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遗传学实验张文锐 黄丽华 高永翔 编中国科学技术大学生命科学学院实验教学中心 目 录实验一 有丝分裂（Feulgen染色）制片技术 3 实验二 减数分裂制片技术 7附：临时制片与永久制片技术实验三 果蝇的形态、生活周期及饲养 11实验四 果蝇的伴性遗传 16实验五 果蝇的唾腺染色体制片技术 20 实验六 粗糙链孢霉的杂交 23实验七 染色体数目变异 27实验八 染色体结构变异 29实验九 诱变物质的微核测定 33实验十 基因分离的验证 34实验十一 自由组合规律的验证 37实验十二 人类ABO血型检查 40实验十三 人类X染色质的观察 42实验十四 小白鼠骨髓细胞染色体制片技术 45实验十五 小白鼠骨髓细胞染色体显带（带）技术 48实验十六 人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片 51实验十七 人类染色体核型分析 54实验十八 植物染色体组型分析 57实验十九 植物染色体显带技术和带型分析 61实验二十 同功酶遗传标记分析 65实验二十一 荧光原位杂交实验 70附录一：X2 测验表 75实验一 有丝分裂（Feulgen染色）制片技术一、实验目的1、通过本实验的学习，初步掌握植物染色体制片，奠定细胞遗传学研究的基本技术；2、通过对植物根尖细胞的观察，掌握有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化；3、掌握Feulgen染色方法。二、基本原理有丝分裂（mitosis）是植物细胞分裂的主要方式，细胞分裂过程中，核内染色体准确地复制，并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中去，保证了植物细胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中，如根尖组织、茎尖组织、居间分生组织、愈伤组织等，每天都有分裂高锋时间，此时经预处理，固定、解离、染色和涂抹压片等方法，在显微镜下可以观察到处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA反应的组织化学方法。细胞内的DNA(通常位于核及染色体上)在1N HCl 60水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键而使嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得了自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的醛基结合，又出现了呈现红色的醌式结构，从而使DNA分子着色。这一反应是1924年由Feulgen 和Rossonbek 所发现和确定的，已广泛用作鉴别DNA的一种特异性检查方法。三、材料和器材1、 实验材料：蚕豆（Vicia faba, 2n=12）（或其它植物）干种子；洋葱（Allium cepa, 2n=16）根尖。2、实验仪器及用具：水浴锅(60水浴)、显微镜、培养箱、电子天平、酒精灯、100温度计、具塞试管、吸管、滤纸条等。3、药品和试剂：卡诺氏固定液（冰醋酸:无水酒精=1:3）、秋水仙碱（或8羟基喹啉）、无水乙醇、1N HCl、 45%醋酸、0.2%秋水仙素、碱性品红、偏重亚硫酸钠（钾）Schiff试剂的配制 Schiff试剂：即脱色亚硫酸品红。溶解1g碱性品红于200ml 煮沸的重蒸馏水中，轻加摇动。继续煮5分钟使之完全溶解，冷却至50-55时过滤到棕色试剂瓶中，冷却至25时，加入20ml 1N HCl和1-3g偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O3)。摇动使溶解，密闭瓶口置黑暗低温处或冰箱内(4左右)18-24h后检查。溶液呈无色透明或淡黄色即可。如有不同程度的红色，可加入0.5-1g活性炭，激烈震荡1分钟，仍在低温下静止1小时或过夜。然后用粗滤纸迅速过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在0-5可以保存5-6个月。偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O3)与1N HCl反应，放出SO2、 SO2与碱性品红反应生成碱性品红 亚硫酸溶液，呈无色。 漂染液的配制 取10%亚硫酸钠10 ml，加200 ml蒸馏水，再加10 ml1N HCl即可。四、实验方法和步骤1、材料准备（1）、蚕豆根尖：选取新鲜无病斑的蚕豆干种子，经日晒后，放在烧杯内，室温下清水浸泡一昼夜。种子吸水膨胀后， 20左右保湿培养（双层纱布覆盖），待根长12cm时，于上午9:0010:30或下午14:0016:00剪下根尖备用。（2）、洋葱根尖：通过休眠的洋葱鳞茎，经日晒后，置于盛有清水的小烧杯上，根部与水接触，2025光照条件下培养23天，待根长12cm时，于上午9:0011:00剪下根尖备用。2、预处理为获得较多中期分裂相的细胞，且使染色体缩短和分散，可对根尖进行预处理，方法如下（取其一即可）：（1）、0.050.2的秋水仙碱水溶液处理24小时；（2）、0.002M的8羟基喹啉溶液处理34小时；(3)、根尖浸在蒸馏水中于在14低温下处理24小时。3、固定用蒸馏水洗净材料，再用卡诺氏固定液（冰醋酸:无水酒精=1:3）（用量应为材料体积的15倍以上）室温下固定3060分钟。固定的材料如暂不制片，可经90酒精80酒精70酒精（各半小时）浸泡进行转换，最后置于70酒精内放入04冰箱，约可保存半年。如保存时间太长，需重新固定后再用。4、Feulgen染色法(1)、取经预处理并固定好的洋葱根尖，用水洗2-3分钟，放入室温条件下的1N Hcl处理根尖材料2-3分钟。（2）、将根尖换入60预热的HCl，置于恒温水浴中，在600.5的条件下水解8-10分钟。（3）、吸出热HCl，换入室温1N HCl再处理1-2分钟，然后水洗2-3次。（4）、吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，在黑暗条件下染色至少30分钟，也可过夜。（5）、漂染液冲洗三次，每次至少5分钟去、去掉细胞中残存的品红分子。（6）流水冲洗10-15分钟，再用蒸馏水冲洗并放于蒸馏水中待用。（6）、取根尖（紫红色部分）置载玻片上，用镊子夹碎后，加一滴45%醋酸，盖上盖片、压片。 （每组另做未经HCl处理的为对照）5、显微观察：制备好的细胞学片子，置于显微镜上，先用低倍镜（1010）寻找具有分裂相的细胞，再转换到高倍镜（1040）下观察。6、影响孚尔根（Feulgen）反应的主要因素 (1)水解时间和温度： 这是实验的主要关键。水解适当时，染色体着色较深而细胞质不显颜色，水解不足，染色体着色浅淡，细胞质中可能有其他醛基存在而显示扩散的红色。水解过度，则染色体着色不匀，这是由于DNA解聚而产生的游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中，使细胞普遍着色。随着时间的过度，会使水解液中的反应增强，而细胞不能着色。 (2)固定液的成分： 不同成分的固定液常出现不同的颜色反应。含铬酸的固定液产生红色，酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色，只用酒精的呈现紫色，用含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的DNA 定量测量时，一般只能用不含金属离子和甲醛的固定液，如酒精-醋酸固定液等。 (3)SO2含量： Schiff试剂中的SO2含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2含量低时呈红色，含量高时则偏向蓝色。(4)染色质中DNA的含量： 供试材料的染色质中DNA含量的不同是影响显色反应强度的根本因素。不同生物和不同的组织、细胞中DNA含量不同，显色强度也各异，并且二者之间是正相关的。实践证明，具有大、中型染色体的材料，如百合科及部分禾本科植物材料，适于用孚尔根反应，小型染色体的材料特别是玉米、水稻等不适于用孚尔根法染色。五、实验报告1、绘制你所观察到的图象，并说明是有丝分裂的哪一个时期。2、直接固定和经过预处理后固定的材料，其分裂相有何不同？3、经温HCl处理和不经处理的制片有何区别，为什么？实验二 减数分裂制片技术一、实验目的1、 了解植物生殖细胞的形成过程；2、 熟悉减数分裂各时期的特点，加深对减数分裂的认识；3、 掌握植物花粉母细胞的压片技术和方法。二、基本原理减数分裂（meiosis）,又称成熟分裂（maturation division）是在性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊方式的有丝分裂。性母细胞（2n）连续进行两次核分裂（第一次分裂和第二次分裂），形成四个染色体数目减半的配子(n)。经过受精，雌雄配子（n）融合为合子，又恢复了体细胞染色体数目（2n）。确保了亲代与子代间染色体数目的恒定性，从而保证了物种相对的遗传稳定性。在适当的时候采集植物的花蕾制备染色体标本就可在显微镜下观察到植物细胞的减数分裂。整个减数分裂可分为下列各个时期：第一次分裂 前期 减数分裂的特点之一就是前期特别长，而且又较复杂。通常根据细胞核内结构变化特征又将这一期分成五个时期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。细线期（leptotene）：这是减数分裂的开始时期，染色质开始浓缩为细而长的丝状，首尾不分，且细线局部可见到念珠状颗粒，即染色粒。此时，虽然染色体已经复制为二个染色单体，但在显微镜下还看不出结构上的双重性。偶线期(zygotene)：各同源染色体开始配对（pairing），出现联会现象。2n个染色体联会为n对染色体。染色体形态与细线期差别不大。在显微镜下不易与细线期分开，但可根据染色体分散状态及粗细变化判断其是靠近细线期还是趋于偶线期。粗线期（pachytene）：二价体逐渐缩短变粗，同源染色体配对完毕，这种二价体包含了四条染色单体，又称四合体(tetrad)。此时，非姊妹染色单体间出现交换（crossing over）,造成遗传物质的重组。双线期(diplotene)：配对的同源染色体进一步缩短变粗，由于同源染色体间发生过互换，开始分离而出现交叉（chiasmata）现象。此时染色体呈现扭花状。终变期(diakinesis)：由于交叉端化（terminalization），染色体显著收缩变粗，并向核周边移动，在核内较均匀地分散，二价体往往呈X、O、V形态，核膜、核仁才开始消失。此时有利于染色体计数。另外，玉米花粉母细胞在整个前期都具有较明显的核仁，这是前期的一个显著标志，进入中期,核膜、核仁才开始消失。中期 核膜、核仁才消失,各个二价体排列在赤道面上，纺锤体形成。双价体开始分离。此时也是鉴定染色体数目和形态的最好时期。后期 由于纺锤丝的牵引，各个二价体分开，移向两极，每一极得到n条染色体，每一染色体含有两个染色单体。实现了染色体数减半（2n n）。末期 移到二极的染色体，解旋、松散变细，逐渐形成两个子核，核膜重新形成，胞质分裂，成为两个子细胞，称为二分体（dyad）。中间期（interkinesis） 在第二次分裂开始之前，两个子细胞进入间期。但有的植物和大多数动物不经过间期，直接进入第二次分裂。间期的时间短，无DNA复制，故DNA含量没有变化。第二次分裂前期 染色体缩短变粗，开始清晰起来。每个染色体含有一个着丝粒和纵向排列的两条染色单体。前期快结束，染色体变得短粗、清晰可见，核膜消失。中期 染色体排列在赤道面上，两条染色单体开始分裂。此时细胞的染色体数为n，每一染色体有两条染色单体。后期 着丝点分裂为二，两条染色单体由纺锤丝分别拉向两极，每极含有n条染色体。末期 染色体逐渐解旋，核膜重建，核仁重新形成，同时细胞质又分为两部分，各成为两个子细胞。这样，一个花粉母细胞经过两次连续分裂形成四个子细胞，称四分体（tetrad）或四分孢子(tetraspore)。各细胞的核里的染色体只有最初细胞染色体的一半，即从2n减数为n。三、材料和器材1、 实验材料：玉米雄花序（2n = 20）2、 实验仪器及用具：显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片等。3、 药品和试剂：Carnoy固定液（甲醇冰醋酸 = 31）、醋酸洋红、45%醋酸等。四、实验方法和步骤1、 采集玉米不同花期的雄花序用新配制的Carnoy固定液（甲醇冰醋酸 = 31）固定1824小时，经80%和70%酒精各半小时，保存于70%酒精中备用。这样处理的材料可保存使用23年。2、 取经过固定的雄花序，选取长0.5cm左右的小花，用解剖针或镊子挑出花药（每一朵小花有3个花药），置于载玻片上。3、 在花药上滴一滴醋酸洋红，然后用解剖针把每个花药截成几段，尽可能挤出花药中的花粉母细胞。4、 去除花药残渣，适当涂匀玻片，盖上盖玻片，垫一张滤纸，以大拇指均匀按压，注意，不要滑动盖玻片！吸去多余染液即可镜检。若高倍镜观察颜色太深，可在酒精灯火焰上过几遍，微烫，使细胞质透明，增大反差，注意不要拷过度！5、 显微镜下观察，寻找减数分裂各期图象，熟悉各时期特点。五、实验报告1.绘制观察到的典型的减数分裂各期分裂相。2.为什么说减数分裂是经典遗传学的根本？3.简述减数分裂各个时期染色体的特征。附：临时制片与永久制片将做好的比较理想的片子，可以临时封片以保存一段时间，也可制成永久制片，以长期保存。、临时制片：暂时封固良好的片子，可以用解剖针烧熔石蜡密封盖玻片四周，置低温下一般可保存数星期。、永久制片：1、将制好的片子有盖玻片的一面向下浸入95%酒精1：冰醋酸1的混合液中，从盖玻片脱落载玻片时算起1-2分钟。2、轻取载、盖玻片，不使材料丢失并注意其位置，放入95%酒精2：正丁醇1的混合液中1-2分钟。3，移入95%酒精1：正丁醇2的混合液中1-2分钟。4，移入正丁醇中1-2分钟（至少两次）。5，加拿大树胶（或中性树胶）封存。实验三 果蝇的形态、生活周期及饲养一、实验目的1、了解果蝇生活史中各个不同阶段的形态特点；2、区别雌雄果蝇以及几种常见突变类型的主要性状特征；3、掌握实验果蝇的饲养、管理及实验处理方法和技术。二、基本原理 1、果蝇的生活史果蝇属于昆虫纲，双翅目，果蝇属，与家蝇是不同的种。 果蝇的生活周期长短与温度关系很密切。30以上的温度能使果蝇不育和死亡，低温则使它的生活周期延长，同时生活力也降低，果蝇培养的最适温度为20-25。10152025卵幼虫8天5天幼虫成虫57天18天6.3天4.2天 从表中可以看出，25时，从卵到成虫约10天；在25时成虫约活15天。 卵：羽化后的雌蝇一般在12小时后开始交配，两天后才能产卵。卵长0.5mm，为椭圆形，腹面稍扁平，在背面的前断伸出一对触丝，它能使卵附着在食物(或瓶壁)上，不致深陷到食物中去。 幼虫：从卵孵化出来后，经过两次蜕皮，发育成三龄幼虫，此时体长可达4-5mm。肉眼可见其前端稍尖部分为头部，上有一黑色斑点即为口器。口器后面有一对透明的唾液腺，透过体壁可见到一对生殖腺位于躯体后半部上方的两侧，精巢较大，外观上是一明显的黑点，而卵巢则较小，可以此作为鉴别。幼虫活动力强而贪食，它们在培养基上爬行时，留下很多条沟，沟多而且宽时，表明幼虫生长良好。 蛹：幼虫生活7-8天准备化蛹，化蛹前从培养基上爬出，附着在瓶壁上，逐渐形成一梭形的蛹.在蛹前部有两个呼吸孔，后部有尾芽，起初蛹壳颜色淡黄而柔软，以后逐渐硬化，变为深褐色，表明即将羽化了。 成虫：幼虫在蛹壳内完成成虫体型和器官的分化，最后从蛹壳前端爬出。刚从蛹壳里羽化出来的果蝇虫体比较长，翅膀尚未展开，体表尚未完全几丁质化，故呈半透明的乳白色。透过腹部体壁，可以看到黑色的消化系统。不久，变为短粗圆形，双翅展开。体色加深。如野生型初为浅灰色，然后呈灰褐色。2、形态构造头部有一对复眼，三个单眼和一对触角；胸部有三对足，一对翅和一对平衡棒；腹部背面有黑色环纹，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端，全身有许多体毛和刚毛。 雄果蝇 雌果蝇 3、成虫雌雄的鉴别性 状雌果蝇雄果蝇体 型较大较小第一对足跗节无性梳有性梳腹末端钝而圆稍尖腹 片6个4个腹背面条纹5条3条外生殖器简单复杂4、果蝇常见的几种突变形状特征突变形状名称基 因 符 号形 状 特 征所在染色体白眼w复眼白色X棒眼B复眼横条形X檀黑体e体呈乌木色，黑亮IIIR黑体b体呈深色IIL黄身y体呈浅橙黄色X残翅vg翅退化，部分残留不能飞IIR焦刚毛sn刚毛卷曲如烧焦状X小翅m翅较短X5、果蝇的性别决定（1）染色体组成果蝇为二倍体2n8。核内有丝分裂：不涉及细胞分裂和核分裂的染色体分裂方式。体联会：一些特殊的体细胞中（如果蝇唾腺细胞）的染色体经多次复制却不分开，依旧紧密地排列在一起就象减数分裂中的联会现象一样。染色体组：来自二倍体生物的正常配子的所有染色体。连锁群：来自配子中的每条染色体及其携带的基因。雌雄基因平衡理论：对果蝇而言，X染色体上有决定雌性的基因，常染色体上有决定雄性的基因存在，其比值决定果蝇的雌或雄，Y染色体只与育性有关，而与性别无关。 （2）果蝇的性别决定 果蝇的性别决定为XY型，Y染色体在性别决定上不起作用，只与育性有关。含有Y染色体，可产生正常的配子，不含Y染色体，则配子不育。性别决定与性比值（性指数）有关。 X/A=1 则为雌性；X/A=0.5 则为雄性。 X/A1，为超雌；X/A0.5，则为超雄；0.5X/A1则为中间性。 雌雄基因平衡理论：果蝇X染色体上有很多雌性基因，常染色体上有很多雄性基因，Y染色体上很少或没有与性别决定有关的基因，因此性别决定于基因的平衡。（3）果蝇的连锁群 X染色体上有141个基因；第2染色体上有228个基因；第3染色体上有156个基因；第4染色体上有12个基因。（4）同源染色体：来源相同、结构相似、控制的形状相同，在减数分裂中配对的一对染色体。三、材料和器材1、 实验材料：黑腹果蝇。2、实验仪器及用具：双目解剖镜、放大镜、小镊子、麻醉瓶、白瓷板、新毛笔等。3、药品和试剂：果蝇培养基、乙醚等。四、实验方法和步骤1、培养基的配制果蝇培养基的配置(1000ml用量)玉米面红糖（或蔗糖）琼脂干酵母丙酸85g65g8.5g7g5ml水溶琼脂加红糖（或蔗糖）加搅好的玉米面煮沸加水到1000ml冷却50左右加入酵母粉加入丙酸（防腐剂）。配制好的培养基进行高压灭菌，121，20min，待用。2、果蝇培养 将每3-5对雌雄果蝇转入待用培养基中，进行培养，隔天观察其生长情况，视其生长周期。3、果蝇的性状观察对果蝇进行检查时，可用乙醚麻醉，使它保持静止状态。因为果蝇对乙醚很敏感，易麻醉，麻醉的深度看实验的要求而定（作种蝇以轻度麻醉为宜，做观察可深度麻醉，致死也无妨。果蝇翅膀外展45度角表示已死亡）。麻醉的方法是将果蝇转移到干净的三角瓶中，迅速加入滴有适量乙醚的滤纸条，盖上瓶塞，稍等片刻果蝇便麻醉。4、记录观察结果将麻醉后的果蝇倒在白瓷板上检查，分辨雌雄蝇，观察各种突变形状特征。观察完毕，将全部果蝇倒入煤油或酒精瓶中（死蝇盛留器），统一处理。五、实验报告将观察到的果蝇常见突变形状特征填在下表中。+eywBwyvg勺翅缺刻三隐性体 色眼色形翅 形刚 毛实验四 果蝇的伴性遗传一、实验目的1、 正确认识伴性遗传的正、反交的差别，进一步认识伴性遗传的特点。2、 记录杂交结果，掌握统计处理方法。二、基本原理位于性染色体上的基因叫作伴性基因，其遗传方式与位于常染色体上的基因有一定差别，它在亲代与子代之间的传递方式与雌雄性别有关，伴性基因的这种遗传方式称为伴性遗传（sex-linked inheritance）。果蝇的染色体有X和Y两种，雌性是XX，为同配性别；雄性是XY，为异配性别。伴性基因主要位于X染色体上，而Y染色体上没有相应的等位基因，所以这类遗传也叫X连锁遗传。果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，由单基因控制，位于X染色体上，基因之间的关系为红眼对白眼完全显性。当红眼果蝇（）和白眼果蝇（）杂交，F1代中的果蝇均为红眼，F2代中红眼果蝇白眼果蝇=31，但在雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇白眼果蝇=11。当反交时，F1代中的雌果蝇为红眼，雄果蝇却为白眼。F2代中红眼果蝇白眼果蝇=11，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为11。交配方式如下所示，其中设A为正交，则B是A的反交A： 红眼雌白眼雄 B： 白眼雌红眼雄P： X+X+XwY P： XwXwX+Y F1： X+XwX+Y F1： X+XwXwY F2： X+X+ X+Xw X+Y XwY F2： X+Xw XwXw X+Y XwY表型:+ + + w 表型: + w + w 注意：1、常染色体性状遗传的正、反交所得子代、性状相同，而伴性遗传则不同。2、在进行伴性遗传实验时，也有例外个体产生，这是由于两条X不分离造成的（B杂交组合），F1中出现了不应该出现的性白眼，但这种情况极为罕见，约几千个体中有一个。不分离现象如下图所示：三、材料和器材1、 实验材料：黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）品系：野生型（红眼）：X+X+，X+Y突变型（白眼）：XwXw，XwY2、 实验仪器及用具：大试管、麻醉瓶、瓷板、毛笔等。3、 药品和试剂：乙醚、果蝇培养基等。四、实验方法和步骤1、 收集处女蝇：由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子，供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。由于孵化出的幼蝇在12小时内（更可靠是8小时）不交尾，因此必须在这段时间内把、蝇分开培养，所得的蝇即为处女蝇。2、 准备好培养基，按正、反交组合，把已麻醉的红眼、白眼和红眼、白眼分别放入不同试管内进行杂交，每管35对。贴上标签，注明杂交组合、杂交日期、操作者姓名。3、 67天后，见到有F1幼虫出现，即除去亲本果蝇（一定要除干净！）。4、 再过34天，观察F1成蝇的性状（正、反交有什么不同？眼色与性别的关系如何？）。5、 将所出现的F1代、果蝇麻醉后，挑35对换入新的培养基继续饲养（此处无需处女蝇）。两组合后代不能混合，应分别培养。6、 67天后又需除干净F1代亲本果蝇。7、 再过34天，F2代成蝇出现，麻醉后倒出观察眼色和性别，进行统计。8、 每隔12天统计一次，累积67天数据，填入下列表中： F1代类型观察日期正交红眼白眼反交白眼红眼红眼红眼红眼白眼合 计比 例 F2代类型观察日期正交组合F2反交组合F2红眼白眼红眼白眼红眼白眼红眼白眼合 计比 例2测定：2 =（观察值 理论值）2 / 理论值 根据2测定，查2表，n=4-1=3，P0.05=7.815;n=2-1, P0.05=3.841。若所得的2P0.05，可以认为观察值是符合假设的。具体对这个实验来说，所得到的实验结果应该是符合伴性遗传的假设，也就是说眼色的这对性状是由位于性染色体X上的一对等位基因控制的。若所得的2P0.05 ，则说明所得到的结果不符合伴性遗传的结果。五、实验报告1、完成上面的统计表格，并做2测验，解释实验结果。 2、在杂交过程中，当见到有F1幼虫出现时为什么一定要将亲本果蝇去除干净？3、在挑取F1代果蝇进行继续杂交时为什么不需要处女蝇？ 实验五 果蝇唾腺染色体制片技术一、实验目的1、 练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法;2、 观察果蝇唾腺的形态学及遗传学特征；3、 了解体细胞染色体配对现象；二、基本原理本世纪初，D.Kostoff用压片法首先在D.melanogaster果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体唾液腺染色体（salivary gland chromosome）。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。相当于普通染色体的100-150倍，这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约10004000拷贝的染色体丝，合起来达5m宽，400m长，比普通中期相染色体大得多（约100150倍），所以又称多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome）。唾腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为2n=24，其中第、第染色体为中部着丝粒，第和第（X染色体）染色体为端着丝粒。而唾腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一染色中心（chromocenter）,所以在光学显微镜下可见从染色中心伸出6条配对的染色体臂，其中5条为长臂，一条为紧靠染色中心的很短的臂（如图示）。由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹（band）。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系的。从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较分析，而一旦染色体上发生了缺失、重复、倒位、易位等，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。可见唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。 果蝇巨大染色体三、材料和器材1、 实验材料：黑腹果蝇三龄幼虫。2、 实验仪器及用具：显微镜、解剖针、载玻片等。3、 药品和试剂：1%醋酸洋红等。四、实验方法和步骤1、 从培养果蝇的大试管中挑取一发育充足、肥大的三龄幼虫置于事先滴有一滴蒸馏水或生理盐水的载玻片上，如幼虫带有饲料，可先用蒸馏水将其洗净。2、 取两根解剖针，一根压住幼虫的头部，压点尽可能靠近口器处，当头部固定后，用另一根针压住尾短，平稳快速一拉，使口器处断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾腺随之而出。唾腺是一对透明的香蕉状腺体，仔细观察可发现是由一个个较大的唾腺细胞组成。3、 在显微镜的低倍镜下找到唾腺，其周围可能伴有消化道和脂肪体。确定腺体后，仔细剔除杂物，仅让腺体留下。4、 用滤纸将多余的蒸馏水吸去，注意不要碰着腺体，以防被吸走。然后滴上一滴醋酸洋红染液，覆盖染色10分钟。5、 染色后，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余染液，然后放平在桌面，用大拇指向下冲压盖玻片，注意要有一定的力度，且盖玻片与载玻片之间不能滑动。多练习几次，可望获得分散较好的制片。6、 将制好的片子放到显微镜下进行观察。先用低倍镜找到好的染色体图象，再换用高倍镜观察之。五、实验报告1、绘制形态良好、分散适中的果蝇唾腺染色体图象。2、本次实验对实验材料有何要求？为什么？3、通过反复实践，你认为该实验的关键步骤是什么？为什么？你对本次实验有何改进设想？实验六 粗糙链孢霉的杂交一、实验目的通过对链孢霉杂交所产生的子囊孢子的观察，了解分离和交换现象，并进行统计，计算交换值。二、基本原理 粗糙链孢霉(Neurospore crassa )属于真菌类，子囊菌纲，球壳目，脉孢菌属，又称为红色面包霉。 粗糙面包霉的营养体是由单倍性(n=7)的多核菌丝组成的。生殖方式有无性生殖和有性生殖两种。无性生殖是菌丝片段或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体。有性生殖是不同接合型的菌丝产生有性孢子的过程，主要有两种方式：(1)未受精的营养体菌丝上产生灰白色的原子囊果，可以接受另一不同接合型的分生孢子，通过杂交形成合子。(2)不同接合型的菌丝靠在一起，通过核融合产生异核体。两种有性生殖方式形成的二倍性合子都可以经减数分裂形成四个子细胞，每个子细胞又经一次有丝分裂形成8个子细胞，进一步发育形成8个子囊孢子，并以一定顺序排列在子囊中，许多子囊又被包在黑色的子囊果中。若两个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那么经杂交所形成的子囊必定有四个子囊孢子属于一种类型，其它四个子囊孢子属于另一类型。成熟的子囊孢子在适当条件下可发育成菌丝，形成新的一代。它们的子囊孢子的性状的分离比例是严格的1：1，而且有一定的顺序。不同接合型的子囊孢子具有黑色、白色两种类型，在子囊中8个子囊孢子常呈4黑4白的排列方式，因此可在显微镜下直接观察基因的分离现象。当基因发生了互换时，8个子囊孢子又会排列成2黑2白2黑2白或排列成2黑4白2黑或2白4黑2白，因此在显微镜下也可以观察基因的连锁互换现象。粗糙链孢霉的优点：1、野生型的子囊孢子成熟较早，在一定时期呈现黑色，赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较晚，在一定时期呈现灰白色。以上两种接合型的粗糙链孢霉杂交在适当时期可以观察到六种子囊类型。2、子囊孢子排列的顺序固定，可直接观察到基因的交换。3、可以计算基因与着丝粒的距离。4、如果出现A6、a2、A5、a3则表示基因转变。粗糙链孢霉子囊孢子的分离及分析： 1 正常分离 A A A A a a AAAAaaaa 非交换型(M1) a a A a A A a A aaAAAAaa(1、3线交换) 交换型(M2) a a A A A a a A AAaaAAaa(2、3线交换) 交换型(M2) a a 2 异常分离 （全部为减数后分离） A A A 基因转换 A a A AAAAAAaa(6：2) 染色单体转变 a a A A A A ( 5：3 ) a 半染色单体转换 a a a A A A A (3：1：1：3) a 半染色单体转换 a a a 三、材料和器材1、 实验材料：粗糙链孢霉(Neurospore crassa )野生型菌株和Lys缺陷型菌株。2、 实验仪器及用具：显微镜、接种针、载玻片、试管、三角瓶3、 药品和试剂：粗糙链孢霉培养基、5石炭酸等。四、实验方法和步骤1、菌种活化为使菌种生活得更好，先要进行菌种的活化。从冰箱中取出保存的野生型和Lys缺陷型的原种，在无菌条件下分别接种在两支完全培养基试管的斜面上，28温箱培养5-6天左右。直至在试管中长成许多菌丝，并且在菌丝上部有许多分生孢子时表明菌种活化成功。2、杂交取野生型和Lys缺陷型的少许菌丝接种到同一试管的玉米琼脂培养基上，共接两支试管；或者将两种菌丝分别接种到培养皿中“桥”的两侧。在25恒温箱中培养2-3周，直至在菌丝上有子囊果出现，子囊果为棕黑色，用镊子或解剖针触摸时有坚实感。3、观察 （1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。（2）取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），有另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（1015倍）检查，即可见30-40个子橐果。观察子囊中子囊孢子的排列情况。用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，若用盖玻片会破碎。如发现30-40个子囊果象一串香蕉一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入5%石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。五、实验报告1.绘出显微镜下观察到的完整子囊图。 2.计算Lys与着丝粒的距离。 M2/(M1+M2)100%1/2 (必须是完整的子囊；灰色的不算；异常分离的不算)异常分离的百分数异常分离数/( M1+M2+异常分离数)100%附：实验用培养基配方1、基本培养基（又称土豆培养基，供接种野生型菌株）50ml用量。（1） 将土豆洗净削皮，挖去发芽部分，切成黄豆粒大小的碎块，每管放5-6粒。（2）称琼脂1.2克，蔗糖1克，加水到50ml，煮沸溶解。（3）将B分装到A中，每管放3-4ml。（4）做好试管塞，用牛皮纸包好，贴好标签。8磅条件下高压灭菌30分钟。2、补充培养基（供接种Lys缺陷型菌株)在基本培养基中加入少许Lys ，其它同上。3、玉米琼脂培养基（供杂交实验用）将玉米粒在水中浸泡24小时后晾干，每试管放2-3粒，配2%的琼脂放入蒸馏水中煮沸，每试管倒3-4ml，其它方法同基本培养基。实验七 染色体数目变异一、实验目的1、了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其意义； 2、观察植物染色体数目的各种变异及其在有丝分裂过程中的细胞学特征。二、基本原理植物染色体数目一般为二倍体（2n），但是在自然条件下和人工条件下可以诱发染色体数目的变异。染色体数目变异分为整倍性变异和非整倍性变异。整倍性变异有同源多倍体变异和异源多倍体变异。非整倍性变异有单体、缺体、三体、四体等。由于染色体数目的变异可以导致有丝分裂和减数分裂过程出现不正常的细胞学行为以及形态特征的变化。人工诱导多倍体的方法很多。用秋水仙碱诱发多倍体是常用而且是最有效方法。秋水仙碱是从秋水仙（Colchium autumnale. L.）器官和种子的提炼出来的一种植物碱，其化学分子式为C22H25O6N，有剧毒。其作用是阻止分裂细胞形成纺锤丝，使复制了的染色体不能分向两极，细胞也不能分裂成二个细胞，仍处于同一个细胞中，于是每个细胞内的染色体数目发生了加倍。成为多倍性细胞，进一步发育成多倍体植物。多倍体诱变结果鉴定：1、多倍体植物的个别部分如气孔、花器、种子、果实等明显增大，叶片肥厚，植株比二倍体高大，叶表皮组织气孔明显增大。2、多倍体植物在减数分裂时，由于同源染色体联会和分离不正常，导致育性降低。3、经诱变的多倍体植物有丝分裂时，可以染色体数目成倍增加。三、材料和器材1、实验材料：蚕豆（Vicia faba, 2n12）种子；洋葱（Allium cepa, 2n16）鳞茎2、实验仪器及用具：显微镜、培养箱、分析天平、水浴锅、酒精灯、剪刀（或刀片）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸、铅笔、标签纸、胶水3、药品和试剂：秋水仙碱、苏木精、水合三氯乙醛、铁铵矾、酒精、冰醋酸、盐酸、丙酸四、实验方法和步骤1、材料准备取蚕豆干种子或洋葱鳞茎，经浸种催芽后，待根长1厘米左右时，吸干水分，将根部用0.10.2秋水仙碱药液浸没，根尖朝下，20继续催芽生长，一直浸到根尖明显膨大时，（大约3648小时），冲洗干净取下根尖0.5厘米部位，经卡诺氏固定液固定0.51小时，然后70酒精保存。2、解离：（1）取70酒精保存的根尖，冲洗后置入1N的盐酸中，室温处理20分钟，将酸冲洗干净备用。（2）取出经固定的备用根尖，切取具分生组织部分约12毫米，（去除根冠和伸长区细胞）置1NHCl中解离10分钟。然后用蒸馏水洗尽材料上盐酸，准备制片和染色3、染色制片取一枚经解离的蚕豆根尖，置载玻片正当中，两片载玻片呈十字形对压，然后揭开，在有材料的部位各滴上一小滴丙酸铁矾苏木精染色，再用盖玻片压片。4、镜检观察有丝分裂中期和早后期细胞，并进行染色体计数。五、实验报告1、交染色体数目变异的有丝分裂制片一张，2、绘制观察的染色体数目变异的形态并说明。实验八 染色体结