蛋白质的分离纯化.doc

蛋白质的分离纯化一、沉淀法沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。二、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。三、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。四、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。五、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物（S）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E-S）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把固相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加人抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。六、聚焦层析聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。1、PH梯度溶液的形成在离子交换层析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子交换剂进行层析时，制备pH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室中装高pH溶液，而在另一室装低pH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故pH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH69的梯度。聚焦层析柱中的pH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的pH梯度也就消失了。2、蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的pH值。当柱中的pH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境pH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。3、聚焦效应蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。若在此蛋白质样品被洗出前，再加人第二份同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个作品的缓慢迁移处）。然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出。事实上，在聚焦层析过程中，一种样品分次加人时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可再加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成，得到的结果也是满意的。七、气相色谱多种组分的混合样品进人色谱仪的气化室气化后呈气态。当载气流入时，气化的物质被带人色谱柱内，在固定相和流动相中不断地进行分配在理想状态下，溶质于气-液两相间的分配可用分配系数Kg描述。当分配系数小时，溶质在柱中就停留时间短，也即滞留因子（Rf）大，所以它将首先从色谱柱流出而进人鉴定器，经放大系统放大后，输出讯号便在记录仪中自动记录下来，这时呈现的图形为色谱图，亦称色谱峰；当分配系数大时，溶质在柱中停留时间就长，其色谱图在记录仪上后出现。由于不同物质有不同的分配系数，所以将一混合样品通过气-液色谱柱时，其所含组分就可得到分离。气相色谱柱效率高、分辨率强的重要原因是，理论塔板数（N）大。毛细管气相色谱的N可达1056。增加理论塔板数和降低样品组分的不同分子在展层中扩展程度（速率理论），就可明显地提高柱效。以下将讨论塔板理论和速率理论对柱效的影响：1、塔板理论塔板理论是将色谱假设为一个蒸馏塔，塔内存在许多块塔板，样品各组分在每块塔板的液相和气相间进行分配，在柱内塔板间高度H（即理论塔板高度）一定时，在有效范围内，柱子越长，N也就越大，样品各组分分配次数也就越多，分辨率自然提高；若柱长一定时，塔板理论高度H越小，就越能增加样品各组分的分配次数，进而提高其分辨率。因此 N=L/H 在线性分配和忽略塔板间纵向扩散的条件下，根据样品组分的保留时间tr、峰宽W或半峰高宽度2Xi，Martin导出了计算N的公式，样品组分峰宽度值越小，理论塔板数越高。实际上，进行色谱分析时，峰宽度值的大小是衡量分辨率高低的一个尺度。2、速率理论根据塔板理论，在H（塔板理论高度）一定时，增加柱长可以提高柱效。但是，柱子过长，将会延长分析时间，降低检测的灵敏度。所以实践中应设法降低H，提高柱效。速率理论主要是分析同一样品的不同分子，在色谱柱中迁移速度差异所引起色谱峰的扩张程度。而涡流扩散、纵向分子扩散和质量传递（包括流动相传质和固定相传质）等因子与速率理论值（H）的密切关系可用下面的公式表示：H=A+B/U+C涡流扩散（A）是由于样品组分随着流动相的移动通过固定相颗粒不均匀的色谱柱时，引起同一组分的不同分子在流动相中形成不规则的涡流，致使色谱峰变宽、柱效降低。如固定相颗粒均匀、直径小时，则可降低涡流现象发生。纵向扩散（B/U）亦称分子扩散项。纵向扩散与样品分子在色谱柱中的流畅程度（有无阻碍）、流动相的速度（U）等因子有关。因此，降低溶质在流动相中扩散系数和缩短溶质在流动相中停留时间，均可降低纵向扩散。传质阻力（C）：溶质分子在气相与气液界面进行交换所受的阻力，以及在进入固定相液膜传递的差异性统称传质阻力。传质阻力分别与固定相颗粒直径的平方和固定相液膜厚度成正比关系。八、高效液相色谱高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。1、进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样器完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。2、输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.474.4107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。3、分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为1050cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为25mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为510m粒度的固定相（由基质和固定液构成）。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基团基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基团（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。4、检测系统高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。（1）紫外检测器该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10?g/ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。（2）示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统