s作为本试验的诱变剂量。2.2 链霉素对孢子的最小致死浓度测定将经过紫外光照射的孢子悬液分别涂布于含有2g/mL、4g/mL、6g/mL、8g/mL、10g/mL链霉素的培养基平板上。28倒置培养5d后观察，不同平板上的菌落生长情况，记录未长菌落的链霉素最低作用浓度，当培养基中的链霉素浓度达到8g/mL时，平板上未见菌落生长，已经达到完全抑制，此浓度即为链霉素对该菌的最小致死浓度。2.3 链霉素抗性突变株的筛选在进行抗生素抗性筛选过程中一般采用链霉素最小致死浓度6筛选法，但是在本试验过程中发现，当采用此致死浓度时，平板上很难获得再生菌落，故在试验过程中将筛选范围扩大到90%以上致死率链霉素浓度范围内。将经紫外照射的孢子悬液分别涂布于不同浓度即4g/mL、5g/mL、6g/mL、8g/mL的链霉素抗性平板上，28倒置培养10d后共计挑取平板上的62个单菌落以小麦赤霉菌为指示菌 ，采用琼脂块法进行初筛。24条件下培养48h后测量抑菌圈，并以出发菌株作阳性对照菌株，共得到7株正变菌株，结果见表1。表1 链霉素抗性突变株的初筛结果Table1 The screen results of streptomycin resistance strain 编号S6-757819202324抑菌圈直径（mm）8.013.5151317191414链霉素浓度（g/mL）04665555由表1可见，当培养基中添加链霉素浓度为5g/mL时，所得到的正变菌株较多，且抑菌圈直径也较大。说明采用5g/mL的链霉素进行抗性筛选更加适宜。将上述8株初筛菌株在斜面培养基上连续传代3次，并进行摇瓶发酵复筛，对初筛结果进行进一步确证。2.4 高产菌株的复筛结果将在斜面上连续传代3次的菌株进行摇瓶发酵复筛，并以小麦赤霉菌为指示菌株，测定发酵液的效价，并将结果与出发菌株的效价进行对比，结果见表2。表2 链霉素抗性突变株的复筛结果Table2 The screen results of streptomycin resistance strain 编号指示菌S6-757819202324菌斑直径（mm）48.3315.269.1017.3313.005.0242.174.504.17抑制率（%）68.4381.1764.1173.1089.6112.7590.6991.38提高率（%）15.69-6.746.3923.64-436.7124.5525.11注：上表中数据均为三次测定的平均值由表2可见，经复筛发现7号和20号菌株的效价明显低于出发菌株，应视为突变未能有效遗传，24号菌株的提高率较为明显，可达到25.11%。经过两次筛查发现，在挑选的62株菌株中共有5株菌株具有明显的正突变，正突变率为8.06%。在得到的5株较好菌株中，3株提高率最高的菌株均是来自5g/mL诱变浓度。3. 讨论紫外诱变是菌种选育过程中最常用的诱变方法之一，但是此法导致的菌种突变是随机的，正突变株的出现频率很低，需要进行大量的筛选工作。链霉素产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系是目前抗生素科研领域的一个研究热点，通过将链霉素抗性筛选法与传统紫外诱变法结合可快速、有效的获得理想的抗生素高产突变株。在本试验过程中，利用紫外诱变对出发菌株的孢子进行处理后，通过亚致死浓度的链霉素进行定向筛选，不仅使菌株的产素能力有较大提高，而且极大提高了菌种正向突变的筛选效率，同时为解决常规育种手段紫外照射带来的疲劳效应提供了新的思路。参考文献：1. 唐伟,孙军德,张翠霞. 农用抗生素产生菌菌种选育的研究进展.微生物学杂志J, 2004,24(4):42-45.2. Richard H. Baltz. Genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces.Trends in microbiology, 1998,2,76-83.3. 张晓勇,林壁润,高向阳等. 农用抗生素高产菌株的诱变筛选新技术J. 广东农业科学, 2006, 5,80-82.4. Yang D J，Chen G Q，Chen W，et a1Streptomycin resistance mutationstudy on the breeding of hinatamycin producing strainJMicrobiology, 2003,4,29-35.5. 黄永春, 彭祎, 曹仁林. 紫外诱变吸水链霉菌选育高产农用抗生素菌株. 安徽农业科学，待发. 6. 杨东靖, 陈冠群, 王敏等. 纳他霉素高产菌株的链霉素抗性选育及其发酵工艺的优化, 药物生物技术, 2003,2,84-87. Breeding of Agricultural Antibiotic High-producing Streptomyces hygroscopicus Strains by streptomycin Resistant Mutations PENG yi HUANG Yong-chun* Cai Yan-ming CAO Ren-lin ( Agro-Environmental protection and Research Institute of MOA, Tianjin,300191,China)ABSTRACT A Streptomyces hygroscopicus strain with antibiotic producing ability was screened from soil of Hainan province, China. A method of streptomycin resistance screening was applied to improve the antibiotic productivity. The spores treated with UV light were regenerated on agar plate containing different concentration of streptomycin and 62 streptomycin-resistant (str) mutants were obtained. After screened by efficient agar piece culture and shaking flask fermentation method respectively, 5 high-producing strains were obtained. The mutants