芽孢杆菌分离筛选与培养.doc

芽孢杆菌分离筛选与培养枯草芽饱杆菌是芽饱杆菌属的模式种，很少成链，通常为0.70.8m2.03.0m，营养细胞杆状，杆端钝圆，单生或成短链，能运动，革兰氏染色一致呈阳性，芽孢中生或偏生，芽孢呈椭圆或长简形。无荚膜，周生或侧生鞭毛，游离孢子表面着色弱，菌落形态变化较大，粗糙，表面干燥，不透明，灰白色或微带黄色，扩散（蔓延）生长。斜面丰厚粗糙，不透明，蜡质蔓延，奶油色至微褐色。在液体培养基表面形成银白色较厚的具皱纹的菌膜。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色，菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化。当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱，生长温度最高为4555，最适为37。枯草芽孢杆菌生理生化特性：液化明胶 冻化牛乳 还原硝酸盐 不产生吲哚，硫化氢 V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧。 地衣芽孢杆菌孢囊不膨大，无伴孢晶体，中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。革兰氏液染色呈紫色阳性菌。细胞大小一般在0.91.22.23.8微米。菌落呈灰白色、边缘不整齐的扁平菌落。1.样品：外购菌种 商品微生物制剂（固体或液体） 土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草（记录取样位置 PH 植被情况等）。 2.菌种分离与纯化2.1培养基2.1.1可溶性淀粉3g/L 蛋白胨10g/L 酵母膏3g/L KH2PO41.5g/L K2HPO42g/LMgSO4 0.1g/L PH 7.47.6 （富集用）2.1.2 肉汤（NA）培养基（营养琼脂）：蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl5g/L PH7.27.4（保存计数或分离纯化用）营养琼脂：麦芽汁培养基=1：1混合使用，菌落不易扩散，形态特征典型2.1.3蛋白胨 10g/L 酵母膏 5g/L 葡萄糖3.5g/L NaCl5g/L K2HPO4 0.5g/L MgSO4 3g/L MnSO4 25mg/L PH 7.27.4（分离纯化用）2.1.4产淀粉酶菌株筛选培养基：可溶性淀粉3-5g/L 蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl 5g/L PH7.27.4（用于淀粉酶产生菌分离筛选）2.1.5产蛋白酶菌株筛选培养基2.1.5.1酪素培养基：2.1.5.1.1葡萄糖1g/L，酵母膏1g/L，酪素4-5g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L 蒸馏水1000ml， pH7.0-7.2。另：葡萄糖0.5g/L，酪素10g/L，NaCl 5g/L K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，琼脂20g/L pH7.2-7.42.1.5.1.2牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L 酪素10g/L NaCl 4-5g/L PH7.27.4先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解（10-15min），补足1000mL蒸馏水，加入其他成分，调PH分装灭菌。2.1.5.1.3酵母膏0.05g/L 酪素4g/L KH2PO4 0.36g/L Na2HPO4 1.1g/L MgSO4 0.5g/L NaCl 0.16g/L FeSO4 0.002g/L CaCl2 0.002g/L ZnCl2 0.014g/L pH6.5-7.04酪素母液制备：4g酪素溶解于0.1N的30-35mL的氢氧化钠溶液中，水浴溶解20min，溶解完毕后加入60-70热水定溶到100mL.200mL培养基加20mL.2.1.5.2脱脂奶培养基：牛肉膏3g/L（酵母浸粉5g/L） 蛋白胨10g/L NaCl5g/L 脱脂奶粉10-12g/L，PH7.2（用于蛋白酶产生菌的筛选）将脱脂奶（粉）加水溶解制成10溶液，于115加热灭菌20-30min，与牛膏蛋白胨固体培养基1：9混合均匀倒平板。2.1.6纤维素产生菌培养基：CMC-Na2g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏5g/L NaCl5g/L PH7.2-7.4 （用于纤维素产生菌的筛选）2.1.7促芽胞形成培养基：土壤浸出液1000mL 蛋白胨5g/L 牛肉膏6g/L PH7.27.4蛋白胨 1g/L 酵母膏0.7g/L 葡萄糖1g/L (NH4)2SO40.2g/L MgSO40.2g/L K2HPO4 1g/L PH7.27.4 （分离纯化用）产芽孢培养基：蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl5g/L .玉米粉0.5g/L 酵母膏0.1g/L PH7.27.4 2.1.8产蛋白酶发酵培养基： 玉米粉30g/L 豆饼粉20g/L 麸皮10g/L 磷酸二氢钠4g 磷酸二氢钾0.3g/L 碳酸钠1.0g/L PH7.47.6 八层纱布塞，牛皮纸扎好。2.1.9产淀粉酶发酵培养基：玉米粉40g/L 豆饼粉20g/L 蛋白胨5g/L 硫酸铵4g/L 磷酸二氢钠8g/L 磷酸二氢钾3g/L PH7.47.6 八层纱布塞，牛皮纸扎好。产酶培养基（蛋白淀粉酶）：蛋白胨10g/L 酵母膏5g/L 葡萄糖1g/L 可溶性淀粉5g/L 磷酸二氢钾2g/L MgSO4 0.5g/L CaCl2 0.2g/L PH7.0-7.4 2.2分离纯化（或复壮）2.2.1冻干管的活化及菌种复壮 ：活化：用无菌吸管吸取0.5mL无菌水滴入安管中，轻荡使干菌体溶解成菌悬液，做梯度稀释后取0.1-0.2mL涂布或直接划线于肉汤（麦芽汁）培养基平皿，或转接于斜面（活化）37 24-36h。复壮：挑取选择生长快，菌落大的菌落于4.5mL无菌水试管中，振荡摇匀后置于80水浴加热15-20min，梯度稀释后涂布于促芽胞形成培养基平皿或蘸取菌悬液直接划线，37 24h。反复二至三次，选取平皿上菌落大而且生长快的菌落转接于斜面37 18-20h，4冰箱保存。2.2.2商品微生物制剂中菌种选育1g（1mL）商品制剂加入99mL无菌（生理盐）水/250mL三角瓶（带玻璃珠），置于摇床振荡20-30min，80-85水浴加热15-20min，进行梯度稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，根据活菌含量选取两至三个梯度进行混菌或涂布35-37 24 h，挑取一环生长快，菌落大的不同典型菌落分别转接5mL无菌水试管中，混合器混合5-10min，做成菌悬液梯度稀释后混菌或涂布，或直接蘸取菌悬液直接划线，37 18-20h。结合镜检直到菌落大小基本一致，转接于斜面37 18-20h，于4冰箱保存。或将梯度菌液1mL加入平板，然后分别注入淀粉和酪素培养基中，30-37 24-48h，挑取D/d大的（淀粉培养基加碘液，观察透明圈）转接于斜面备用或用划线法进行纯化。并通过染色镜检观察，从菌落形态和细胞形态进行鉴别。 2.2.3自然筛选2.2.3.1富集培养：取5g底泥或肠道内溶物0.5g，加入45（50）mL无菌水/250mL三角瓶（带玻珠）中，振荡15-20min，取5mL菌悬液或5mL水样加入45mL促芽培养基/250mL三角瓶中，75-80水浴15-20min，降至35-37 150-200r/min振荡24h，染色镜检，连续两至三次培养备用。或取1g底泥（土）置于20mL肉汤培养基/250mL三角瓶，八层纱布封口，75-80水浴处理15-20min，然后150-200r/min振荡24h。镜检形成芽孢情况，挑取具有芽孢的菌落进行划线纯化培养，获得单菌落。2.2.3.2分离纯化取富集菌液置于75-80水浴15-20min，梯度稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，选择三个合适的梯度混菌或涂布于营养琼脂麦芽汁培养基或直接涂布于酪素培养基上初筛，也可划线分离（划线法先将平板置于30（24-48 h）或37（18-24h），无菌检查，表面冷凝水干燥）。每个梯度二个平皿，将平板倒置，于35-37 24-48h。对长出的单菌落进行编号，选择生长快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面备。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色判断是否为芽孢杆菌。2.2.3.3菌种筛选：蛋白酶产生菌株筛选：操作程序：样品溶解稀释热处理（75-80）-梯度稀释平板涂布培养单菌落编号（转接斜面）-镜检（涂片芽孢染色）-初筛（点接酪素平板）复筛（接产酶培养基培养，离心取清液蛋白酶活力测定）-转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥 粗糙 不透明，作为目标菌。 以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于酪素平板，35-37 24-48h，菌落周围出现透明圈，挑取C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。产蛋白酶发酵培养基35-37 振荡培养24-48h，发酵过滤或离心，取清液检测蛋白酶活力进行复筛。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶的活力有很大差异，有的活力大于4000U/ml。C/H大菌落，其蛋白酶不一定大，因此，对初筛C/H大菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活测定进行复筛。 淀粉酶产生菌株筛选：样品溶解稀释热处理（75-80）-梯度稀释平板涂布培养单菌落编号（转接斜面）-镜检（涂片芽孢染色）-初筛（点接淀粉平板-滴加碘液）复筛（接产酶培养基培养，离心取清液淀粉酶活力测定）-转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥 粗糙 不透明，作为目标菌。以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于淀粉平板，35-37 24-48h，取0.02mol/l碘液或卢戈氏碘液滴加在淀粉平板中菌落周围，观察形成透明圈的结果，挑取C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。接入产淀粉酶发酵培养基35-37 振荡培养48h，发酵过滤或离心，取清液检测淀粉酶和糖化酶活力进行复筛。菌种鉴定：染色显微镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。菌落扁平，圆形或近圆形，表面粗糙，乳白色。镜检菌体杆状，单个或链状，革兰氏染色阳性，芽孢圆形或柱型，中生或近中生。菌株的糖醇利用，产酸产气，生长温度，酸碱度PH，耐盐试验（7），溶菌酶抗性，V-P试验，M-R试验，接触酶反应，吲哚反应，明胶液化，淀粉水解，硝酸盐还原，对氧需求（厌氧生长），柠檬酸盐利用，酪素水解，尿素利用等。常见的稀释方法：培养皿稀释法：5-6个无菌培养皿，分别滴一滴无菌水或生理盐水，接种环蘸取菌悬液与第一培养皿无菌水混合，在与第二培养皿无菌水混合，依次第三四五六，在各培养皿注入45-50培养基12-15mL混匀，倒置培养，在四五六得到单菌落。平板稀释法： 取平板4-5个（干燥无冷凝水），在第一平板滴一小滴稀释菌悬液，无菌涂棒涂布，然后用此涂棒在另一平板涂布至4-5。倒置培养，在四五六得到单菌落。试管稀释法（常用法）芽孢杆菌一般生理生化试验项目：试验项目 1 2 标准菌（枯草芽孢杆菌）革兰氏染色 + + + 糖发酵试验氧需求（厌氧生长）+ + + 葡萄糖 + + +（产酸不产气）酪蛋白水解 + + + 果糖 + + +淀粉水解 + + + 蔗糖 + + +（产酸不产气）明胶水解 + + + 麦芽糖 + + +硝酸盐还原 + + + 乳糖 + + +柠檬酸盐或丙酸盐试验 + + + 木糖 + + +动力试验 + + + 甘露醇或山梨醇 + + +石蕊牛奶还原 + + + 渗透压试验V-P试验 + + + 无盐胨水 + + +M-R试验 - - - 7氯化钠 + + +PH5.7 + + + 10氯化钠 + + +接触酶 - - - 尿素利用 - - - 3.种子培养3.1.培养基3.1.1蛋白胨 10g/L 酵母膏 5 g/L NaCl 0.5g/L 葡萄糖 2g/L K2HPO4 1g/L MnSO4 0.5g/L FeSO4 0.02g/L (NH4)2SO4 0.1g/L PH 7.27.43.1.2蛋白胨 10g/L 酵母膏 5g/L 葡萄糖 30g/L K2HPO4 4.5g/L(NH4)2SO4 2.5 g/L CaCO3 2g/L PH 7.07.23.1.3蛋白胨 5g/L 酵母膏 1g/L 牛肉膏3g/L 葡萄糖5g/L MgSO4 0.5g/L MnSO4 0.005g/L PH 7.07.23.1.4淀粉10-30 g/L 酵母膏 5-10g/L 蛋白胨 10g/L 牛肉膏 5g/L3.2.种子培养3.2.1液体培养斜面活化350mL/250mL三角瓶180-200r/min35-37 18-20h芽孢率90%以上104.5L/10L血清瓶35-37 18-20 h接种量5% 200r/min种子罐 0.6T/T 35-37 18-20 h，1-2h静止培养 3h后连续搅拌至终止7350mL/1000mL 三角瓶35-37 18-20h接种量5%（火焰下接入）180-200r/min3.2.2固体培养培养基a.麸皮 75% 花生麸15% 玉米粉 5% 豆粕 5% (NH4)2SO4 0.5% MgSO4 0.05 % PH 7.0-7.2b.麸皮 80% 稻壳 10% 玉米粉 5% 豆粕 5% MgSO4 0.05% MnSO4 0.01% PH 7.0-7.2c.麸皮 80-90% 细糠5-15% 葡萄糖 2-5% 膨润土1-5% K2HPO4 1-3% d生物素0.01-0.1% PH 7.0-7.2 （专利）斜面活化35-37 18-20h30-50mL/500mL三角瓶1-2环菌苔或菌悬液 37 （30）18-20 h30g/500mL三角瓶 37（30）料水比1：1.2-1.3接种量2%-3%（V/M）M为水料和,静止培养。 6-8h 15-20h 30-36h 发酵周期40-48h拍打三次帘子曲重视划帘控制品温堆积1-2h上帘料层厚度2-3cm 接种量0.3-0.5%37 （30）38-40 h固体培养 4.发酵床（罐）培养4.1培养基4.1.1固体培养基 （同种子）4.1.2液体发酵培养基A.玉米淀粉 3g/L 豆饼粉6g/L 蛋白胨 3.5g/L 尿素 3g/L 葡萄糖 5g/L MgSO4 1.5g/L MnSO4 1.0g/L KH2PO4 3g/L PH 7.0-7.4B.玉米淀粉 8g/L 豆饼粉 25g/L 葡萄糖 10g/L MgSO4 5g/L MnSO4 31mg/L NaH2PO4 0.5g/L Na2HPO4 2.3g/L PH 7.2-7.4C.玉米粉 10g/L 玉米浆 1.5g/L 豆饼粉 20 g/L 尿素1g/L K2HPO4 3g/L KH2PO4 1.5g/L MgSO4 1g/L MnSO4 0.2g/L PH 7.2-7.4 消泡剂（植物油）3g/LD.糖蜜20% 味精废液2-3% 玉米浆1.0% KH2PO4 2g/L PH 7.2-7.4 4.2固体发酵床培养4.2.1发酵床结构： 长度：5.5-8.0m 宽度：1.5-2.5m 高度：0.5-0.6m4.2.2生产操作：10生产条件：料水比：1：1.2-1.3 PH7.0-7.2蒸料时间：60-90min接种量：帘子曲 0.3-0.5% 液体种子 3-5%（V/M）发酵温度：351（不超过37）20 发酵管理：a.料菌均匀后 堆积1-2 h 上床摊平， 厚度30-35cmb.温度控制：6-8 h 间断通风 控制品温37以下 10-12 h以后连续通风 20 h左右第一次翻曲，温度37以下 28 h视品温.结块情况二次翻曲，温度保持在35-37c.定时镜检：芽孢达到80%以上停止发酵革兰染色 显微镜观察。山东宝来利来：当料温降至40-50接种，接种量10%（液体），均匀后进行发酵，整个发酵分二个阶段：第一阶段（1-22h）：1-10h静止期，10h后间断通风控制温度在37，20h左右第一次翻曲。第二阶段（23-40h）：28-30h第二次翻曲，控制温度在37，直至发酵结束。发酵期间定时镜检，当芽孢率达到80%以上停止发酵，60低温烘干。4.3发酵罐培养4.3.1发酵条件： 接种量：5-10% PH：7.0-7.2 装料量：60-70% 温度：30-35 种龄：18-20 h（发酵周期22-24h） 定时搅拌：1-8 h间隔2 h搅拌一次每次10-15min 9-16 h连续搅拌（通无菌空气） 17-22 h间隔2 h搅拌一次每次10min4.3.2发酵过程检测：投料后4小时开始，每隔2小时取样检测一次（OD .PH） 达到如下指标放罐：芽孢含量：70% 杂菌污染：3% 含菌量：30亿cfu/mL4.3.3发酵菌液处理： a.菌液分离：离心 、喷射、板框过滤，以离心分离为好。 b.载入载体： 植物性：麸皮 、淀粉、黄粉。 矿物性：沸石粉、麦饭石 、草炭 、轻质碳酸钙。 光合细菌：载体=1：4， 酵母菌：载体=1：3-4，芽孢杆菌：载体=1：5-6.5.芽孢杆菌保存：枯草芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 纳豆芽孢杆菌 短小芽孢杆菌 短短芽孢杆菌等。培养基：肉膏蛋白胨（保存培养基要求有机氮多，稍含或不含糖）短期保存：5.1.斜面保存法：枯草杆菌斜面透明粘稠，似流体。地衣芽孢斜面结合较紧密，不易挑起。4-6 3-6月转接一次。液体石蜡保存法：斜面和高层半固体柱4-6 1-2年转接一次。不适合肠细菌属 葡萄球菌 乳杆菌属。适合实验室长期保存。5.2.甘油保存法：-20或-70冰箱保存，2-3年转接一次。5.3.冻干保存法：4-6 保存10-15年。5.4.沙土管保存法：4-6 保存10-15年。附：1.吸附剂对微生物生存活性影响1.1载体：草炭 有机质含量49%， PH：6.5 颗粒60目. 麸皮 小麦麸皮， 颗粒60目. 轻质碳酸钙 水分6% 颗粒100目 沸石粉 含有多种营养物质 水分10% 颗粒80目1.2菌种：蜡祥芽孢杆菌 酵母菌各1500 mL 培养24 h，菌数10亿cfu/mL，1.3试验结果 a.吸附剂对蜡祥芽孢杆菌的影响吸附存放7天和15天时，各处理间有效菌数变化不明显，30天草炭和轻质碳酸钙相差1亿。90天 草炭 、麸皮、轻质碳酸钙和沸石粉存活率76% 67% 44% 57%，说明草炭对蜡祥芽孢杆菌的影响较小，轻质碳酸钙90天就有50%微生物死亡。b.吸附剂对酵母菌的影响吸附存放7天轻质碳酸钙菌数死亡率66%，30天 草炭 、麸皮、轻质碳酸钙和沸石粉存活率20% 62% 5% 29% 说明麸皮对酵母菌的影响较小。c.不同固液比对蜡祥芽孢杆菌 酵母菌有效活菌数的影响固液比1:2 1:4 1：6 1：8 蜡祥芽孢杆菌处理七天，出现不同的菌数变化，1:2菌数上升，30天降到初始基础菌以下，60天存活率46%. 1:4 1：6 1：8 60天存活率68% 66% 65%。酵母菌处理七天 1:2菌数上升，60天降到初始基础菌以下，1:4 1：6 1：8 60天存活率62% 67% 58%，从水分角度考虑固液比应控制在1:4以上。 2.包包曲中五株枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定1.培养基：营养琼脂：蛋白胨10g/L 牛肉膏3g/L 氯化钠5g/L PH7.0-7.2产蛋白酶筛选培养基：脱脂奶粉12g/L 营养琼脂20g/L PH7.2 产淀粉酶筛选培养基：可溶性淀粉5g/L 氯化钠5g/L PH7.2产纤维素酶筛选培养基：羧甲基纤维素鈉2g/L 蛋白胨10g/L 酵母膏5g/L 氯化钠10g/L， PH7.22.菌株的分离纯化：无菌条件下，取包包曲1.0g加入盛有99ml无菌水三角瓶中，先静置10-15min，然后置摇床振荡20-30min，取10ml菌悬液于无菌试管中，80保持15-20min，杀死非芽孢菌体，取1.0ml处理液梯度稀释至10-6，涂布或混菌，37培养24h，挑单菌落革兰氏染色，芽孢染色，镜检观察。选取有芽孢的阳性菌，传代2-3次达到稳定，转接于斜面保存。菌株分离纯化结果：菌株 菌落形态 革兰氏染色 芽孢情况 1 乳白，边缘不规则 + 近中生 表面粗糙，无隆起 2 其他同上 隆起 + 中生 3 亮红色 其他同1 + 中生 4 浅褐色，边缘整齐 + 端生 表面光滑 5 浅褐色，边缘不规则 + 近中生表面光滑 较干燥，仍粘壁3.菌种的筛选：3.1菌株产蛋白酶活力比较和筛选：挑选单菌落点接于牛奶或酪素培养基，37培养2-3d，用产生透明圈表示酶活力。菌株号： 1 2 3 4 5透明圈大小（mm）：15.2 10.5 9.8 14.2 13.5透明圈大小排序：1 4 5 2 3 3.2菌株产淀粉酶活力比较和筛选 点种 37培养2-3d，滴加碘液显色。菌株号： 1 2 3 4 5透明圈大小（mm）：11.0 10.5 9.0 7.0 5.2透明圈大小排序：1 2 3 4 5 3.3菌株产纤维素酶活力比较和筛选 点种 37培养2-5d，滴加刚果红显色，再用1mol/l氢氧化钠脱色。菌株号： 1 2 3 4 5透明圈大小（mm）：7.9 6.5 - 4.1 8.1透明圈大小排序：5 1 2 4 3 由上所知：1 4 5三株具有分解酪素淀粉纤维素能力，3只能分解酪素和淀粉，部分菌株具有较高单一消化酶活力。4目标菌株的鉴定：4.1形态鉴定：将菌株1接种在营养琼脂培养基上，37培养24h观察。菌落形态：菌落近似圆形，表面光滑，不干燥，粘壁，菌落中间颜色较边缘深，边缘不规则，乳白色表面色暗，不透明。菌体形态：革兰氏阳性，短杆状，以成对或链状排列，运动，芽孢近中生，接近枯草芽孢杆菌。4.2生理生化特征：目的菌株与枯草芽孢杆菌生理生化比较：菌种特征 枯草芽孢杆菌 1 2 3 4 5运动性： + + + + + +厌氧生长： - - - - 微生长 -v.p反应： + + + + + +v.p中的PH： 5.0-8.0 5.9-8.0 6.5-8.0 3.8-7.3 5.0-7.5 5.0-8.0过氧化氢酶： + + + + + +最高生长温度： 45-55 55-60 50-55 45-50 55-60 55-60最低生长温度： 5-20 10-15 10-15 20-25 5-15 10-20卵磷脂酶： - - - - - -抗溶菌酶： b - b - - bPH5.7营养肉汤： + + - + + +PH6.8营养肉汤： + + + + + +7氯化钠： + + - + + +10葡萄糖： + + - + - -产酸：葡萄糖 + + + + + +阿拉伯糖 + + + + + +木糖 + + + + + +甘露糖 + + + + + +水解：淀粉 + + + + + +明胶 + + + + + +酪素 + + + + + +酪氨酸 - - - - - -还原硝酸盐 + + + + + +利用柠檬酸 + + + + + +形成吲哚 - - - - - -利用丙酸盐 - - - - - -从生理生化性能与枯草芽孢杆菌相似，初步判定五株菌株都为枯草芽孢杆菌。3.商品纳豆产品中高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛选与鉴定1材料与方法：1.1分离材料：超市购买的北京 大连 日本三产地的纳豆产品。1.2模式菌株：N1型纳豆芽孢杆菌，中国农科院提供。1.3培养基；营养琼脂:酵母粉5g/L 大豆蛋白胨10g/L NaCl 5g/L PH7.0-7.2.酪素蛋白平板：酵母粉5g/L 酪蛋白10g/L NaCl 5g/L PH7.0-7.2.种子培养基：蔗糖10g/L 大豆蛋白胨10g/L 氯化钠5g/L PH：7.0-7.2发酵培养基：葡萄糖10g/L 蔗糖10g/L 大豆蛋白胨20g/L K2HPO4 4.0g/L KH2PO4 2g/L MnSO40.5g/L CaCl2 0.2g/L PH7.0-7.2.1.4样品液的制备：无菌条件下，分别称取三种产品各1.0g加入99mL/150m三角瓶无菌水中，置于摇床振荡20-30min，吸取上清菌液4保存使用。1.5菌株分离和初筛：三种样品液在80水浴15-20min以杀灭营养菌体和杂菌，待温度降至40以下进行梯度稀释，取适当的稀释度（10-7、10-8、10-9，）0.1mL涂布于酪素蛋白平板上，37倒置培养24h，计数（用营养琼脂）或各选择10株透明圈直径和菌落直径菌落大小排列，从中各选取三株，按照进行连续划线培养至纯（结合镜检）。将纯化菌株转接于营养琼脂斜面保存备用。结果：芽孢杆菌计数分别北京107 大连109 日本1081.6菌株鉴定：1.6.1菌落形态鉴定：营养琼脂培养24h 菌落形态（圆形） 大小 干湿（粘性） 颜色（白色） 边缘（不整齐） 表面（干燥 起皱） （不）透明，N1型纳豆芽孢杆菌比较。初筛的9株菌落形态相同，与N1型纳豆芽孢杆菌一致，均为圆形 干燥边缘不整齐成裂叶状 表面皱褶 不透明 有粘性白色或灰白色菌落，中间颜色深于边缘部分，斜面菌落呈树状。1.6.2菌体形态鉴定：培养16h菌体进行染色，革兰染色情况 形态 大小 排列方式与N1型纳豆芽孢杆菌比较。菌体形态与N1型相似，染色为兰紫色，短杆状，两端钝圆，大小2.0-4.5微米。芽孢椭圆形，中生或次中生。归属于芽孢杆菌属。由于培养16h时菌体处于稳定生长期镜检部分菌体呈链状排列。1.6.3生理生化特征：需氧性 V-P试验 过氧化氢酶反应 淀粉水解反应 明胶水解反应 酪素水解反应 糖发酵试验和耐盐性试验等，与N1型纳豆芽孢杆菌比较。九株芽孢菌生理生化与N1型比较菌种特征 N1型 1 2 3 4 5 6 7 8 9 枯草运动性： + + + + + + - + + + 厌氧生长： - - + - - - + - - + -v.p反应： + + + + + + + + + + +M-R试验 - - - - - - - - - - -尿素利用 - - - - - - - - - - -过氧化氢酶 ：+ + + + + + + + + + +酪素水解： + + + + + + + + + + +淀粉水解： + + + + + + - + + - +明胶水解： + + + + + + + + + + +葡萄糖发酵： + + + + + + + + + + + （产酸不产气）蔗糖发酵 + + + + + + + + + + +甘露糖 + + + + + + + + + + PH5.7 + + + + + + + + + - 7氯化钠： + + - + + + - + + + 10氯化钠： - - - - - - - - - - 2-5氯化钠：+ + + + + + + + + + 硝酸盐还原 + + + + + + + + + + + 柠檬酸盐试验 + + + + + + + + + + + 1.7菌株复筛：1.7.1粗酶液制备：初筛菌株接种于种子培养基，37 180r/min 16h,得种子悬液，以2%接种量接入发酵培养基中，相同条件下培养24h,将菌液10000r.min离心10min除去菌体，收集上清液-80保存备用。1.7.2蛋白酶活力的测定：按国标执行1.7.3传代稳定性测定：将复筛的纳豆芽孢杆菌接种到斜面，24h传一代，连传十代，测定不同代数菌株48小时发酵液中蛋白酶的活性，绘出曲线确定菌株传代的稳定性。4.芽孢杆菌属菌株筛选及相关研究（南海所）4.1培养基：对虾饲料2g/L（研成末）4.2实验菌株：养殖池塘中分离150株菌株，淡水鱼塘分离到50株菌株。4.3菌株筛选：4.3.1初筛：斜面使用前活化，分别划线于平板，28-30培养48h,大部分菌株不长或生长缓慢，其中56株生长旺盛，作为二筛菌株。4.3.2二筛：接种于液体培养基上，28-30培养48h，80水浴5min，检测观察大部分菌株死亡，有10株存活。4.3.3三筛：将10株存活菌划线于平板，观察8株生长旺盛，挑取进行芽孢染色，发现均为芽孢杆菌菌株。将8株进行保存，进行酶活 降解有机物能力 致病性测定。4.3.4 8株芽孢菌淀粉酶 蛋白酶活力测定（平板透明圈大小）：淀粉酶活力：观察淀粉培养基（肉汤蛋白胨加0.2可溶性淀粉）上菌落透明圈大小排列。 一般1.0-4.0厘米。蛋白酶活力：观察在酪素培养基上菌落透明圈大小排列。 一般1.0-4.0通过对两种平板透明圈的比较，其中四株具有较高淀粉酶和蛋白酶活力，作为进一步研究的菌株。还有一株淀粉酶活力较弱，蛋白酶活力较强。可与其他菌株搭配使用，故对5株菌株进行研究，作为降解有机物的实验菌株。5.产蛋白酶枯草芽孢的复壮及初步研究5.1培养基：分离培养基：营养琼脂筛选培养基：牛肉膏3g/L 酪素10g/LNaCl5g/L PH7.2-7.4.种子培养基：蛋白胨10g/L 牛肉膏5g/L NaCl 5g/L PH7.2-7.4.发酵培养基：豆饼粉3 玉米粉3 麸皮2.5 K2HPO4 0.5g/L Na2HPO4 4g/L5.2菌株筛选：初筛：依据水解圈的大小，选择平板D/d较大的菌株，该菌株具有较强繁殖能力和分解酪素能力。复筛：挑取菌株划线分离至纯培养，然后摇瓶复筛。斜面30培养48h后，接种于100mL/500mL三角瓶中，30 180r/min 18h,在按2接种量接种于发酵培养基上，30 180r/min 24h.取发酵液4000 r/min离心得菌株粗酶液，测酶活力，由1392u/ml提高到1756u/ml。复壮后菌株生长速度、繁殖能力和代谢能力均有不同提高。液体摇瓶培养生长曲线：液体菌种按2接种于牛蛋液体培养基中（100 mL/500mL）30 180r/min培养，定时取样测定OD600值，该菌株6h达到对数期，18h达到稳定期，24h达到衰退期。发酵罐培养：50L发酵罐培养，2接种量 30 18h前通风量240/Lmin.m3 18-24h通风量改为300Lmin.m3有利于产酶进行，粗酶液酶活力9411u/ml.6.产淀粉酶芽孢杆菌高产菌株的筛选6.1选育菌株：枯草6株 地衣1株 蜡样2株 凝结1株6.2培养基：淀粉培养基：可溶性淀粉10g/L蛋白胨10g/L 牛肉膏5g/L NaCl 5g/L葡萄糖5g/L 琼脂8g/L PH7.2-7.4.种子培养基：可溶性淀粉5g/L 蛋白胨10g/L 牛肉膏5g/L NaCl 5g/L PH7.2-7.4发酵培养基：豆饼粉1.5 玉米粉2 NaCl 2.5g/L K2HPO4 2g/L Na2HPO4 2g/L MgSO4 0.2g/L 柠檬酸钠2.0g/L 硫酸铵0.75g/L 氯化钙0.2 g/L PH 7.2-7.46.3菌株筛选：初筛：菌种活化：接种于营养肉汤培养基，37 12h，菌液点接于淀粉培养基培养2-3天，革氏碘液染色，菌落周围透明圈。用游标卡尺测量圈的直径菌落直径，决定酶活力的高低。复筛：制备粗酶液：活化菌株接种于种子培养基中，37 12h，然后以5接种量接种发酵培养基中，37 160r/min 48h，发酵24h后补加0.02碳酸钙，4000 r/min 离心20min得上清液为菌株粗酶液，测酶活力。注：虽透明圈大小反映酶浓度的高低，但不完全代表菌株产酶能力。原因多样固体液体培养条件不同，菌苔大小及在平板上堆积情况的差异，不同菌株具有不同生长和产酶速度及淀粉酶酶系等。故液体复筛必不可少。7.高产淀粉酶蛋白酶枯草芽孢杆菌筛选及鉴定7.1菌株来源：科研部门提供和从水体中分离纯化筛选几株菌株。7.2培养基：种子培养基：蛋白胨10g/L 酵母膏5g/L 葡萄糖1.0g/L K2HPO4 3g/L PH 7.2产酶培养基：蛋白胨10g/L 酵母膏5g/L 葡萄糖1.0g/L 可溶性淀粉5g/L K2HPO4 2.0g/L MgSO4 0.5g/L 氯化钙 0.2g/L PH 7.2 6.3粗酶液制备：各菌种接种于60mL/250mL种子培养基活化后，接种于产酶液体培养基，30 120r/min 20h，4000 r/min 离心15-20min，取上清液于4冰箱保存备用。8.土壤中淀粉酶产生菌的筛选及其发酵条件研究8.1培养基和试剂8.1.1淀粉培养基：分离筛选用 8.1.2检测试剂（路戈氏碘液）碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。配制方法：先用少量（35mL）蒸馏水溶解碘化钾，再加入碘片，待碘片完全溶解后，加水稀释至300mL，于棕色瓶内备用。8.2菌株分离与筛选初筛实验中，以菌落周围形成水解圈直径的大小作为淀粉酶活力的初步判定的依据，水解圈大的，淀粉酶的活力就大。 菌种分离：初筛：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。取10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取0.1 mL 悬液，均匀涂布于淀粉培养基平板上，于30-37培养36-48h，根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。同时，将检测试剂（路戈氏碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记住其编号，以便进行复筛。共得到52株淀粉酶生产菌，其水解圈直径从0.5mm到27mm,其中活性较强的细菌有6株。将这6株菌进行复筛，用分离培养基液体培养基发酵培养2d离心后，用检测培养基打孔检测其上清液，8h后测得水解圈直径分别为：24mm、27mm、21mm、23mm、20mm、21mm。其中水解圈直径为27mm的菌株为NMXY3，因此选取NMXY3号菌株作为目的菌株目的菌株在分离平板上形成水解