重组人促红细胞生成素.doc

临床上EPO不仅用于治疗肾性贫血，而且已经被应贫血的治疗8。尽管输血由于起效快、价格低等有利因素在临床治疗中被广泛应用，但是它也存在诸多潜在危险，如感染、输血反应，严重时甚至引起死亡。而注射EPO则能有效地避免这些输血并发症。1985年，人们运用重组技术9表达了重组人红细胞生成素(rHuEPO)。rHuEPO 生产细胞株CHO2EPO C2重组人红细胞生成素( rHuEPO) 是利用基因工程技术,将人的红细胞生成素基因转入哺乳动物细胞内,高效表达的能刺激红细胞生成的糖蛋白激素,用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗产生的贫血122 1 Oh J H ,Ha H , Yu M R ,et al . Sequential effects of high glucose onmesangial cell TGF21 and fibronectin synthesisJ . Kidney Int ,1998 ,54 :187221878.2 Border WA ,Noble N A. TGF2beta in kidney fibrosis :A target for genetherapyJ . Kidney Int ,1997 ,51 (5) :138821396.重组EPO(rHuEPO)由于EPO在体内的作用巨大而天然来源却十分有限(主要从贫血患者的尿中提取)，人们便开始利用基因重组的分子，它由不同的糖化体构成，各种糖化体的区别主要表现在糖基在整个分子中所占的比例不同，而这个比例也的作用极为相似，它一方面能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量；另一方面能够增强机体对氧的结合、运输和供应能力，有利于在高强度竞技时改善缺氧状态，促进肌肉中氧生成，使肌肉更有力、工作时间更长，从而增强运动能力。长期使用rHuEPO，对运动员来说，可能会带来一时的荣誉，但给其健康带来的却是永久的危量过度增加，当血红蛋白含量超过55时，血液粘滞度就会增高，同时血流也会变慢。加上外界因素如运动脱水、环境压力和不合理医务监督等，当血红蛋白含量升高至65甚至70以上时，血流速度过慢，引起工作肌缺氧，有可能导致静脉微血栓形成，从而引起肺栓塞、中风和死亡。目前市场销售的促红细胞生成索制剂中，虽然厂家及产品名称不同(如益比奥、生血素、利血宝等)，但其结构、功能及代谢规律均非常相似。2002年盐湖城冬奥会后，NESP作为一种新型的rHuEPO类兴奋出现。重组技术生产的rHuEPO是一种酸性糖蛋白，分子量为298士03kDa，于1985年问世并成为注册药物。它来启动子构建成表达载体后，以不同的细胞株有中国仓鼠卵细胞(CH0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)及C127小鼠纤维细3作为受体进行表达，获取rHuEPO，所以rHuEPO的氨基酸序列与正常EPO完全相同，仅糖基部分有微小差别。由此可见，rHuEPO与EPO在结构上的不同是N-端唾液酸含量的差异10。Ca q-Darbepoetin也称新红细胞生成刺激蛋白(novel erythropoiesis stimulating protein，NESP)，其商品名为Aranesp，是一种高糖基化的rHuEPO类似物口1,123。Darbepoetin同样能够促进红细胞的产生，并且其不良反应发生率和死亡率都与rHuEPO相似，但Darbepoetin可能引起的高血压和凝血事件比rHuEPO少。由于它与禁药目录中的EP0有同样的功效，所以同样也属于禁用药物。Darbepoetin含有5个N一糖链和比rHuEPO多的唾液酸残基这两个额外的、包含硅酸的N一多糖链按顺序被放在EP0肽链主干的氨基酸位置上，既不改变蛋白质的结构，也不影响与受体的结合。Darbepoetin的分子量(36804kDa)比rHuEPO大，其糖基含量也由40增加到5213J“。由于糖基含量的增加，它的半衰期(t。2)比rHuEP0延长2倍，体内的药效作用时间更长久。并且，Darbepoetin有较好的代谢稳定性和较长的半衰期，持续时间比10倍剂量的rHuEPO还要长，所以可以延长给药的时间间隔，减少给药次数口“，是临床用药的又一重大突破。检测1990年，LeifWide18,19通过研究发现虽然rHuEPO的氨基酸序列与天然EPO完全相同，但rHuEPO带的电荷与内源性EPO有所不同，这可能是因为糖化度及唾液酸化度略有区别。因此，rHuEPO与内源性EPO(huEPo)的电泳行为会有所差别，这就给凝胶电泳法分离rHuEPo和huEPO带来了可能。2000年，法国国家反兴奋剂实验室的Francoise建立了等电聚焦配合以化学发光为指示剂的免疫印迹法检测外源性EPO的方法。由于rHuEPO带更多的负电荷，所以rHuEP0在等电聚焦电泳中会出现附加的碱性条带，而内源EPO则没有。通过与标准品和内源性EPO条带的对比，就可以进行判定。Lanse实验的具体方法是：聚丙烯酰胺凝胶(7M尿素，5丙烯酰胺，3胶联剂，Icm厚)中加入pH值为24、46的两性电解质11：1加入，使最终浓度为2(wv)形成pH梯度。样品通过上样滤纸片上在凝胶的阴极附近每份样品中包含1(vv)Tween80。首先，没有上样前胶在250V、1mAcm、lWam的条件下预聚焦30min(8)。上样走胶条件为：2000V，lmAcm，1Wcm到4000Vh阳极液为05M磷酸溶液，阴极液为2(wv)的68的两性电解质。电泳完成后，通过半干法转印技术(08mAcm2)将凝胶上的蛋白质转印到PVDF膜上，用25mMTris192mMglycine的溶液作为转印缓冲液。转印完毕后，将膜放在5raMDTTPBS溶液中温浴1h，使EPO分子中的二硫键断裂开。用PBS漂洗膜，再放入5低脂奶粉的PBS溶液中封闭1h，PBS溶液漂洗(33min)，漂洗后将结合在膜上的抗体再次转印到第二张PVDF膜上(0。7醋酸，08mAcm2)，同样用5低脂奶粉的PBS溶液封闭1h，然后加入二抗反应1h。再用05的低脂奶粉的PBS溶液漂洗(33min)，最后将膜放入辣根过氧化物酶中反应1h，用PBS漂洗33min后用化学发光检测仪检测，条带清晰可见(20)。1郭葆玉基因工程药学上海：第二军医大学出版社，2JacohsgenomicerythropoietinNature，1985，313(28)：806810。3卢庄，蔡耘，钱小红肽类兴奋剂检测技术进展中国运动医学杂志，2004，23(5)：5375454LaiR，WangerythropoietinJ5TsudaMMurakamia1ComparativestudyoligosaccharidesurinaryerythropoietinsBiochemistry，1988，27：564663M，TakasakiS，Miyazakia1Comparativestudyasparagine-linkederythropoietinspurified7DavisJM，ArakawaTw，eterythropoietinproducedcellsBiochemistry，1987，26：26338赵长安，李恩红细胞生成素的研究进展中华血液学杂志，1993，14(5)；270271。6 Takeuchi M，Takasaki S，Miyazaki H，et a1Comparativestudy of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant hinese hamster ovary cellsJ Biol Chem，1 988，263：365736637Davis JM，Arakawa T，Strickland Tw，et a1Characterization of recombinant human erythropoietin produced inChinese hamster ovary cellsBiochemistry，1987，26：263326388赵长安，李恩红细胞生成素的研究进展中华血液学杂志，1993，14(5)；2702719PescheleMBiogenesiserythropoietin；pro-erythropoietinkidneyScience，1975，190：91010StonrringPL，TipladyPd，GainesRELectin-bindingerythropoietin：compari-urinaryerythropoietinsEndocrinol，1996，150(3)：40141211NissensonerythropoiesisstimulatingproteinmanagingkidneyKidneyDis。2001，38(6)：1390139712EgneJC，BrowneJKDevelopmenterythropoietinstimulatingprotein(NESP)BrCancer，2001，84(supplement)：31013DwekFM，eta1TargetingglycosylationtherapeuticapproachNatureRevDrugCOY，2002(1)：657514Elllihttherapeuticproteinthroughglycoengi-neeringNatureBiotechnol，2003，21(4)l15MorrealeM，etcomparisonepoetindarbepoetinCIpin，2004，20(3)：38139516李容生，杨江燕，李琦，等正常人及贫血患者红细胞生成素水平的观察中华血液学杂志，1993，14(5)：22717Lasneerythropoietinrine，Nature，2000，405(6787)：63518WideL，BengtssonchargeheterogeneityerythropoietinBr19LeifWide，ChristerBengtsson，BoBerglund，eterythropoietinhealthySports20LaseF，MartinL，Crepinpro-erythropoietin2002，311(2)：119126。红细胞生成素(Erythropoietin , EPO) 是肾脏细胞产生的,调节红系造血,刺激红细胞生成的一种主要调控因子。重组人红细胞生成素( rhEPO) 是利用基因工程技术,将人的EPO 基因转入哺乳动物细胞内,进行高效表达的活性糖蛋白,临床上主要用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症放化疗所致的贫血。其分子骨架是由165 个氨基酸组成的肽链,上具3 个N2连接和1 个O2连接糖基化位点。2001年，市场上又出现了一种新近开发的红细胞生成刺激蛋白(erythropoiesis stimulating protein，NESP)，也称Darbepoietin一(DPO)，它是在促红细胞生成素分子的基础上进一步改造形成的。问题 但仍然还没有从根本上解决问题，仍然没有开发出一种快速准确的方法来代替步骤复杂的尿检法检测人体中的rhEPO。纯化重组人促红细胞生成素( rhEPO) 为一种糖蛋白,相对分子质量(Mr) 约为30 000 39 000, 其主要生理作用是调节红系前体细胞分化为成熟的红细胞,进而维持外周血红细胞的水平, 临床上主要用于治疗肾衰后引起的贫血。80 年代后期, 利用基因重组技术, 在哺乳动物细胞中高水平表达rhEPO 获得成功。关于rhEPO 的纯化方法, 国内外已有很多报道。但目前国内采用Sepharose 4B 作为载体偶联mAb 进行亲和层析纯化rhEPO 尚未见报道。鉴于该方法具有简便、高效的优点, 我们在成功地制备了鼠抗rhEPO mAb 基础上, 探讨了mAb 亲和层析法纯化rhEPO, 同时建立了检测rhEPO 蛋白含量的E