（麻醉学专业论文）噪声应激对大鼠触液核和脑脊液中p385mapk的影响.pdf

徐州医学院硕 j 学位论文 缩略词 a q c s f c b h i 之p 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 m i d b r a i na q u e d u c t c e r e b r o s p i n a lf l u i d 中文全称 中脑导水管 脑脊液 c h o l e r at o x i nbc o n j u g a t e dt o霍乱毒素亚单位b 与辣根过 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e d c s f c n sd i s t a lc s f c o n t a c t i n gn e u c l e o r d a b d r f i t c g a s l v m a p k p b s t r i t c t m b 3 3 d i a m i n o b e n z i d i n e d o r s a lr a p h en u c l e u s f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e g e n e r a la d a p t a t i o ns y n d r o m e l a t e r a lv e n t r i c l e m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 氧化物酶复合物 接触脑脊液神经核 触液核 3 3 一二氨基联苯胺 中缝背核 异硫氰酸荧光素 周身适应综合征 侧脑室 丝裂原活化蛋白激酶 磷酸盐缓冲生理盐水 t e t r a e t h y lr h o d a m i n ei s o t h y o c y a n a t e四乙基若丹明异硫氰酸盐 t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e 四甲基联苯胺 哪6川9帅8嗍4m 4啪8 iii 哪y t l l lllll 徐州医学院硕士学位论文 噪声应激对大鼠触液核和脑脊液中p 3 8 m a p k 的影响 中文摘要 目的 观察噪声应激不同时程对大鼠触液核p 3 8 m a p k 的表达和脑脊液 p 3 8 m a p k 含量的影响 探讨脑脊液中物质变化的来源及其与应激行为的关系 方法 将成年雄性s p r a g u e d a w l e y 大鼠随机分为正常组 噪声1 d 3 d 5 d 7 d l o d 1 4 d 组 制作l d 3 d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 d 不同时程的噪声应激 模型 并与正常组对照 记录应激行为 用免疫组化双标及w e s t e mb l o t 法观察 上述时间点p 3 8 m a p k 在触液核上的表达情况及脑脊液中p 3 8 m a p k 含量的变 化 利用p h o t o s h o p 图像分析系统对w e s t e r nb l o t 染色条带测量后进行半定量分 析 结果 1 行为学测定 正常组与噪声应激刺激1 d 3 d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 d 组比 较均有差异1 9 2 1 3 8 1 l 3 5 1 0 3 7 8 8 3 4 8 3 2 9 1 6 i 1 2 均为增 多趋势 p 0 0 5 7 d 时达增多最高峰 8 3 8 1 1 0 3 2 1 2 o 3 6 p 0 0 1 1 0 d 1 4 d 与7 d 组比较为下降趋势且 p 0 0 5 2 免疫组化双重标记 在正常触液核中出现c b h r p p 3 8 m a p k c b h r p p p 3 8 m a p k 三种标记细胞 其中被c b h r p 标记的的两个神经细胞 簇细胞计数为3 2 4 其他脑区未见c b h r p 标记神经细胞簇 正常组细胞簇内 仅有个别神经元见有c b h r p p p 3 8 m a p k 噪声应激刺激1 d 3 d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 d 时c b r t r p p p 3 8 m a p k 双重标记神经元数目分别为 0 8 1 2 6 0 5 6 5 3 4 1 5 6 1 3 6 1 2 6 t 3 6 5 5 4 5 0 6 o 7 p o 0 5 噪音应激1 0 d 1 4 d 组与7 d 组比较 c b h r p p p 3 8 m a p k 双重标记神经元数目显著减少 p 0 0 5 2 八0 士学位论文 3 w e s t e r nb l o t 检测 正常组脑脊液内仅见有极少p 3 8 m a p k 噪声应激 刺激1 d 3d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 d 时 p p 3 8 m a p k 较正常组显著增多 p o 0 5 1 0 d 1 4 d 时与7 d 组比较 p p 3 8 m a p k 数目显著减少 p 0 0 5 结论 1 触液核中的p 3 8 m a p k 参与了机体对噪声应激的信息传递或调 控 其作用随应激天数增加而先日趋增加后下降 2 脑脊液中的p 3 8 m a p k 的含量随应激天数增加先日趋增加后逐渐下 降 3 触液核和脑脊液中p 3 8 m a p k 含量的变化时相一致 其规律均是先增 加后下降且高峰均在第七天出现 由于触液核与脑脊液的特定位置及关系 其胞 体位于室管膜内的脑实质 突起伸入脑室腔的脑脊液内 因此断定噪声应激时脑 脊液中的p 3 8 m a p k 的表达与触液核相关 关键词 脑脊液 远位触液神经元 p 3 8 丝裂原活化蛋白激酶 p 3 8 m a p k 噪声应激 本课题受国家自然科学基金资助 基金号 3 0 8 7 1 3 0 7 徐州医学院硕士学位论文 t h ee f f e c to fn o i s es t r e s so ne x p r e s s i o no fp 38 m a p k i nt h ed i s t a l c e r e b r o s p i n a lf l u i d c o n t a c t i n gn e u r o n sa n d t h ec e r e b r o s p i n a lf l u i d i nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e t oo b s e r v et h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tt i m ec o u r s e so fn o i s es t r e s so n t h ec o n t e n to fp 38 m a p ki nd i s t a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d c o n t a c t i n gn e u r o n sa n d c e r e b r o s p i n a lf l u i do f r a t sa n di n v e s t i g a t ec h a n g e so fs u b s t a n c e si nc e r e b r o s p i n a lf l u i d a n dt h e i rr e l a t i o n s h i pw i t hs t r e s sb e h a v i o r s m e t h o d s a d u l tf e m a l es p r a g u e d a w l e yr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ob l a n k c o n t r o lg r o u p ld 3 d 5 d 7 d 10 da n d14 dn i o s es t r e s sg r o u p s n o i s es t r e s sm o d e l so f d i f f e r e n tt i m ec o u r s e s ld 3 d 5 d 7 d 10 da n d14 d w e r ee s t a b l i s h e d ad o u b l e l a b e l e d i m m u n o f l u o r e s c e n tt e c h n i q u ea n dl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p yw e r eu s e dt o i d e n t if yt h ee x p r e s s i o no f p 38 m a p k i nd c s f c n s s t r e s sb e h a v i o r sw e r er e c o r d e d a n dc o m p a r e dt ot h o s eo fan o r m a lg r o u p t h ec o n t e n to f p 38 m a p ki nd i s t a l c e r e b r o s p i n a lf l u i d c o n t a c t i n gn e u r o n sa n dc e r e b r o s p i n a lf l u i do ft h ea b o v eg r o u p s w a sd e t e r m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dw a s t e mm e t h o d s o f t w a r ep h o t o s h o p p l u sw a su s e dt oc o u n tt h en u m b e ro fn e u r o n si nt h r e es e c t i o n sw h e r ec b h r p p o s i t i v en e u r o n sw e r el o c a t e di nt h em e s e n c e p h a l o no f r a t s r e s u l t s 1 d e t e r m i n a t i o n o fb e h a v i o r c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p l d 3 d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 dg r o u p sa l li n c r e a s e d1 9 2 1 3 8 1 1 3 5 1 0 3 7 8 8 3 8 3 2 9 1 6 1 1 2 p 0 0 5 a n di nt h e7 dg r o u pi tr e a c h e dt h ec l i m a xa n dt h e n d e c r e a s e di nt h e10 da n d14 dg r o u p p 0 0 5 2 i m m u n o h i s t o c h e m i c a ld o u b l el a b e l i n g c o n s t a n t l yt h r e eg r o u p so fc b h r p 4 徐州医学院硕士学位论文 p 3 8 m a p k c b h r p p p 3 8 m a p kl a b e l e dn e u r o nc l u s t e r se x i s ti ns p e c i f i ca r e ao f b r a i ns t e mb u tn o to t h e ra r e a si nt h eb r a i n c b h r p p p 3 8 m a p kw a so b s e v e r e d o n l yi nf e wn e u r o n si n c e l lc l u s t e ro fc o n t r o lg r o u p c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p c b n r p p p 3 8 m a p kd o u b l el a b e l e dn e u r o n si nl d 3 d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 dg r o u pw e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d 0 8 1 2 6 0 5 6 5 3 q 4 1 5 6 4 3 6 1 2 6 4 3 6 5 5 4 4 5 0 6 4 0 7 p 0 0 5 a n dc o m p a r e dw i t hl o da n d1 4 dg r o u p t h e yh a da s i g n i f i c a n td e c r e a s e p o 0 5 3 b yw a s t e mb l o d l i t t l ep 3 8 m a p ke x p r e s s i o nw a so b s e r v e di nt h ec s fo ft h e c o n t r o lg r o u p c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p l d 3d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 dg r o u ph a d as i g n i f i c a n ti n c r e a s eo ft h ee x p r e s s i o no fp p 3 8 m a p ka n dt h ec l i m a xw a si nt h e7 d g r o u p c o m p a r e dw i t h7 dg r o u p t h ee x p r e s s i o no f p p 3 8 m a p k i n1 0 da n d1 4 dg r o u p s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d p o 0 5 c o n c l u s i o n 1 p p 38 m a p k i nt h ed i s t a lc e r e b r o s p i n a lf l u i dc o n t a c t i n gn e u r o n so ft h eb r a i n p a r e n c h y m aw a sp r o b a b l yi n v o l v e di nt h em e s s a g et r a n s m i s s i o no r m o d u l a t i o no f n o i s es t r e s so nw h o l ep r o c e d u r ea n di t se f f e c tf i r s ti nc r e a s e dg r a d u a l l yw i t hd a t et h e n d e c r e a s e d 2 p 3 8 m a p ki nt h ec s fw a sp r o b a b l yi n v o l v e di nt h em e s s a g e t r a n s m i s s i o n o rm o d u l a t i o no fn o i s es t r e s so nw h o l ep r o c e d u r ea n di t se f f e c tf i r s ti n c r e a s e dg r a d u a l l y w i t hd a t et h e nd e c r e a s e d t h ec h a n g e so ft h ec o n t e n to fp 3 8 m a p ki nd i s t a lc e r e b r o s p i n a lf l u i dc o n t a c t i n gn e u r o n s w a si na c c o r d a n c ew i t ht h a ti nc s f b o t ho fw h i c hi n c r e a s e df i r s ta n dr e a c h e dt h e c l i m a xi nt h e7 md a ya n dt h e nd e c r e s e d s ow ec o n c l u d et h a tt h ee x p r e s s i o no f p 38 m a p k i nt h ec s fi nt h en o i s es t r e s sw a sa s s o c i a t e dw i t hd i s t a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d c o n t a c t i n gn e u r o n s k e yw o r d sc e r e b r o s p i n a lf l u i d p 3 8 m a p k n o i s es t r e s s d i s t a lc e r e b r o s p i n a l f l u i dc o n t a c t i n gn e u r o n s 5 徐州医学院硕士学位论文 剐 吾 中枢神经系统中有一种特殊类型的神经元 触液神经元 c e r e b r o s p i n a lf l u i d c o n t a c t i n gn e u r o n s c s f c n s 1 根据其所在位置与室管膜的关系可分为三类 位于室管膜自身的室管膜内触液神经元 胞体位于脑室壁和脊髓中央管 紧邻室 管膜的室管膜上的触液神经元 下临室管膜 第三种即脑干内的远位触液神经元 d c s f c n 这类神经元通过吸收或释放生物活性物质改变脑脊液的实际成分可 起非突触信息传递的作用 1 2 远位触液神经元在中枢系统各脑区均有分布 但最 集中的部分在脑干的特定脑区 称之为 触液核 我们实验室继往研究的表明 这一核簇可能参与了疼痛信号的传递与调控 3 室管膜和室管膜下接触脑脊液细 胞因贴近脑脊液 不需标记也容易辨识 4 有关它们的形态 结构 化学性质 乃至功能意义已有十余年研究 5 1 9 8 2 年我们首次采用霍乱毒素亚单位b 与辣 根过氧化物酶复合物 c h o l e r at o x i ns u b u n i tb w i t hh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e c b h r p 逆行示踪技术能可靠标记定位脑实质内的c s f c n s 为开展该类神经元的研究 奠定了基础 6 触液神经元的胞体位于室管膜内的脑实质 突起伸入脑室腔的 脑脊液内 2 1 因此在脑 脑脊液之间担负着物质转运 信息传递和功能调节中可能 起着重要作用 当脑脊液物质在特定生理或病理条件下发生改变时 触液神经元 的突起有可能感受脑脊液的物质变化并将信息传递给大脑 进一步通过大脑调节 机体的生命活动 当大脑获取机体特定的生理或病理信息也可能通过触液核的神 经末梢向脑脊液中释放某些物质 从而改变脑脊液中的物质含量 因此人们可以 通过检测脑脊液的物质变化来诊断机体的生理病理状况 也可以通过脑脊液途径 给予药物的来预防和治疗某些疾病 但这些仅是推测和设想 尚无任何理论研究 和证据 近年来我们对触液核的核团定位 细胞结构 递质受体 离子通道及其 与某些生命活动的关系做了大量研究 并证实触液核与神经病理性疼痛 炎性痛 6 院硕士学位论文 相关 7 1 3 j 噪声是目前最常见的重要应激源 它对机体的各个脏器及系统具有危害作用 1 4 应激反应是指机体受到构成对其威胁的任何刺激而发生的多种激素参与的 全身反应 它以交感神经兴奋和丘脑下部一垂体前叶一肾上腺皮质功能增强为主要 特点 是一组非特异性的周身适应综合征 g e n e r a la d a p t a t i o ns y n d r o m e g a s 是机体最可能和最有效的方法对抗应激性刺激的一种非特异性防御反应 1 5 丝 裂原活化蛋白激酶 m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m a p k 是广泛表达的 丝氨酸 酪氨酸激酶 它在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起着重要作用 m a p k 有4 个主要亚族 e r k p 3 8 m a p k j n k 和e r k 5 p 3 8 信号通路是m a p k 通路的一 重要分支 它在炎症 应激 凋亡 细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起 到重要作用 目前已知的4 种p 3 8 异构体包括p 3 8q p 3 81 3 p 3 8y 和p 3 86 经过多年研究已发现p 3 8 m a p k 通路可以由应激包括高渗 热休克 放射线和其他 应激反应激活和活化 1 6 1 新近的研究提示 在细胞对生长因子和环境应激的反应 过程中m a p k 信号通路起关键作用 1 7 神经元信号通路中的p 3 8 丝裂原活化蛋白 激酶 p 3 8 m a p k 在机体应激调控中可能发挥重要作用 1 8 本文通过对噪声应激大鼠的行为学和脑脊液中p 3 8 m a p k 的检测 及 c b h r p 标记和和免疫组织化学相结合的双重标记技术 观察噪声应激不同时程 对大鼠触液核p 3 8 m a p k 的表达和脑脊液p 3 8 m a p k 含量的影响 探讨脑脊液中 物质变化的来源及其与应激行为的关系以期探讨为应激及紧张状态对机体的影 响提供理论和实验依据 为触液核在噪声应激中的作用乃至该类神经元的功能意 义提供依据 为脑脊液中p 3 8 m a p k 的表达变化与触液核是否相关提供依据 7 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 1 材料 1 1 实验动物 成年雄性s p r a g u e d a w l e y 大鼠 体重2 5 0 9 一3 0 0 9 徐州医学院实验动物中心 1 2 主要的试剂与药品 p 3 8 m a p k 一抗美国s i g m a 公司 c b h r p 3 0 中国协和医科大学 c b 抗体美国s i g m a 公司 p 3 8 m a p k 标记的驴抗兔抗体美国s a n t ac r u z 公司 小牛血清美国s a n t ac r u z 公司 1 3 a c t i n 一抗北京中杉公司 w e s t e r nb l o t 二抗 美国s i g m a 公司 彩色预染蛋白质分子量标准碧云天生物有限公司 s d s p a g e 蛋白上样缓冲液碧云天生物有限公司 w e s t e r n 一抗稀释液碧云天生物有限公司 w e s t e r n 二抗稀释液碧云天生物有限公司 r i p a 裂解液碧云天生物有限公司 封闭液碧云天生物有限公司 i r i s b a s碧云天生物有限公司 甘氨酸碧云天生物有限公司 a c r碧云天生物有限公司 b c i p n b t 碱性磷酸酶显示试剂盒碧云天生物有限公司 d a b 粉剂 美国s i g m a 公司 水合氯醛上海制药厂 戊二醛 分析纯 北京化工厂 i i i t 士学位论文 钨酸钠 分析纯 无水乙醇 分析纯 双氧水 分析纯 多聚甲醛 分析纯 磷酸二氢钠 分析纯 磷酸氢二钠 分析纯 氯化钠 分析纯 浓盐酸 分析纯 蔗糖 分析纯 甲醇 分析纯 其他试剂至少为分析纯 1 3 主要仪器 大鼠脑立体定位仪 制冰机 手术器械一套 微量注射器 电子记时器 激光共聚焦显微镜 t c s s p 2 冰冻切片机 显微照相系统 图象分析系统 微量注射器 电泳仪 转移槽 电子微量天平 9 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 上海虹光化工厂 上海虹光化工厂 上海虹光化工厂 上海虹光化工厂 日本 日本三洋 江苏徐州 中国上海 中国上海 德国l e i c a 公司 德国l e i c a 公司 日本o l y m p u s 公司 德国l e i c a 公司 中国上海 美国b i o b a n d 公司 美国b i o b a n d 公司 中国上海 徐州医学院硕士学位论文 b k3 3 9 0 正弦无规发生器 s h1 2 1 型4 0 0 瓦扩音器 扬声器 1 0 吉时利 北京 测量仪器有限公司 北京泰达创通科技发展有限公司 泰兴市凯特莱电子有限公司 徐州医学院硕士学位论文 2 研究方法 2 1 实验动物 所有实验均遵从国际疼痛研究联合会相关指南 并得到徐州医学院实验动物 伦理委员会的许可 选用健康成年雄性s d 大鼠 体重在2 5 0 9 一3 0 0 9 徐州医学 院实验动物中心提供 实验前饲养动物的动物实验室内保持光暗周期为1 2h 1 2 h 光照时间8 0 0 2 0 0 0 室内温度为 2 2 0 5 湿度为5 0 左右 自大鼠 进入实验室饲养开始计算 给予7d 的适应期 适应期内所有动物自由摄食和饮 水 静养1w k 以排除环境因素对行为学测试的影响 2 4 1 2 2 动物模型 噪声应激各组于8 0 0 1 0 0 0 予 1 0 0 5 d b 隔音环境中噪声应激2h 噪声暴露每天一次 分别暴露ld 3d 5 d 7 d 1 0d 和1 4d 各组动物于应 激结束后即观察行为学1 0m i n 直接抽取脑脊液 0 5h 内灌注处死 在实验操作 过程中 动作轻柔 避免对动物用力挤 捏 抓 压等 噪声源由b k3 3 9 0 正弦 无规发生器 通用前级增音机 s h1 2 1 型4 0 0 瓦扩音器及扬声器组组成 噪声 声压级为1 0 0 0 5d b 由b k4 1 4 5 电容传声器 b k 2 8 9 5 阴极输出器和b k 2 8 9 1 频率分析仪监测 暴露区内声压变动1d b 2 3 实验分组 将大鼠随机分为正常组 应激1d 组 应激3d 组 应激5d 组 应激7d 组 应激1 0d 组 应激1 4d 组 每组8 只 2 4 行为学测定 旷场反应实验 正常组和实验组分别在实验的第ld 第3d 第5d 第7 d 第1 0d 第1 4 给予1 0 0 5 d b 噪音应激后立即进行旷场反应实验 方法是将大鼠放入旷场箱中 同时启动计时器 记录内容 1 大鼠在1 0m i n 内所行走的格子数 2 大鼠在1 0m i n 内行走格子时直立及修饰次数 目的在于证实恐惧行为是否发生 模型是否成功 2 5 脑脊液提取及处理 正常组和实验组动物 各时问点n 8 在各时间点造模后 将大鼠用1 0 水 徐州医学院硕士学位论文 合氯醛 3 0 0m g k g 腹腔注射 麻醉 直接经枕骨大孔用1 毫升注射器进针2 毫 米 提取澄清脑脊液 各时间点样本采集完成后 取0 3 m l 4 c1 2 0 0 0 r p m 离心 5 m i n 取上清液 按l o w r y 法测定样本蛋白浓度后按照l 4 体积加入上样缓冲液 9 5 c 变性5 m i n 2 0 c 冰箱保存 1 0 s d s p a g e 电泳 1 0 0 v 恒压2 h 半干转 法5 0 m a 4 5 m i n 转至硝酸纤维素膜上 5 脱脂奶粉封闭2 h 加兔抗p p 3 8 一抗 c e l ls i g n a l 公司 4 过夜 t b s t 洗膜5 m i nx3 次 加入羊抗兔二抗室温摇 床孵育2 h t b s t 洗膜5 m i nx3 次 加入显色剂 n b t b c i p 待反应达到要求后 流水洗涤终止反应 所得条带经a d o b e 公司p h o t o s h o p 软件半定量分析处理 2 6 侧脑室注射c b h r p 根据c b h r p 标记脑内触液核所需时间 各组动物于完成应激刺激前的4 8h 腹腔给予戊巴比妥钠 4 0m g k g 麻醉 参照p a x i n o s 和w a t s o n 大鼠脑立体坐标 图谱 依立体定位仪坐标向单侧侧脑室注射3 0 c b h r p 北京协和医科大学解剖 教研室产品 每只3ul 动物置于安静 适宜 1 5 1 8 和避强光的 环境中喂养4 8 小时 2 7 灌注处死 取材 切片 各组动物腹腔注射戊巴比妥钠深麻醉 4 0m g k g 开胸腔后 经升主动脉快速 灌注3 7 c 生理盐水3 0 0 m l 然后灌注4 多聚甲醛磷酸盐缓冲液行组织前固定 o 2 mp b s3 0 0 m l p h7 4 前1 0 0 m l 快速滴注后2 0 0 m l 缓慢滴入 总约9 0 m i n 取脑 然后在脑立体定位仪上按我们的方法取触液神经元所在段 置于同等浓度的多聚 甲醛固定液中后固定2 3 h 然后在4 c 冰箱环境内予以梯度蔗糖0 0 1mp b s 缓 冲液 5 1 0 1 5 2 0 3 0 中脱水2 4 4 8 h 直至沉底 恒冷切片机 l e i c a c m l 9 0 0 德国 冰冻连续冠状切片 2 0 c 光镜片厚4 0 u m 荧光片厚2 5 u m 分 甲 乙两套按序置片 以t m b s t 法行c b h r p 呈色反应 采用t m b s t 技术呈色 上述d c s f c n 切片经钨酸钠 氯化钻作为稳定剂稳定 甲套切片以中性红进一步 细胞复染 以便从切片全貌上观察细胞核团的位置关系 乙套镜检c b h r p 阳性切 片 备做p 3 8 m a p k 免疫组织化学反应 1 2 1 徐州医学院硕士学位论文 2 8 p 3 8 m a p k 免疫组织化学反应 切片经0 0 4 m p b p h 7 4 液漂洗3 次 3r a i n 次 预孵 预反应 切片置 于洁净特制反应框中于室温 1 5 2 0 下暗室预反应2 0 r a i n 避光 每1 0 0 m l 孵 育液配置如下 1 9 钨酸钠 n a 2 w 0 40 2 h 2 0 s t 溶于4 7 m l 双蒸水 然后加入o 2 m p b p h 5 4 5 0 m l 1 nh c l l 1 5 m l 最后加入现配置的t m b 溶液1 5 m l 过滤 t m b 溶液配制方法 7 m g t m b 先溶于0 5 m l 丙酮 再加入1 m l 无水乙醇混匀 0 2 m p b p h 5 4 配置方法 n a 2 h 2 p 0 4 2 h 2 02 6 8 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 5 8 9 溶于双蒸 水中定容至1 0 0 0 m 1 呈色反应 切片浸浴于上述反应液中于1 5 2 0 环境避光呈色反应约 1 0 6 0 m i n 每隔1 0 m i n 向每1 0 0 m l 反应液中加入0 7 m l 的0 3 h 2 0 2 至光镜镜检见阳 性细胞且呈色清晰为止 加h 2 0 2 时切片框要暂时离开反应液 等充分混匀后再浸 入 终止反应 切片0 0 4 m p b p h 7 4 40 c 缓冲液漂洗2 3m i n 次 3 次 d a b c o 稳定 切片完全浸浴于洁净的稳定液中 1 0 m i n 3 7 c 稳定液现 用现配 0 0 5 d a b 0 0 2 氯化钴 0 0 1 h 2 0 2 o 1 m p b p h7 4 3 见颜色变 暗淡且溶液中少许絮状沉淀出现时立即中止 用0 0 4 m p b p h7 4 缓冲液漂洗 2 3m i n 次 3 次 然后将切片转移至洁净的培养皿中再予0 0 1 m p b s p h 7 4 取从乙套镜检的c b h r p 反应阳性切片 经0 0 5 d a b 液稳定 进一步经o 0 1 m o l l p b s p h 7 4 洗涤后 入a b c 试剂盒 中山公司产品 a 液中 室温孵育lh 后 入兔抗p 3 8 m a p k 血清 1 1 0 0 抗体稀释液稀释 美国c e l ls i g n a l 产品 4 孵 育4 8h 再入a b c 试剂盒b 液中 3 7 孵育3 0 m i n 再入c 液中3 7 c 孵育3 0 m i n 以上每一步骤之后均用0 0 1 m o u l p b s p h 7 4 漂洗6 次 每次5m i n 后d a b 显色 室温下反应5m i n 贴片 干燥 脱水 透明 封片 光镜下观察 并作显微摄片 记录结果 2 9 标记细胞计数与统计学分析 光镜切片细胞计数方法 各例动物取相同层面c b h r p 阳性细胞最集中的3 徐州医学院硕士学位论文 张脑组织切片 于1 0 0 倍放大在固定部位截取一屏计数c b h r p 9p 3 8 m a p k 和 c b h r p p 3 8 m a p k i j e t 性细胞数 用于统计学分析 凡可确认为标记颜色者 均 计数为1 个标记细胞 各例动物计数数据均采用 盖妇 表示 光镜下对各组c b h r p 标记阳性切片均进行观察计数 并用o l y m p u sb p l l 数码相机摄像 实验数据采用均数 标准差 x 如 表示 采用s p s s l 3 0 统计软 件进行单因素方差分析 1 4 修饰次数 结果发现 噪声 应激后的六组大鼠的行走格子数与正常组比较有显著差异 p 0 0 5 即呈随时 间延长而先升高后下降的趋势 与正常组相比 六组动物的直立次数和修饰次数 也均显著有显著差异 p 0 0 5 即呈随时间延长而先增加后下降的趋势 且7 d 组行走格数 直立次数和修饰次数为增多的高峰 p 0 0 1 在1 d 3 d 5 d 组与 正常组相比显著增多 p 0 0 5 1 0 d 1 4 d 组较正常组显著增多 p 0 0 5 但与 7 d 组比较显著减少 p 0 0 5 具体结果见表1 所示 2 脑脊液提取后w a s t e r n 标记结果 观察噪声应激后大鼠脑脊液中的p p 3 8 丝裂原活化蛋白激酶 m a p k 含量 结 果发现 噪声应激后的六组大鼠脑脊液中p p 3 8 含量随时间延长而先增多后减少 的趋势 与正常组比较有显著差异 1 d 3 d 5 d 7 d 1 0 d 1 4 d 组较正常组显著增 徐州医学院硕士学位论文 元 即均一棕黄色的胞浆背景下散在分布有蓝黑色颗粒 图 a g 各组动物c b h r p p p 3 8 m a p k 和c b h r p p p 3 8 m a p k 三种细胞标记计 数见表2 在无噪声应激的正常组c b h r p 集中分布区仅见少数几个p 3 8 免疫阳性 神经元 图a 而3 d 组 5 d 组和7 d 实验组p p 3 8 免疫阳性神经元数目明显增多 且呈随时间延长而增多的趋势 图c d e p p 3 8 m a p k 免疫反应阳性神经元在l d 和1 4 d 组与正常组相比没有明显变化 图b g 3 d 组较正常组p p 3 8 免疫反应阳 性神经元数目显著增多 p o 0 5 图 c 5 d 组较正常组p p 3 8 免疫反应阳性神经 元数目显著增多 p o 0 1 图 d 7 d 组较正常组p p 3 8 免疫反应阳性神经元数 目增多更显著 p 0 0 1 图 e 1 0d 组较正常组p p 3 8 免疫反应阳性神经元数目 显著增多 p o 0 1 图 f 1 0 d 天组较7 d 组p p 3 8 免疫反应阳性神经元数目显著 减少 p 0 0 1 图e f c b h r p p p 3 8 m a p k 双重标记阳性神经元数目在1 d 3 d 和5 d 组较正常组显著增多 p o 0 1 图b d 7 d 组与正常组相比数目增多更 显著 p o 0 1 图g 表2 1 6 徐州医学院硕士学位论文 讨论 1 噪音应激模型成功的标志 近年来人们在研究中发现 强的噪声可以引起耳部的不适 如耳鸣 耳痛 听力损伤 1 9 据测定 超过1 0 0 分贝的噪声还会造成耳聋 据临床医学统计 若 在8 0 分贝以上噪音环境中生活 造成耳聋者可达5 0 2 0 噪声使人不得安宁 难以休息和入睡 当人辗转不能入睡时 便会心态紧张 呼吸急促 脉搏跳动加 剧 大脑兴奋不止 第二天就会感到疲倦 或四肢无力 2 l 使工作效率降低 研究发现 噪声超过8 5 分贝 会使人感到心烦意乱 人们会感觉到吵闹 因而 无法专心地工作 结果会导致工作效率降低 噪声是心血管疾病的危险因子 噪 声会加速 t l 脏衰老 增加心肌梗塞发病率 2 2 1 医学专家经人体和动物实验证明 长期接触噪声可使体内肾上腺分泌增加 从而使血压上升 2 3 1 在平均7 0 分贝的 噪声中长期生活的人 可使其心肌梗塞发病率增加3 0 左右 特别是夜间噪音 会使发病率更耐2 4 1 调查发现 生活在高速公路旁的居民 心肌梗塞率增加了 3 0 左右 高噪声的工作环境 可使人出现头晕 头痛 失眠 多梦 全身乏力 记忆力减退以及恐惧 易怒 自卑甚至精神错乱 2 5 尤其是中枢神经系统的损 伤 2 6 2 7 1 时间越长 损伤越明显 人们只知道噪声影响听力 其实噪声还影响视力 已有试验表明 当噪声强度达到9 0 分贝时 人的视觉细胞敏感性下降 识别弱 光反应时间延长 噪声达到9 5 分贝时 有4 0 的人瞳孔放大 视模糊 而噪声 达到1 0 0 分贝时 多数人的眼球对光亮度的适应都有不同程度的减弱 所以长时 间处于噪声环境中的人很容易发生眼疲劳 眼痛 眼花和视物流泪等眼损伤现 象 同时 噪声还会使色觉 视野发生异常 调查发现噪声对红 蓝 白三色 视野缩小8 0 t 2 8 2 9 1 旷场反应是研究动物恐惧 紧张情绪的重要指标 3 0 旷场活动性实验的观察是检测实验动物情感行为的重要方法 动物首次进 入新的环境可出现明显的防护性情感反应 这对于量化分析实验动物的警觉水 平 恐惧 焦虑状态 以及环境适应能力等有重要意义 而惊吓反应可以判断动 1 7 徐州医学院硕士学位论文 物惊吓反射 行为习性改变的状况 为研究恐惧应激对情感行为的影响 本实验 以0 0 0 5 d b 噪声刺激 建立大鼠急性恐惧应激模型 结果显示 应激后大鼠旷 场活动性降低 惊吓反应增强 提示急性恐惧应激可以引起大鼠情感行为的异常 变化 使大鼠在新环境中的警觉水平明显增高 易激惹 对惊吓刺激的适应能力 明显下降 应激的主要非特异性反应之一是下丘脑 垂体 肾上腺 h p a 轴的激 活 从而引起全身性代谢效应 生理变化 尤其是脑功能变化 乃至行为改变和疾 病发生 在心理应激状态下 肾上腺皮质的浓度呈上升趋势 3 1 1 一方面可以帮助 机体缓冲和适应应激刺激 但另一方面也是导致机体发生应激疾病的重要因素 细胞外信号调节激酶p 3 8 m a p k 在中枢神经系统应激反应的过程中可能起到重 要的调节作用 研究发现 应激后早期大脑p 3 8 m a p k 途径被激活 3 2 急性应 激可以引起海马 前额皮质等脑区c f o s 基因和f o s 蛋白表达的激活 而 p 3 8 m a p k 活性的增加是神经元c f o s 基因表达激活的原因之一 3 3 1 所以 急性 应激诱导的大脑p 3 8 m a p k 磷酸化水平升高可能与应激诱导的神经活性增加有 关 从本实验结果看 噪声刺激对动物的旷场反应以不同的外部表现揭示了大鼠 应激时的行为特征 不仅说明应激行为的发生 也因此证明模型成功 2 噪音应激后触液核p 3 8 m a p k 表达的意义 p 3 8 丝裂原活化蛋白激酶 p 3 8 m a p k 属于哺乳动物应激与炎症激活的丝 裂原活化蛋白激酶家族重要成员之一 是一分子量为3 8 k d 的多肽 在未受刺激 时 m a p k 处于无活性状态 主要位于胞质中 一旦被磷酸化激活后 通过包括 m a p k m a p k k 和m a p k k k 三个关键激酶的级联反应 按照r a s r a f m a p k k k m a p k km a p k 的顺序激活下游激酶 最后转位到细胞核 激活转录因子e r k a t f 2 和a p1 等 启动相关细胞因子和炎性介质的基因表达 3 4 调节相关基因的 转录和蛋白的合成 进而引起长时程可塑性变化 形成一些病理改变或临床症状 的慢性过程1 3 5 1 本实验结果发现 无噪声应激时 在脑干特定区域即集中分布区 和脑脊液中p 3 8 m a p k 含量极少 这表明该物质在未受刺激条件下可能处于无活 性状态 徐州医学院硕七学位论文 以往的研究提示 p 3 8 m a p k 可被不同环境 化学和生理应激激活 3 6 1 如 冷 热应激 束缚应激 氧化应激 紫外线照射 福尔马林注射 电惊厥 e c s 脑 缺血 癫痫发作掣3 7 1 本实验结果发现 噪声应激后c b h r p p 3 8 m a p k 双重标 记阳性神经元表达也显著增多 胞浆和突起均有大量表达 并有随着应激时间的 延长 p 3 8 m a p k 日益增多的趋势 脑脊液中p 3 8 m a p k 表达也显著增多 并有 随着应激时间的延长 p 3 8 m a p k 日益也增多的趋势 且在7 天噪声应激时 p 3 8 m a p k 达顶峰 这一事实提示 本处于无活性状态的p 3 8 m a p k 在噪音应激 情况下 同样可被激活 说明p 3 8 m a p k 在噪声应激调控中可能发挥重要作用 但 是随时问的延长触液核和脑脊液中p 3 8 m a p k 逐渐减少 在1 4 天噪声应激时 p 3 8 m a p k 低于对照组且 p 0 0 5 有统计学意义 5 触液核与脑脊液中p 3 8 m a p k 含量的相关性 触液核在脑内细胞间通讯有两种方式 通过突触联系的神经传递和通过细胞 问液 脑脊液介导的化学信使容积扩散 3 8 通过w a s t e m 方法我们可明确检测 到脑脊液中的p 3 8 m a p k 由于触液核在脑 脑脊液之间的特殊联系 其胞体位于 室管膜内的脑实质 突起伸入脑室腔的脑脊液内 2 1 因此在脑 脑脊液之间担负着 物质转运 信息传递和功能调节中可能起着重要作用 当脑脊液物质在特定生理 或病理条件下发生改变时 触液神经元的突起有可能感受脑脊液的物质变化并将 信息传递给大脑 迸一步通过大脑调节机体的生命活动 当大脑获取机体特定的 生理或病理信息也可能通过触液核的神经末梢向脑脊液中释放某些物质 从而改 变脑脊液中的物质含量 通过两者在噪声应激中表达的完全一直性 我们有理由 推测和相信脑脊液中的p 3 8 m a p k 来源于触液核 临