细胞转染与筛选.doc

细胞转染与筛选方法总结细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2105个细胞，加2ml/孔完全培养基培养过夜，弃去培养基，PBS洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。将3l FUGENE HD加入94l空白OPTI-MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2g，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。六小时后，将细胞培养基换成DMEM完全培养基。细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况，48h后加入G418，其终浓度为1000g/ml。放入细胞培养箱 继续培养，每两天换液，重新加入G418。待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500g/ml，继续培养2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培养2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培养基继续培养，继而进行其他指标的检测。细胞转染操作方法转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。一、细胞传代1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。二、细胞转染1. 转染试剂的准备 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 震荡后将试剂放在20摄氏度保存，使用前还需震荡。2. 选择合适的混合比例(1：11：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。3. 将混合液在室温放置1015分钟。4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养2448小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。脂质体介导DNA转染法脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-1-2，3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1:1(w/w)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从15g和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(224小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。一、操作步骤方法一：1. 取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含12105 个液，37CO2 培养至40%60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。2. 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10g DNA，终量100L，B液：用不含血清培养基稀释2-50gLR，终量100L，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。3. 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。4. 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37温箱置624小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。5. 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。二、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二：1. 以5105 细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到5060%板底面积。2. 在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。室温下放置510分钟，使DNA结合在脂质体上。3. 弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37培养35小时。4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养1424小时，5. 吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养2448小时。6. 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。四、稳定的脂质体转染方法如下：1. 接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。2. DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前2、3步骤。3. 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37培养48小时。4. 吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞筛选法进行。细胞筛选每种细胞的G418筛选浓度是不一样的，因