表皮干细胞的体外培养及其应用.doc

大鼠表皮干细胞的分离培养及其应用表皮干细胞是来源于胚胎外胚层皮肤组织的专能干细胞，主要分布于表皮基底层和毛囊隆突部，形态学上具有未分化细胞的特征，在生物学方面是皮肤及其附属器发生、修复、改建的源泉。在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。它不仅在体内平衡和创伤修复中起关键作用，而且是基因治疗的主要靶标1-2。因此，成功地分离、培养表皮干细胞对医学临床上创伤修复、皮肤癌的研究也起着至关重要的作用3-5。在表皮干细胞的研究当中，国内外学者主要以人或小鼠为研究对象6-8，而对大鼠的研究较少。本文则对以大鼠为研究对象，探讨表皮干细胞体外分离培养和鉴定方法的综诉，以期为进一步向表皮干细胞内转染基因的研究奠定基础。1表皮干细胞的一般特性1.1表皮干细胞的表达 表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布存在差异，头皮的毛囊隆突部及包皮和阴囊的皮肤基底层存在较多表皮干细胞，背部及四肢近端外侧皮肤基底层表皮干细胞相应地多于胸部及四肢近端内侧。1.2表皮干细胞的结构 表皮由外向内分别由角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层组成;其中基底层又称为生发层，由单层柱状上皮组成，呈栅状排列于基膜带上，邻接真皮。根据细胞动力学分析，在表皮中有三种细胞：干细胞、短暂扩充细胞和终分化细胞，只有干细胞在体外培养能形成完全克隆1.3表皮干细胞的生物学特性 具有未分化细胞的特征，表皮干细胞还具有:细胞体积小，核质比大，胞内细胞器稀少，细胞内RNA含量低等未分化细胞的特征。其两个显著生物学特性：慢周期，细胞分裂缓慢，以便细胞的DNA发生最少的突变及能有充分的时间进行自我修复自我更新，增值潜能强，离体培养呈克隆样生长。 2表皮干细胞分离培养2.1表皮干细胞的制备2.1.1组织块法制备细胞 无菌采取新生SD大鼠背部皮肤，用含高浓度双抗的无钙镁PBS充分清洗后，用眼科镊轻轻剥除真皮上的脂肪组织。将获得的表皮组织切割成0.2cm0.2cm的小块，基地面朝下贴于35mm培养皿。待表皮与皿底贴附紧密而未干时滴加少量培养液（M199+200mL/L FBS+5Mg/mL insulin+0.5Mg/mL氢化可的松，下文中所提及的培养液均为此培养液）浸润组织块，置于体积分数为5%的CO2培养箱37摄氏度，饱和湿度中培养24 h后，添加培养液至正常培养用量，隔天换液。待组织块周围细胞长至直径1cm2cm时，消化传代。2.1.2酶消化法制备细胞 无菌采取新生SD大鼠背部皮肤，用含高浓度双抗的无钙镁PBS充分清洗后，切割为0.3cm1.0cm的长条形皮肤组织。将这些条形皮肤组织以2.0IU/mL中性蛋白酶在4摄氏度浸泡12h16h，PBS冲洗，轻轻撕取表皮，剪碎呈穈状，以2.5g/L胰酶+0.2g/L EDTA消化液在37摄氏度消化5min10min，用含血清的培养液中和并充分吹打，100目滤纸过滤，1000r/min离心5min，弃上清，以培养液重悬，接种于100mg/L型胶原预铺的35 mm培养皿中，37摄氏度培养箱卵育20min后，吸取培养液转移至其他培养皿中继续培养作对照，在原培养皿中加入新的培养液后继续培养。2.2表皮干细胞分离纯化及传代培养消化法制备细胞时待细胞生长至70%的融合率时便可消化传代。组织块法制备细胞时待组织块周围细胞长至1cm2cm时，便可消化传代。2.2.1室温消化 将培养皿内的培养液弃去后，用无钙镁PBS冲洗3遍，向培养皿内加入400mL消化液（2.5g/L胰酶+0.2g/LEDTA）消化约1min后，将消化液弃去，然后再向培养皿内加入400mL的消化液，消化5min后用等体积的培养液中和，吹打均匀，1000r/min离心10min，弃上清，用1mL的培养液吹打均匀后接种型胶原预铺的培养皿内中，将培养皿放入CO2培养箱中静置20min后，轻轻吸取未贴壁细胞转移至其他皿，并向原皿中添加培养液，放入CO2培养箱中培养，隔天换液。2.2.2冷消化 将培养皿内的培养液弃去后，用无钙镁PBS冲洗3遍，向培养皿内加入400mL消化液消化约1min后，将消化液弃去，然后再向培养皿内加入400mL的消化液，置于4条件下消化。将培养皿从4摄氏度中取出之后用等体积的培养液中和，其他方法同室温消化法。2.3 表皮干细胞的鉴定 从形态学上观察，表皮干细胞体积较小，形态较圆，核质比大，能够形成克隆。使用免疫细胞化学法鉴定。2.4 ESCs单细胞克隆与克隆形成率的测定 将1代3代的快速粘附细胞及未粘附细胞分别用培养基稀释成克隆密度（1个细胞/5mL溶液），按每孔100个细胞（0.5mL溶液）接种在铺有明胶的3.5cm六孔塑料培养板中，培养基培养，7天9天后固定，姬姆萨染色，解剖镜下计克隆数。2.5 表皮干细胞生长曲线的测定 细胞生长达到60%70%融合时，2.5g/L胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种在24孔板，接种密度10000/孔，每天取出3个孔计数，算出平均值，根据计数结果绘制生长曲线。3结果3.1大鼠表皮干细胞的分离培养 组织块法制备表皮干细胞时，3天4天后从组织块边缘长出上皮样细胞，7天12天后细胞呈铺路石样生长，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈集落样生长。培养至20天，形成许多100个200个细胞的大克隆；酶消化法制备表皮干细胞时，4天5天后细胞呈铺路石样生长，培养至12天15天，形成克隆，但是死细胞较多，可能是酶在消化过程中对细胞有损伤作用。 3.2表皮干细胞的纯化及传代室温消化时因酶的活力较强，消化时间很难把握，一般室温消化时所用时间为5min，传代后第1次换液时有较多的死细胞，换液2次3次后细胞生长良好。在4时，最佳消化时间为5h6h。3.3大鼠表皮干细胞的鉴定在培养的表皮干细胞中有CK15、-integrin、P63、-ntegrin阳性表达。3.4大鼠表皮干细胞的克隆形成率 将1代3代的快速粘附细胞及未粘附细胞分别用培养基稀释成克隆密度（1个细胞/5mL溶液），按每孔100个细胞（0.5mL溶液）接种在铺有明胶的3.5cm六孔塑料培养板中，培养基培养，7天9天后固定，姬姆萨染色，解剖镜下计克隆数。经SAS分析软件分析比较，两种细胞的克隆形成率有极显著差异（p0.01）(表1)。3.5大鼠表皮干细胞的生长曲线经四型胶原筛选得到的粘附表皮干细胞开始增殖缓慢，第7天开始进入增殖期，增殖期较长，第12天达到高峰；而未粘附细胞很快进入增殖期，第7天达到高峰，然后进入平台期。4讨论 以SD大鼠背部皮肤为材料，分别采用组织块法和酶消化法制备大鼠表皮干细胞。采用新生1日龄10日龄SD大鼠为材料，结果显示，2日龄4日龄大鼠背部皮肤制备的表皮干细胞生长较好，这与大多数文献报道一致9-10。还比较了组织块与酶消化法制备表皮干细胞的效果，结果发现两种方法都可以获得较好的结果，只不过采用组织块法所需时间长，组织块法培养时会从组织块周围脱出成纤维细胞，不利于表皮干细胞的纯化，但是组织块法制备的表皮干细胞活性较好，能持续传至6代。而酶消化法可以迅速获得大量细胞，且细胞较纯，但是细胞活性较差，传至3代4代便分化。在分离纯化及传代时，消化液为2.5g/L+0.2g/L EDTA，在室温下消化3min5 min，若延长消化时间，细胞活性较差。在4消化传代时5h6h为最佳消化时间，时间太短细胞不能充分离散，时间太长则细胞活力减小。目前，表皮干细胞的分选主要有两种方法：利用表皮干细胞对型胶原的快速粘附能力进行筛选11；利用流式细胞仪或免疫磁珠进行筛选12。前者方法简单易行，但分选的精度相对较低，后者分选的精度较高，阳性率大，操作有难度，且成本较高，在国内很难推广应用。 5表皮干细胞的应用前景干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织为目的。干细胞疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。因为干细胞是一种未分化未成熟的细胞，其细胞表面的抗原表达很微弱，患者自身的免疫系统对这种未分化细胞的识别能力很低，无法判断它们的属性，从而避免了器官移植引起的免疫排斥反应及过敏反应等，使同种异体移植神经干细胞变得非常安全。但作为一个新技术，表皮干细胞仍有以下几个关键问题需要解决，更是干细胞研究人员所亟待解决的：细胞纯度低难以建立体外高纯度高活力的细胞库等问题。尽管目前的研究离治疗各种疾病还有一段距离，但干细胞技术是生物技术领域最具有发展前景和后劲的前沿技术，其已成为世界高新技术的新亮点，势将导致一场医学和生物学革命。表1 大鼠表皮干细胞的克隆形成率 克隆形成率/%组别第1代第2代第3代粘附细胞50.471.7147.300.7940.300.82未粘附细胞20.771.3116.731.1910.871.16参考文献：1 Watt F M.Epidermal stem cells as targets for gene transferrJ. Hum Gene Ther,2000,l:22612266.2 PerezLosada J,Balmain A.Stemcell hierarchy in skin cancerJ.Nat Rev Cancer,2003.3:434443.F3 Morasso M I,TomicCanic M.Epidermal stem cells:the cradleof epidermal determination,differentiation and wound healing.J Biol Cell,2005,97(3):173183.4 Fuchs E,Raghavan S.Getting under the skin of epidermal morpbogenesisJ.Nat Rev Genet,2002,3:1 99209.5 Hu K K.Dai Y C,Hu Q H,et a1.An experimental study on therepair of full skin loss of nude mice with composite graft of epidermal stem cellsJ.Burns,2006,32:416-422.6 张喜梅，郭筠秋，金连弘。胎鼠表皮干细胞的体外分离培养及rAAV2eGFP转染的研究J。解剖学报，2007。38(5)：610613。7 Lin Yi,LI H B,Huang J T,at a1Implantation study on the potential of murine epidermal stem cell dIfferentiationJChineseJ Pathophysiol,2006,22(12):241824238 孙晓艳，付小兵，孙同柱。表皮干细胞的分离培养和鉴定J。中华实验外科杂志，2007，24(z)：163165。9 韩雅婷，杨学义，徐小明，等。表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定初报J。西北农林科技大学学报；自然科学版，2005，33(8)：l-6。10 陈伟，杨恬，连小华大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养J。第三军医大学学报，2007，29(5)：376379。11 Bickenbach J R,Chism ESelectio