（食品科学专业论文）色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究.pdf

浙江人学硕士学位论文 徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析巾的应用研究 摘要 蛔前竹叶提取物 e b l 9 7 1 的主要质控指标足以硝酸铝 业硝酸钠比色法 测定的总黄酮糖营含量 以芦丁为标准 为了建立与国际接轨的高标准质控体 系 必须运用高效液相色谱 h p l c 技术对e b l 9 7 l 中主要的黄酮碳苷进行定 量 首先面临的是标准品的分离 纯化和结构鉴定 本研究采用高速逆流色谱 h s c c c 对e b l 9 7 j 中的黄酮进行组分分离 接着用制备型高效液相色谱 p h p l c 纯化黄酮单体 然后用液相色谱 质谱联用 l c m s 技术对单体进行结构鉴 定 同时采用溶出伏安法对e b l l 中的微量元素进行检测 f 研究结果分述如下 1 经过对6 组两相溶剂系统的分析测试 选择以石油醚 正j 醇 水 1 4 5 作为h s c c c 的溶剂系统 其分层时间为2 5 s 上卜相体积比为o 9 6 两种 主要竹叶碳苷黄酮在该溶剂系统上 卜相中的分配系数分别为3 8 0 和4 4 4 2 以此溶剂系统的 卜相为固定相 下相为流动相 当h s c c c 仪转速为 8 0 0 r p m 流动相流速为2 2 5 m l m i n e b l 9 7 l 进样量为1 0 3m g 时 3 小时内就可 有效地将试样中的黄酮类化合物分成六个馏分 其中最主要的馏分一5 号峰经 h p l c 检测 发现含两种主要的竹叶碳苷黄酮 3 利用制备型反相高效液相色谱 对5 号峰进一步分离纯化 色谱条件 为 b e c k m a nu l t r a s p h e r et mo d s 柱 1 0 m mi d 2 5 0 m m 5 1 m 柱温 3 0 流速 1 0m l m i n 进样量 1 0 0u l u v 检测波长 3 3 0 n t o p d a 扫描 波长范围 1 9 0 6 0 0 n m 制备得到两个单体 其紫外光谱图都具有黄酮类化合 物所特有的吸收带i 3 0 0 4 0 0 n m 和带i i 2 4 0 2 8 5 n m 且两吸收峰的相对 强度也符合黄酮类化合物特征 4 利用l c m s 联用技术对所得的两个黄酮申体进行结构鉴定 测得其分 子量均为4 4 8 带i 的紫外吸收相同 带i i 有显著差异 经与美国 l n d o f i n e c h e m i c a l 公司的h p l c 级标准鼎对照 证实分别是荭草苷 8 c 葡萄糖 木犀草素 和异荭草苷 6 c 葡萄糖 木犀草素 5 经多次探索发现 运用1 5 次微分的溶出伏安法 在o 0 1 m o l l 醋酸钠 o 0 4 5 m o l l 酒石酸氢钾介质 p h 5 7 8 中 镉 铅 锌和铜离子都能产生灵敏 的氧化波 四种离子在1 0 一1 0 4m o l l 之间均具有良好的线性关系 将此法戍 塑婆叁兰堡圭兰堡堡奎堡丝塑 鱼堂垫查塑丛室鲨垄笪堕堡墼塑些坌坌要 塑壁里堕塞 用于e b l 9 7 l 中微量元素的分析测定 得干基含量为 铅 1 6 9 0 0 5 7 p g g 锌 6 0 9 0 5 6 7 g g 变异系数分别为3 3 8 和9 3 1 l 旦l 收率分别为 8 4 7 1 0 8 锌8 5 2 1 0 5 而e b l 9 7 1 中的镉和铜离子几乎测不 h 研究表明 将h s c c c 和p h p l c 有机组合 可以从e b l 9 7 l 中快速 高效地 分离纯化黄酮单体 且能达到百毫克级的水平 为竹叶黄酮标准品舶制备开拓 了一条有效途径 并为竹叶提取物高标准质控体系的建立奠定了馨 同时 本研究得出的溶出伏安法测定竹叶提取物中的微量元素 具有样品处理简单 灵敏度高 快速简便 干扰小 设备投资省等优点 适宜在生产实蕲中推广使 用 气 l 7 关键词 竹口l 提取物j 碳苷黄酮i 微量元素 高速逆流色谱 h s c y 制备型高效液相色谱印h p l c x 液相色谱 质谱联甩9 c m s 溶出伏安法 浙江大学硕士学位论文徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究 a p p l i c a t i o ns t u d i e so fc h r o m a t o g r a p h y a n d v o l t r a m m e t r y o n e f f e c t i v ec o m p o n e n t a n a l y s i so f b a m b o o l e a f e x t r a c t a b s t r a c t a tp r e s e n t t h em a j o rq u a l i t yc o n t r o li n d e xo ft h ee x t r a c to fb a m b o ol e a v e s e b l i st h e t o t a lf l a v o n eg l y c o s i d ec o n t e n t t f d e t e r m i n e db ya 1 f n 0 3 3 n a n 0 3s p e c t r o p h o t o m e t r yt a k i n gr u t i n a sas t a n d a r d i no r d e rt os e t u p a h i g h s t a n d a r dq u a l i t ya s s u r a n c es y s t e m w h i c hc a nb ea c c e p t e db yi n t e r n a t i o n a l s o c i e t y t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sm e t h o do f t f u s i n gb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h p l c s h o u l d b ei n d u c e da se a r l ya sp o s s i b l e i ti sf i r s t l yf a c e d w i t ht h es e p a r a t i o n p u r i f i c a t i o n p r e p a r a t i o na n ds t r u c t u r a li d e n t i f i c a t i o no fm a i n f l a v o n o i d si ne b l i nt h i s s t u d i e s u s i n gh i g h s p e e d c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y h s c c c t op r e p u r i f yf l a v o n o i d s i n e b l 9 7 1 p r e p a r a t i v eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y p h p l c t op r e p a r em o n o m e r s a n d h p l c m st oi d e n t i f ys t r u c t u r e w eg a i n e dt w op u r ec h e m i c a l so fc g l y c o s y l f l a v o n o i d so fb a m b o o a tt h es a l r l et i m e t h em e a s u r e m e n to ft r a c ee l e m e n t si n e b l 9 7 1w a sa l s oc o n d u c t e du s i n gb y1 5 t hd i f f e r e n t i a ls t r i p p i n gv o l t a m m e t r y r e s u l t sw e r e r e p o r t e d a sf o l l o w s r e s p e c t i v e l y 1 t h r o u g hi n v e s t i g a t i n gt h ed i s t r i b u t i o nc o e f f i c i e n t d e l a m i n a t i o nt i m e a n dv o l u m e r a t i ob e t w e e nt w op h a s e so fs i xs o l v e n ts y s t e m s o n em i x s o l v e n t st h a tc o n s i s t so f p e t r o l e u m n b u t a n o l a n d w a t e r 1 4 5 v v w a s s e l e c t e df o rh s c c c i t s d e l a m i n a t i o nt i m ei s2 5 s v o l u m er a t i ob e t w e e nu p p e ra n dn e t h e rp h a s e sw a s0 9 6 a n dt h ed i s t r i b u t i o nc o e f f i c i e n t so ft w om a i n c g l y c o s y lf l a v o n e so f b a m b o oi nt h e m i x s o l v e n t sw e r e3 8 0a n d 4 4 4 r e s p e c t i v e l y 2 t a k i n g t h eu p p e ro f t h em i x s o l v e n t sa ss t a t i o n a r yp h a s ea n dt h en e t h e ra sm o b i l e i i 浙江大学硕士学位论文徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究 p h a s e s i xe l u t e df r a c t i o n s w h i c hi n c l u d eap a r ts t a y e di ns t a t i o n a r yp h a s e w e r e o b t a i n e db yh s c c ci n 3h o u r s t h es e p a r a t i n gc o n d i t i o n sw e r e8 0 0 r p mr o t a t e s p e e d 2 2 5 m l m i nf l o wr a t e a n d1 0 3m gi n j e c t i o na m o u n to fe b l 9 7 1s a m p l e t w o m a i nc g l y c o s y lf l a v o n e sw e r ed e t e c t e db yh p l ci nt h ef i f t hf r a c i t i o n fe t h e b i g g e s tp e a k 3 t h e f i f t hf r a c t i o nw a sp u r i f i e db yp h p l cu n d e r f o l l o w i n gc o n d i t i o n c o l u m n t e m p e r a t u r e3 0 f l o wr a t e 1 0m l m i n i n j e c t i o nv o l u m e1 0 0 此 u vd e t e c t i o n w a v e l e n g t h3 3 0 n m a n dp d a d e t e c t i o nw a v e l e n g t h1 9 0 6 0 0 n m t w of l a v o n o i d m o n o m e r sw e r ep r e p a r e da n db o t hh a v et h ec h a r a c t e ru va b s o r b a n c e t h e i rb a n d ia n db a n d1 1w e r el o c a t e di nt h er a n g e so f3 0 0 4 0 0 n r na n d2 4 0 2 8 5 n m a n d a b s o r b a n t ei n t e n s i o na l s oa c c o r d sw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i co ff i a v o n o i d s 4 t h ec h e m i c a lc o n f i g u r a t i o no f t w om o n o m e r sw a si d e n t i f i e d b yh p l c m s t e c h n o l o g y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e ya l lh a v et h es a m em o l e c u l a rw e i g h to f4 4 8 w i t hs a m eb a n dia n dd i f f e r e n tb a n di ia b s o r b a n c e c o m p a r i n gw i t ht h es t a n d a r d s a m p l e sb o u g h t f r o mo fa m e r i c ai n d o f i n e c h e m i c a lc o m p a n y a n dt e s t i n gb y s t a n d a r da d d i t i o nm e t h o do fh p l c t w om o n o m e r sw e r ea p p r o v e da so r i e n t i n 8 c g l u c o s y l l u t e o t i n a n di s o o r i e n t i n 6 c g l u c o s y l l u t e o l i n i n d i v i d u a l l y 5 1d e t e r m i n a t i o no ft r a c ee l e m e n t so fc d p b z n c ub yt h e1 5 t hd i f f e r e n t i a l a n o d e s t r i p p i n gv o l t a m m e t r y w e r ec o n d u c t e dt o o i nt h es o l v e n tm e d i u mo f 0 0 1 m o i lp o t a s s i u m h y d r o g e nt a r t r a t ea n d0 0 4 5 m o i ln a a cw i t h 岬5 7 8 a l lo f f o u ri r o n sc a n p r o d u c ev e r ys e n s i t i v eo x i d a t i o nw a v e s t h ep e a kh e i g h ti sr e l a t e d l i n e a r l yw i t hi r o nc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f1 0 81 0 一m o i l t h i sm e t h o dh a s b e e ns u c c e s s f u l l yu s e dt oi n s p e c tt h ec o n t e n to f c d p b z na n dc uo f e b l 9 7 1 a n d r e s u l t ss h o w e dp b a t 1 6 9 0 0 6 t g ga n d z na t 6 0 9 4 0 5 7 p g i nd r yb a s e m e t h o d sv a r i a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r e3 3 8 a n d9 3l a n dt h er f i c o v e r yr a t e s w e r e8 4 7 1 0 8 a n d8 5 2 1 0 5 r e s p e c t i v e l y h o w e v e r c da n dc ui ne b l 9 7 1c o u l d n o tb ed e t e r m i n e dh e r e d u et ot h e i rc o n t e n t so v e rt h ei n s p e c t i n gl i m i to ft h i s i v 浙江大学硕士学位论文徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究 m e t h o d t h e s es t u d i e sr e v e a l e dt h a tt h ef l a v o n eg l y c o s i d e si ne b lc o u l db es e p a r a t e da n d p u r i f i e da b o v e0 1 9s c a l e sb yh s c c cp l u sh p l c f a s ta n de f f e c t i v e 虹i te x p l o r e d a ne f f e c t i v er o u t et op r e p a r eb a m b o o l e a f f l a v o n o i ds t a n d a r d sa n ds c r l e dd o w na f o u n d a t i o nf o r s e t t i n gu pah i g h s t a n d a r dq u a l i t ya s s u r a n c es y s l l e mo fe b l m e a n w h i l e t h em e t h o da p p l i c a t i o no ft h ea n o d e s t r i p p i n gv o l t a m m e t r y i n c o n t i n u o u sd e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t si ne b l 9 7 1w a ss i m p l e s e n s r i v e f a s t a n dd i s t u r b l e s sa n d c o s t l e s s s ov e r ys u i t a b l ef o rm a n u f a c t u r e r sa p p l i c a t i o n k e y w o r d s e x t r a c to fb a m b o ol e a v e s e b l c g l y c o s y lf l a v o n e t r a c ee l e m e n t h i g hs p e e d c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y h s c c c p r e p a r a t i v eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h p h p l c h p l c m s a n o d e s t r i p p i n g v o l t a m m e t r y v 致谢 本论文是在二位导师一一张英教授和吴晓琴劓赦授的悉心拍导下 苋成的 导师严谨的科学态度 对事 皇的执石追求 高尚的人格魅力 和蔼可亲的工作作风 时制威染和鼓舞着学t 使我受盖睡浅 这一切 对我的一生都埒产生t 要的影响 在即将牛业之际 谨向导师致以崇高 的鞋意和衷心的感豫 在本论文的设计 试验和论文撰写过程中 高速逆流色谱部分得到 了机州育学院的杜珙珍高极研究炙 夏明硕士的史力协助 高故液相色 谱实玲部分还得到了浙江省疾病控瑚和防疫站的任一平高级工程师 铁 晓威工程师的竭诚带助 溶出伏安法的条件摸索得到了钝请筑教投 李 秀玲射教棱的悉心拍点 谨在此向他们表示衷心的感谢 格簧值博士和硕士同学沈海涛 王启军 潘向荣 王乐芬 俞卓裕 姚晓宝等为本论文曲研究工作提供了煎情的帮助 特别值得一提的是 我的师妹 师弟们 郑t 莺 胡晓结 陆帕重等 在本文的试玲部分 做了太量的工作 在此一弄表示诚挚的谢意 我还要感锵农业工程与食品科学学院和食品系的领导和其他老师 在我求学期间说恰予的关心和帮助 羹后 要特别或鸽 在我 年求学生髓中 一直关心我 支持我的家 人 是他f 她 们给了我一往直前的勇气和充鞭国难的决心 谨将此文献恰我所蠡爱均人们 徐维娅 0 0 0 2 年罗恿于晰大毕家池 浙江大学硕士学位论文徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究 前言 黄酮类化合物 f l a v o n o i d s 简称类黄酮 广泛分布于植物界 是许多中 草药和食物的有效成分 为当今国内外的医药保健品行业和功能性食品领域 所瞩目 类黄酮类具有c 6 c 3 c 6 的基本结构 主要包括黄酮 黄酮醇 双氢 黄酮 醇 异黄酮 黄烷酮 查尔酮等十几个大类 l 近2 0 年来 类黄酮日 益引起人们的重视 迄今自然界中发现的已达数千种 大多具有显著的生理 和药理活性 对一些常见病 多发病 慢性病有良好的防治作用 随着对类 黄酮研究的不断深入 分析 测试和制备手段也得到了迅速发展 2 1 0 1 高速逆流色法 h s c c c 在天然产物研究中的应用 逆流色谱 c o u n t e r e u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y c c c 是近4 0 年发展起 来的一种新型的色谱技术 但在发展过程中遇到了许多挫折 3 直至上世纪 8 0 s 初期 高速逆流色谱 h i g hs p e e d c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y h s c c c l 的出现 才使得c c c 技术取得了突破性的进展 h s c c c 利用流体在聚四氟 乙烯螺旋管内的方向性与高速行星式运动结合 产生 种独特的流体动力学 现象 使互不相溶的两相溶液在螺旋管中充分混合 顺序传递 导致样品中 各个组分由于分配系数的差别而有效地分离 目前 h s c c c 在天然产物的研究 中已有广泛的应用 0 1 1h s c c c 在类黄酮中的应用 有文献报道 用氯仿 甲醇 水 4 3 2 体系 从芫花总黄酮中一次进样 l o o m g 分离得到了3 羟基芜花素 洋芹素和木犀草素 4 用氯仿 甲醇 水 6 3 2 体系 以1 8 0 0 r p m 的转速在1 5 r a i n 内从大黄根茎提取物中分离出大黄素 甲醚 芦荟大黄素 大黄酸 大黄酚和大黄素 5 以氯仿 甲醇 水 3 3 4 0 2 7 体系和7 0 0 r p m 的转速 在7 0 m i n 内从黄酮混合物中分离出橙皮素 4 羟基 黄 酮和槲皮素 并有效地利用了梯度洗脱技术 6 v a n h a e l e n 等将h s c c c 与h p l c 相结合 从5 0 0 m g 的银杏叶萃取物中一次分离出了7 个黄酮糖苷 其方法是 以水为固定相 开始以乙酸乙醣为流动相 然后在流动相中逐渐添加异丁醇 到分离结束时乙酸乙酯与异丁醇之比为6 4 1 7 j o k a 等以氯仿 甲醇 水 4 3 2 体系 在3 5 0 0 r p m 下 8 m i n 内从s e eb u c k t h o m 的果实萃取物中分离得到了5 浙江大学硕士学位论文徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究 个主成分 其分离速度完全可与h p l c 相比较睥 还有报道从大黄羟基蒽醌总 苷元中分离了大黄酸 芦荟大黄素 大黄素 大黄素甲醚 大黄酚等f 9 用正 己烷 乙酸乙酯 甲醇 水 9 1 5 5 在1 8 0 0 r p m 的转速下 7 0 m i 1 1 内从掌叶大 黄的根茎提取物中分离出大黄素甲醚 芦荟大黄酸 大黄酸 大黄酚和大黄索 d o 将e p i l o b i u mp a r v i f l o r u m 柳叶菜属 的甲醇萃取物进样2 毒分离得到了 槲皮苷 杨梅苷 异杨梅苷和没食子酸 两相溶剂系统为氯仿 甲醇 水 7 1 3 8 w 1 9 9 2 年c h e n 利用氯仿 甲醇 水 4 3 2 的两相系统对5 个类黄酮进行 了分离 并作了定量分析 1 2 1 1 9 9 4 年k a p a d i a 利用正己烷 乙酸乙醣甲醇 水 1 4 2 5 2 5 从g a r c i n i a k o l a 藤黄属 种子中分离出了多个双黄酮 1 3 0 1 2h s c c c 在生物碱中的应用 生物碱是植物中一类重要的化学组分 分布非常广泛 至少有5 0 多科1 2 0 属以上的植物中证明有生物碱存在 已知的种类在2 0 0 0 种以上 到目前为止 用h s c c c 研究天然产物化学成分的也以生物碱的报道为多 正丁醇 丙酮 水 8 1 1 0 体系曾用于从委内瑞拉的箭毒中分离马枯素和 p a n a r i n e 样品进样达7 0 0 m g t 正丁醇一氯化钠 0 1 m 0 1 l 1 1 体系用于从 s t r y c h n o su s a m b a r e n s i sf 马钱科 的树干和树皮中分离1 0 羟基 n k 甲基一柯楠醇 1 5 用四氯化碳 甲醇 水 2 0 2 0 2 从a n i s o c y c l ac y m o s a 的根中分离得到了 一个季铵盐生物碱和5 个叔苄基异奎宁生物碱 l 用正己院一乙酸乙酯一甲醇 水 3 7 5 5 在7 0 r a i n 内以1 8 0 0 r p m 的转速从粉防已干根的提取物中分离了 粉防己碱 去甲粉防己碱和轮环藤酚碱 17 1 从唐古特山莨菪粗提物中 用氯仿 磷酸盐 o 0 7 m o f l p h6 4 1 1 系统分离出了4 个生物碱 l s l 从小蔓长春花 植物的叶子中用正己烷 乙醇 水 6 5 5 体系分离了长春胺和长春辛 l 将 h s c c c 与m s 联用分析长春胺和长春辛碱1 2 0 分别用正己烷 乙酸乙酯一乙醇一 水 6 3 2 5 和正已烷 乙酸乙酯 甲醇 水 1 1 l 1 从红豆杉的粗提物中 分离纯化了紫杉醇 c e p h a l o m a r m i n e 巴卡掣2 l 以石油醚 乙酸己酯 甲醇一水 5 0 7 0 8 0 6 5 从紫杉醇的混合物中分离得到了纯的紫杉醇和 c e p h a l o m a n n i n e 2 2 1 0 1 3h s c c c 在木脂素中的应用 木脂素一般存在于植物的木质部和树脂中 所以称为木脂素类 l e e 等以 正己烷 甲醇 水 6 5 5 以1 5 0 0 r p m 的转速在8 0 m i n 内从江花五味子果实核 浙江大学硕士学位论文徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究 的乙醇萃取物中分离了2 个结构十分相似的木脂素的成分一s c h i s a i i l l e n d 和它的 乙酸化物 2 引 以氯仿 甲醇 水的溶剂系统从西伯利亚人参的根中分离得到了纯 的e l e u t h e r o s i d e 2 4 1 n i t a o 等t 2 5 1 于1 9 9 1 年主张用正己烷 乙腈 乙酸乙酯 水 8 7 5 1 的两相系统从m a g n o l i av i r g i n i a n 中进行n e e l i g n a n s 的最初纯化 它比 传统的柱色谱更快 更有效 更经济 0 1 4 h s c c c 在香豆素类中的应用 香豆素及其衍生物广泛分布于植物界 曾用氯仿 甲醇 水 1 3 2 3 1 6 的两相系统 一次进样4 4 0 m g 来自于l o m a t i m md i s s e c t u m 的样品 得到了3 个香豆素的糖苷和1 个黄酮糖苷 2 6 用氯仿 甲醇 水 1 3 7 8 的两相体系分离 并分析了香豆素混合物中的甲醚散形酮 7 甲氧基 香豆素 7 羟基 6 甲氧基 香豆素和7 羟基 香豆素 2 7 俞维乐等1 2 8 1 1 9 9 5 年从a r t e m i s i ad a l a i l a n a a ek a r a s c h e n 中以氯仿 甲醇 水 2 l 1 分离出了纯的7 羟基 6 甲氧基 香豆素以及 i s o f r a x d i n 和t a x a x e r y l a c e t a t e 达到了很好的分离效果 综上所述 h s c c c 在天然产物中的分离制备是很成功的 进样量可从毫克 级到克级 进样体积可从几毫升到几十毫升 不但适用于非极性化合物 而且 适用于极性化合物的分离 它可用于天然产物粗提物的去杂 也可用于精制 甚至直接从粗提物一步纯化到达纯品 o 2 高效液相色谱法 h p l c 高效液相色谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c 是2 0 世纪6 0 s 末 7 0 s 初发展起来的一种分离分析技术 它是在经典液相色谱基础 上 引入气相色谱的理论 在硬件上采用了高压泵 高效固定相和高灵敏度检 测器等 因而具备速度快 效率高 灵敏度高 操作自动化的特点 尤其适合 于挥发性低 热稳定性差 分子量大及离子型化合物的分析 2 9 1 根据h p l c 在 植物化学研究中的样品处理量和工作目的 可分为分析型和制备型两类 0 2 1 分析型高效液相色谱 分析型h p l c 以分离和定性为目的 所使用的色谱柱内径一般为2 i 5 r a m 柱长l o 3 0 c m 最大进样量小于l m g 进样体积为5 p l 左右 流动相流 速为0 8 1 2m l m i n 分析型h p l c 已广泛用于天然产物的分析 成为中草药 有效成分 食品化学成分和保健功能因子含量测定 纯度鉴定以及质量监控的 浙江大学硕士学位论文 徐维娅 色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究 常用手段 2 j 0 2 1 1 分析型h p l c 在类黄酮中的应用 类黄酮的h p l c 分析通常用反相c 1 8 色谱柱 由于黄酮分子中存在酚羟基 流动相中加入少量的酸可改善峰形 陈晓岚等 3 0 使用o d sc 1 8 柱 4 6 2 5 0 r a m 5 岬 流动相为甲醇 0 1 的磷酸二氢钠水溶液 6 5 3 5 检测波长3 6 0 n m 测定银杏黄酮浸膏中槲皮素和总黄酮的含量 周欣等 3 1 悃甲醇溶解 加盐酸水 浴回流水解银杏叶提取物 用t w gc 1 8 4 6 1 5 0 m m 柱 流动相为甲醇 水 磷 酸 5 0 4 9 8 0 2 检测波长3 6 0 n m 分离银杏叶提取物中类黄酮 并测定其中 槲皮素的含量 邬建敏等 3 2 用甲醇浸提 用w y gc 1 8 色谱柱 以甲醇 水 磷酸 6 0 4 0 o 5 为流动相 以2 5 4 n m 为检测波长 测定了1 0 种竹子的叶 枝中 的黄酮化合物总量芦丁含量 测得竹叶中黄酮总量在5 9 1 3 1 m 毫 g 竹枝在 1 3 4 3 m g 幢 张廷之等 3 副用z o r b a xc 1 8 柱 4 6 2 5 0 r a m 流动相为甲醇 水 冰乙酸 4 0 6 0 2 检测波长2 8 0 n m 以芦丁为参照物 辅以二极管阵列检 测技术 测定了毛竹叶中总黄酮的含量 王萍等p 4 j 用y w g c l 8 柱 4 6 1 0 0 m m 1 0 岫 流动相为甲醇 水 o 2 m o l 几 h 3 p 0 4 o 5m o l lkh 2 p 0 4 8 0 1 2 0 l 8 的溶剂系统 检测波长2 8 0 n m 采用梯度淋洗法 使水飞蓟素中的7 种主要成分得到完全分离 胡敏掣 1 用 r p h p l c 等梯度洗脱的方式成功地分辨出银杏叶1 7 个黄酮糖苷 并定量分析 了7 个主要糖苷 含4 个独特结构和活性的桂皮酰黄酮糖苷 的相对含量 陈发奎掣 佣三维h p l c 法测定了牛黄解毒片中黄芩苷的含量 在i n t e r t s i l o d s 柱上 以含醋酸的乙睛 水系统线性梯度洗脱 绘制三维谱图 由峰形 峰位确定图谱中指标成分的吸收峰 按标准曲线 由峰面积计算含量 p i e t t a 等口7 在n u c l e o s i l1 0 0c 1 8 柱上 以o 5 h 3 p 0 4 m e o h t h f 梯度洗脱 5 0 m i n 分 离了1 5 个银杏黄酮化合物 6 个化合物由标准品对照确认 其他由u v 或可见 分光光度计及二级管阵列检测器 p d a 确定 0 2 1 2 分析型h p l c 在其它天然产物的应用 有关h p l c 分析其它天然产物的文献报道非常多 如刘巍等 3 3 埘苔素内酯 及其有关甾族化合物进行衍生后 分别用紫外 荧光 电化学检测器进行检测 的h p l c 分析法 吕光华 等用i i p l c 法测定了十大功劳属植物中豹7 种生物 碱成分 原源掣4 0 用h p l c 法测定酸模属植物根中活性成分一酸横素的含量 塑鋈奎兰婴主堂些堡兰堡丝丝 鱼堂垫查塑垡窒鳖垄笪生塑墼塑壁坌坌塑 竺壁旦里窒 李蔚等 4 用h p l c 对以白芍为主要原料的保健食品中芍药苷的含量测定 杨枫 等f 4 2 用h p l c 法测定西洋参蜂王浆口服液中的人参皂苷与癸烯酸等 o 2 2 制备型高效液相色谱 制备型高效液相色谱 p r e p a r a t i v eh i g h p e r f o r l l a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y p h p l c 是在传统分析型h p l c 的基础上发展起来 以分离 获取大量的单组分为目的的一种高效分离纯化技术 根据制备量的大小又可以 分为两种类型 一种是将分析型h p l c 按比例放大 操作参数与分析型大致相 同的半制备型h p l c 其所用色谱柱内径为8 1 0 m m 柱长2 0 5 0 c m 进样 体积o 2 2 m l 流动相流速为3 5m l m i n 一次制备量在毫克数量级 另一 种是专用制备型h p l c 其色谱系统及操作参数与分析型h p l c 有较大的差别 所用色谱柱内径在l o m m 以上 流动相流速在5 5 0 m l m i n 左右 一次制备量可 高达1 0 0 0 m g 4 3 1 由于技术上的原因 长期以来p h p l c 的进展比较缓慢 随着 理论研究的深入 新颖的填料 新的填充方法以及在仪器和流程上的进展 近 年来p h p l c 获得迅速发展 从直径1 0 m m 的实验室半制备到直径5 0 0 m m 的工 业制备柱及其相应的设备相继商品化 解决了多方面的分离纯化问题 4 4 1 作为 一种制备手段 它具有分离条件温和 分离检测过程中一般没有样品损坏 易 于原物回收 且装置简单有效等优点 天然产物研究中面临的一个主要方面就是从天然植物中分离纯化鉴定化合 物 p h p l c 在天然产物研究领域广泛应用的原因 4 4 1 化合物结构鉴定仪器 的发展 使结构鉴定所需的样品量越来越少 一般只需几到几十毫克就可解决 由p h p l c 得到毫克级的样品是非常容易的 2 天然产物化学经过多年的研究 各种药用动植物中含量较高的成分大多已被分离和研究 而含量较少的成分由 于分离方法的限制不易获得 而p h p l c 方法则非常适合于分离纯化含量较低 的成分 3 p h p l c 在分离纯化水溶性成分时有较大优势 0 2 2 ip h p l c 在类黄酮中的应用 h p l c 在不同植物黄酮分析中的应用已相当成熟 而用其来制备类黄酮虽 有一定的研究 但仍不成熟 戴军 王洪新等 4 5 应用s p h e r i s o r b c 6 h 5 色谱柱 8 3 0 0 m m i o m 流动相为甲醇 水 1 4 8 6 v v 检测波长5 4 0 n m 成功地 分离和制备了芦苇叶中的类黄酮 并进行了定性和定量分析 h u c hc h r i s t i a w 等 4 6 用p h p l c 从樱草花中分离了单 双 三 五 4 种甲氧基黄酮 制备量 塑坚奎兰堕主兰垡笙苎堡堡丝 鱼塑垫查塑垡壅鲨垄笪 堡里塑壁坌坌蛭 塑窒里堕壅 分别达到了8 9 8 1 2 m g 邹耀洪等1 47 j 用l i c h r o s o r br p 1 8 色谱柱f 8 0 3 0 0 m m 1 0 m 流动相为c h 3 0 h h 2 0 h c o o h 7 5 2 5 0 8 v v 检测波长 3 3 0 n m 从杨梅叶中分离和制备了4 种黄酮醇苷和1 种黄酮醇 用 s p h e r i s o r b c 6 h 5 色谱柱 8 3 0 0 m m 1 0 p r o 流动相为甲醇 水 1 4 8 6 进行制备 定时收集检测器出口组分 并用p d a 检验收集液纯度 从甘薯叶黄酮中分离 纯化制备了4 种黄酮单体 4 8 同时用流动相为甲醇 水 1 5 8 5 v 检测波长 3 4 0 n m 光谱采集 1 9 0 6 0 0 n m 从箬竹叶中分离制备了8 种黄酮类化合物 4 9 1 0 2 2 2p h p l c 在其它天然产物制备研究中的应用 徐光国1 5 0 运用国产y z s 3 型液相制备色谱仪分离制备了抗癌药葫芦素b 标准品 茯苓三萜酸成分和金银花中的主要成分绿原酸 陈若芸等1 5 1 用 p h p l c 制备了灵芝中的三萜类化合物 张仁斌等吲用p h p l c 对青藩素异构体 进行了分离制备 贺贤国等 5 3 用p h p l c 制备了芫花甲酯 陈波等 蚓用p h p l c 制备分离纯化菊苣酸标准对照品 于志强等1 5 5 利用正相高效液相半制备色谱制 备了新地质卟啉化合物 雷历等 5 6 利用反相制备高效液相色谱结合溶剂萃取 大孔吸附树脂柱色谱和葡聚糖凝胶l h 2 0 柱色谱方法 从管花肉苁蓉的乙醇提 取物中纯化制备了苯乙醇苷类化合物 松果菊苷的标准品 纯度可达9 8 以 上 近几年来 p h p l c 技术在制备高纯度生物活性物质的方面有了长足的发 展 有关报道不断出现 如h a t c h 等 5 7 1 对牛血清蛋白 铁蛋白等进行了制备分 离 制备量达数百毫克 c i l d e n a s tt h o m a s 掣5 8 悃p h p l c 和半制备h p l c 从 人角质层脂肪中分离出神经酰胺单体 王学彤等 5 9 用反相高效液相色谱法分离 制备了鱼油中的e p a 和d h a 周海欧等 6 0 用美国b e c k m a n3 4 4 m h p l c 进行 了鹿茸中多肽的分离制备 0 3 极谱和伏安法 极谱法是上世纪二十年代j 海洛夫斯基 h e y r o v s k y 6 l j 所创立的一种电 化学分析方法 基于可还原或可氧化物质在滴汞电极上进行电解的过程中 由于浓差极化而形成电流一电压极化曲线 根据此曲线进行定性 定量 后 来 柯尔蜀夫 1 o 怂o 等1 6 2 把凡是使用微电极以电流一电压曲线为基础来研 究溶液组成的电化学分析方法统称为 伏安法 6 塑垩奎兰堡主兰堡堡苎 笙丝丝 鱼塑垫查塑堡塞鎏堡笪生堡壁塑盛坌坌堑 塑查旦翌壅 随着当今世界科学技术的迅猛发展 对分析化学的灵敏度和分辨率提出 了更高的要求 各种仪器分析技术都得到了长足的发展 电化学方法也是如 此 近年来迅速发展 著广为应用的极谱和伏安法新技术有 溶出伏安法 催化极谱法 交流极谱法 脉冲极谱法 半微分半积分极谱法 放射极谱法 等等 6 3 0 3 1 极谱和伏安法在微量元素分析测定中的应用 极谱和伏安法在微量元素分析测定中应用较多 1 9 8 9 年 李启隆等 6 4 蝽0 用铅 二甲酚橙络合物的极谱行为对食糖中的铅进行测定 发现在铅浓度2 0 x 1 0 4 6 0 1 0 击m o f l 范围内 电流与浓度成线性关系 万渝平 6 5 用示波极 谱法测定6 个不同茶叶样品中的铅含量 并与国标方法一双硫腙比色法进行 对比实验 结果表明该法准确可靠 与国标法相比无显著差异 谢媚等 6 6 在 h c i 酒石酸 抗坏血酸体系中 用催化示波极谱法测定了皮蛋中微量铅 在 此体系中 p b i i 于 0 5 4v 处产生一个非常灵敏的吸附催化波 铅含量在 o 0 2 5 3 1 t g m l 范围内波高与浓度呈良好的线性关系 相关系数 幻为0 9 9 7 6 检测限为o 0 2 5 1 1 9 m l 费俊杰等 6 7 建立了用槲皮索修饰碳糊电极测定痕量铅 的新方法 在0 1 0 m o l l 的甲酸盐缓冲液 p h4 3 中 于 0 1 0 v v s s c e 搅拌 富集 再在 0 7 0v 静止还原4 0 s 后 阳极化扫描 于 0 4 2 v 左右获得一灵敏 的铅阳极溶出峰 最佳条件下 富集不同时间 其二次导数峰电流与p b 2 在 1 0 x 1 0 8 8 0 1 0 7 m o l l 和2 0 l f f 9 6 o 1 0 8 m o l l 两个浓度范围内呈线 性关系 检出限为8 0 1 0 o m o l l 徐泽民等 郁 采用示差脉冲阳极溶