肿瘤干细胞的分选技术.docx

肿瘤干细胞的分选技术引言肿瘤干细胞是在最近的十年间成为癌症研究的热点领域的，然而它并非是一个全新的概念，最早关于肿瘤干细胞的假设可以溯源至百年以前。虽然最近数十年间也有对肿瘤中存在“干细胞”的推断，但长时间地停留在没有充分实验证据支持的假说阶段。直到上世纪九十年代，Dick和他的同事们分离纯化出CD34+CD38-表型的白血病肿瘤细胞，才首次验证了肿瘤干细胞的理论。肿瘤干细胞的发现是肿瘤和干细胞领域多年研究积累、汇集的成果，而其中有一项实验技术的贡献非常关键，也即本章所讨论的细胞分选技术。众所周知，肿瘤并非是一群混沌的细胞，而更像是一个畸形的器官，构成肿瘤的细胞群体非常地多样和复杂，也即肿瘤异质性理论所表述的内容。然而，要将肿瘤的各个细胞群体分离出来研究其特性，缺少细胞分选技术的介入恐怕是非常困难的。事实上，肿瘤干细胞的研究更好地诠释了肿瘤的异质性，并且也可能是肿瘤领域将细胞分选技术运用得淋漓尽致的典范。细胞种类不同，分选技术的内容也是非常丰富，因为细胞分选就是基于细胞的各种特性。目前分选技术的运用大致可以归入这样几类：一、针对细胞的物理特性，比如细胞的大小，密度，粘附性，折光性，携带电荷等，包括密度梯度离心，荧光激活细胞分选和细胞电泳等方法；二、针对细胞的表面抗原表型，通常可以采用荧光激活细胞分选、免疫吸附和免疫磁珠分离法；三、针对细胞的功能特性，如染料外排，钙离子浓度，pH，荧光蛋白表达，目前最常用的是依靠荧光激活细胞分选。本章内容将简介常规细胞分选的工作流程，重点介绍目前应用较多的分选策略。一/ 肿瘤样本取材和细胞分离无论采用何种分选方式，分选之前的工作内容是相似的。流程的第一步是从获得肿瘤标本。绝大部分研究的样本都采集自外科手术，因此应获得伦理机构的许可和患者的知情同意文件，并记录患者的详细资料和核实最终的病理诊断结果。一般认为，从手术中获得的样本到细胞分选的时间越短越好，故取材时必须与手术医生配合良好，取得标本后应尽早置于低温(4C或冰上)。通常在肉眼下，即可观察到肿瘤各部分组织具有一定异质性，取材应获取代表性的瘤块，并尽量避开坏死的区域。样本可浸入RMPI1640和M199等培养基或Hanks平衡盐溶液，可参考所研究肿瘤的特性选取。一般情况下，低Ca2+浓度可减少细胞损伤和细胞间粘附，有利于下一步细胞分离；另外，HEPES缓冲体系多用来平衡体外环境的pH，抗生素的加入可以抵抗可能的污染。这样取得的样本一般可直接进入实验室行下一步分选，亦有研究者采取先异种移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠然后再行细胞分选的策略。细胞分选的必要条件是制备单细胞悬液并尽可能地保留细胞的活力和功能状态，这一点对血液肿瘤不是问题，而对实体肿瘤而言可能是主要障碍。不同肿瘤采用的分离手段都不尽相同，但一般采用机械分离加酶消化的方法。瘤块可以置于低温Hanks液中充分洗涤并用锋利的器械切割成24 mm的小块，然后将小瘤块至于37C含有消化酶的培养基中并适当的振荡，同时保持稳定O2、CO2和pH。酶的使用至关重要，不恰当地使用可能导致细胞无法分离或是消化过度，而后者的结果可能是细胞表面蛋白的丢失和细胞损伤。一般常用酶的消化能力由强到弱的排序依次是胰蛋白酶(Trypsin)，木瓜蛋白酶(Papain)，弹性蛋白酶(Elastase)，透明质酸酶(Hyaluronidase)，胶原酶(Collagenase)II、I、IV、III，离散酶(Dispase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)I。各种消化酶，各有优缺点，一般来说，效果较强的酶可能造成细胞损伤，效果较弱的酶对细胞损伤相对较小。粗制的酶效果较强，选择性差，精制的酶效果较弱，特异性好，毒性小。从近年的文献报道来看，组织分离中胰蛋白酶使用较少，而胶原酶使用较多，尤其对细胞表面受体损伤较小的IV和III型胶原酶。另外胶原酶可以联合其他的酶使用以发挥最好的效果，如透明质酸酶可以增加结缔组织细胞间基质的解离，离散酶可以促进成纤维细胞的解离等。胶原酶的作用时间可以很长，可大于48小时，但近来文献多报道酶的作用时间在2-4小时，以肿瘤类型不同而有所差异，在肝癌组织中(IV型胶原酶100IU/ml)甚至有15分钟见效的报道。酶作用之后的组织消化液一般需要通过40-100 m的筛网以除去未消化完全的团块，沉淀细胞，除去上清，使细胞重悬于合适的培养基或平衡盐溶液。操作过程要注意动作轻柔，沉淀细胞可以通过重力沉降或低速离心的方法，但需注意高速离心可能造成脆弱的细胞破裂。收集到的细胞可以做计数和做活性染色，可以得到细胞的得率和存活率，这通常是必要的，有助于整个实验过程的质量控制。事实上，分离得到的细胞的得率和存活率通常是不可兼得，只能追求一个合适的平衡点。对于肿瘤干细胞的研究而言，对细胞的活力的要求是相当苛刻的，因为这将直接影响成瘤实验的结果。二/ 荧光激活细胞分选流式细胞仪的基本原理流式细胞术 (flow cytometry)是一种检测流体状态下的细胞或颗粒特征的技术，它可以在细胞流通过光电检测装置时实时地分析细胞的多个参数，包括细胞大小，颗粒度，荧光染色，免疫荧光标记等。荧光激活细胞分选 (Fluorescence-activated cell sorting，FACS)则是特殊的流式细胞术，需要在专门的流式细胞仪上进行细胞分选的操作，流式细胞仪种类很多，图1是其中一种可用于细胞分选、分析的大型流式细胞仪。图1 Beckman Coulter 公司Epics Altra型流式细胞分选分析系统荧光激活细胞分选术是融合了光学，物理学，电子学和生物学多个学科知识的产物，其研发历经二十余年，到目前还在不断地改进以适应生物医学研究的需要。流式细胞分选仪基本可以分为三大系统，即流体学系统 (fluidics)、光学系统 (optics)和电子系统 (electronics)，其产生也是由这三部分的技术并行地发展而造就的。读者可以通过回顾流式细胞分选仪的发展历程来了解其系统的构造和细胞分选的原理。流体系统的基本作用是带动单个细胞快速地通过检测器并把相应的细胞从中分离出来，该系统的发明和目前仍广为使用的Coulter血球计数仪密切相关。Coulter机器体现了现代流式细胞仪的几个基本思想：把细胞的特征(通过Coulter裂孔测得的电阻代表细胞体积)转化为电信号，快速并逐一检测单个细胞，并自动化地处理大量的细胞信号。有趣的是，当时Coulter机器上检测到血液中存在两群体积大小不同的红细胞，Fulwyler等为了研究红细胞是否大小均一的问题时想到了首次采用了分选红细胞的办法，并造就了第一台流式细胞仪的原型(同时证明了红细胞双峰现象是伪象)。他在Coulter计数仪上引入了喷墨打印机的喷墨技术，其基本原理仍然沿用至今：高频振荡的喷嘴，将流动室流出的水柱断裂成均匀的水滴(drop)，根据Coulter 机器所检测的细胞大小的信号来使包含特定细胞的水滴带电，再利用偏转板形成的高压电场使其下落方向发生偏转，并落入相应的收集管中。另外，Crosland-Taylor利用层流原理，让微小的细胞流束包裹在大量鞘液流中，从而使其“聚焦”于整个流体的中央，使细胞快速、单个地流动，解决了多个细胞同时通过检测口带来错误信号的问题。至此，这两个发现奠定了流体细胞分选的基石。然而，Coulter机器并没有真正的发展成为实用的流式细胞分选仪，可能的原因也许是它仅仅只能获得细胞体积的信号，应用的范围受到了限制。在生物医学研究中，用显微镜来仔细观察细胞的形态特征并获得非常精细的图像显然是最经典的方法，但是要用这种方式来分析记录大量的细胞的特征则耗时费力。事实上，早在Coulter机器之前，很多学者就在考虑用一种“流式系统”来弥补光学显微镜动态能力上的不足，而且随着荧光染料和单克隆抗体研究的发展，这种需求终于促成了现代流式细胞仪的诞生。上世纪六十年代以后，洛斯阿拉莫斯实验室的Marvin Van Dilla和斯坦福大学的Herzenberg 教授各自引入了光学及电子系统的设计发明了用荧光来检测分选细胞的方法，荧光激活细胞分选这个术语即是由Herzenberg 教授创造，而他也因在这个领域的重要贡献获得2006年京都奖。概况的说，流式细胞仪的光学和电子系统的工作方式就是将激光束持续入射到液流中，当细胞或颗粒快速通过激光束时，会产生前向散射光(Forward scatter)、侧向散射光 (Side scatter)和多种波长的荧光，这些光信号经过透镜和滤镜组之后被光电倍增管等电子系统分别接收并转换为电子脉冲。而分选系统再根据这些信号和操作时的设定参数(门的设置)决定给特定细胞的液滴带上不同的电荷使其被分选出来(图2)。图2 流式分析原理图荧光激活细胞分选的应用是非常广泛，因为细胞流式术可以检测的细胞的多种参数，如细胞的大小(前向散射光)、细胞的颗粒度(侧向散射光)、荧光染料的染色深浅、免疫荧光的抗体标记和细胞内的荧光蛋白量等。从分选的方式上来讲，可以正性选择(阳性标记的细胞)，可以负向选择(阴性标记的细胞)，亦可以同时选择两个甚至多个细胞群体(视具体机器功能)。再肿瘤干细胞的分选中，应用较为广泛的是利用免疫表型的分选和利用Hoechst 33342拒染特性的侧群细胞分选。免疫表型的荧光染色免疫表型检测是从血液学和免疫学研究中发展起来，原理就是用荧光染料偶联的抗体标记细胞膜表面的分化抗原。通常免疫荧光标记的方式包括直接标记和间接标记，一般流程如图3所示.具体的细节由分选的细胞和操作者的习惯有所不同，本章中着重介绍实际操作中的一些体会与经验，与同行交流、供读者参考。图3 免疫表型的荧光染色流程首先，一般来说，整个抗体标记反应必需在冰浴上进行，洗涤、离心等步骤也要保持低温。这样有助于增加细胞的存活率，而且低温下细胞膜的内吞活动大大减少，有利于抗原表位的检测。细胞始终处于合适的平衡盐缓冲液如Hanks液，磷酸盐缓冲液等，其中添加适度(2%)的血清可以减少细胞损伤和损失。承载细胞悬液的容器宜选择聚丙烯材质的离心管，可以减少频繁离心洗涤过程中细胞的损失。其次，封闭液中要包含第二抗体宿主(动物)的免疫球蛋白，主要防止细胞表面Fc段的受体非特异性的吸附抗体，这对血液中的单个核细胞尤其重要，长期培养的实体瘤细胞系可以视具体情况而定。如果用间接法标记，第二抗体应尽量选择F(ab)2段的抗体。再次，一般情况下，直接标记法操作简单，染色效果更佳，也更有利于保持细胞活性，但是在多色标记的情况下，研究者务必先考虑好联合使用的方案(主要是针对拟使用的流式细胞仪的激光器、荧光通道选择可以搭配使用的不同荧光素标记的抗体)再购买抗体。间接标记法使用灵活，可以搭配不同的一抗，有利于在研究初步检测和摸索条件，需要注意两点：一是一抗、二抗之间的宿主免疫球蛋白的交叉反应，而是不同激发波长、发射波长的二抗标记荧光素。另外，在分选过程中，免疫荧光标记必须有足够的分辨率，也即阳性细胞的荧光强度高，而阴性细胞的背景荧光弱。这与抗体的质量和使用的浓度相关，抗体浓度过高在背景荧光过强，浓度太低则阳性信号太弱。一般供应厂商会提供参考的抗体工作浓度(抗体稀释度)，但事实上在使用时要自己摸索最适条件。对直接标记的荧光一抗，一种可靠的方法是设立阳性和阴性对照，倍比稀释抗体测定不同浓度下阳性细胞群(signal)和阴性细胞群(noise)的平均荧光强度的比值(S/N)，以S/N比值大为优。质量优异的抗体可以在0.01-1.0g/ml的浓度下得到S/N 3的效果。一般情况下，0.5 g的抗体(免疫球蛋白)即足够用于100l悬液中的1106个细胞。侧群细胞检测的Hoechst 33342染色侧群细胞(side population，SP)是一群具有外排染料特性的细胞群，在多种正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞系中都可检测到，分选到的侧群细胞中富集了正常干细胞或肿瘤干细胞。侧群细胞在组织或肿瘤中的含量极低，得名的来由是在Hoechst 3334染色的流式图上显示这一小群细胞出现在主群细胞的侧方(图4)。Hoechst 33342是一种活细胞的荧光染料，结合于DNA小沟中富含AT的区域，能透过正常的细胞膜进入细胞核使DNA染色。侧群细胞能拒染Hoechst 33342的原因是该群细胞能通过细胞膜上的ABC泵(ATP binding cassette transporter)外排染料，有多种ABC家族成员和侧群细胞有关，研究的较清楚的是ABCG2和ABCB1，其中ABCG2被认为对Hoechst染料的外排能力最重要。目前对侧群细胞和肿瘤干细胞关系还存在一些争议，已有人认为肿瘤组织或肿瘤细胞系中SP细胞并非肿瘤干细胞，至少有些肿瘤是这样1，常规SP细胞分选流程如下：【试剂和器具准备】试剂准备：1含2%胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Sigma)培养基；2Hanks平衡盐溶液(Invitrogen)31M HEPES溶液(Sigma)；4200 g/ml PI(100)溶液(Sigma)；51 mg/ml Hoechst33342(200)溶液(Molecule Probes, Invitrogen)；65 mM verapamil(100)溶液(Sigma)仪器、器具：配备351 nm紫外激光光源和488 nm激光光源的流式细胞分选仪，450DF，610DCLP和675ALP滤片37循环水浴，50ml聚丙烯离心管(Corning)，无菌流式管(BD Bioscience)，细胞计数板和滤网等【染色步骤、上机分选】1细胞染色：(1)培养的细胞用胰酶消化，用37含2%胎牛血清DMEM重悬后计数；调整细胞悬液浓度约为1106/ml，加入50ml离心管，分别设分选组和对照组。(2)两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为5 g/ml，对照组还需加入维拉帕米，使终浓度为50 M；37水浴避光孵育90 min；孵育过程中要间隔一定时间摇晃孵育管。(3)孵育结束后，立即4离心细胞(或冰上急冷后离心)，用冰预冷Hanks液重悬细胞；加入PI使终浓度为2 g/ml，细胞悬液过滤网。2. 流式细胞仪检测：Hoechst33342用紫外激光激发，450nm滤片接受Hoechst蓝光，675ALP接受Hoechst红光。选取线性信号，做Hoechst red(X轴)和Hoechst blue(Y轴)二维散点图，将Hoechst Red及Hoechst Blue弱信号且verapamil对照组缺失的区域设定为SP细胞的门，计算百分比。分选出SP细胞及Non-SP细胞。仪器具体操作按仪器使用说明、在专业操作人员指导下进行。图4 人乳腺癌MCF-7细胞的SP分选红色表示SP细胞，绿色表示non-SP细胞，抑制剂Verapamil处理后SP细胞减少侧群(SP)细胞的染色方法是由Goodell等2建立的，其实验室的网络站点亦提供详尽的技术方案。起初SP分选集中在骨髓中的造血干细胞，后来才引入肿瘤细胞的研究，其中Goodell2，Kondo3和Patrawala4等几个小组的研究报告都可供参考。SP的染色过程比免疫荧光标记操作步骤少，概括地说就是将消化或分离好的单细胞悬液在含有Hoechst 33342的培养基中温育一定时间后上机检测，但是整个染色的过程受到很多因素的影响，所以并不简单。根据文献的报道和笔者的经验，值得注意以下几点：1. 严格控制染色的温育时间，温度和Hoechst 33342的最终浓度。大多文献报道温育时间是90分钟，温度是37 C(最好是恒温循环水浴)，Hoechst 33342的终浓度是5 g/ml。温育结束后应迅速低温下离心，重悬于不含酚酞的Hanks液或磷酸盐缓冲液并置于冰上。一般认为控制温育条件可以稳定Hoechst染料的荧光强度和ABC泵外排的能力，而温育结束后迅速置于冰上可减少非特异的染料外泄。由于Hoechst的荧光信号强度可代表DNA含量，笔者判断染色和光路效果较好的粗略标准是Hoechst 33342蓝色荧光的直方图可清晰观察到主群细胞的G1期、S期、G2/M期组分。2. ABC泵的外排能力依赖ATP水解时释放的能量，温育时应选择合适的培养基如DMEM或RMPI1640等，一般添加2-5%的血清。另外，温育最好在50ml以上的聚丙烯离心管内进行，对照组和实验组细胞悬液的体积也最好相同，细胞密度应控制在106个细胞/毫升。3流式分析图中SP的门设置依照ABC泵抑制剂处理组中消失细胞的区域，ABC泵抑制剂一般可选择维拉帕米(verapamil)，Fumitremorgin C(FTC)和利血平(crystoserpine)，应当注意维拉帕米和FTC对SP的抑制效率是不同的，维拉帕米主要针对ABCB1，而FTC则是ABCG2特异性的抑制剂。抑制剂处理组的主群细胞流式在图上的位置也会略有偏远，表示染色强度会稍有增加。 4SP检测对光路的要求很高，操作者必须每次开机时用标准微球检测光路，特别是紫外激光的状态。由于流式细胞仪的机型差异，在不同光源和滤片设置下SP区域在流式图上的位置和形态可能会差异较大。Hoechst33342的最佳激发波长在350nm左右，发射光最强在440nm左右。推荐的配置需要装备水冷的紫外激光光源，功率调整到60-100mW间，但也有文献报道使用407nm的固态紫色激光源。5对直接从组织中分离到的细胞进行SP分选的难度较大，因SP检测对细胞活力的要求更高，目前文献中SP分选多在肿瘤细胞系中进行。如要进一步进行免疫表型标记，可在温育之后冰上进行。要注意的是如果紫外激发光很强，Hoechst蓝光发射波段可能会干扰FITC或EGFP的检测，因此要调整好荧光补偿或事先设计更好的光路方案。流式分选的常见问题一般研究者不需要详细掌握上机分选的细节，但是了解以下的一些问题有助于更好地进行前期准备和分选后的功能研究。1在准备流式分选以前，需要了解所要标记的膜抗原的表达水平和实际组织或细胞系中标记阳性细胞的大致比例，这对下一步的分选非常必要。通常可以通过组织切片和细胞爬片的免疫组化来来确认，表达过于微弱的膜抗原可能是不适宜作为分选标记的。2整个分选过程的操作步骤繁多，会不可避免地丢失细胞或损伤细胞，特别需要注意的是最后收集到的细胞数一般会与理论的分选得率有较大差异，原因在于接收细胞时细胞会附着于管壁丢失或死亡，而且由于分选纯度的设置，机器会丢弃一部分包含阳性细胞的液滴。要分选到足够进行下一步实验的细胞，除了需要综合考虑目标细胞的比例和总细胞的数量外，还要估计到细胞损失，一般收集到的存活细胞可能只有50%左右。在进行下一步实验前，对收集到的细胞计数是比较稳妥的办法，但要注意如果分选到的细胞数极少(1/3体积)，并培养基中加入20%的胎牛血清。分选一般都在低温下进行，收集完之后要立即使细胞恢复到正常培养环境。4. 目标细胞群比例低于1%时，分选难度会比较大，主要是降低分选的纯度和延长分选的时间。目前主流的流式细胞分选仪的峰值速度都在每秒104的数量级，但计算上阳性细胞的比例后仍然是很低的，况且全速运行会降低分选细胞纯度。肿瘤干细胞的比例通常都比较低，有时可能需要采用磁式分选预先富集的策略。5. 要确定分选到的细胞的纯度，可以简单的将分选收集到的细胞重新上机分析，一般可以获得大于95%的纯度。在目标细胞群比例极低的情况下，保证纯度是比较困难，这种情况需要对目标细胞进行预先的富集。三/ 免疫磁性细胞分选免疫磁性分选法的原理是将某种抗原的特异性抗体偶联到特制的磁性微体上，在细胞与磁体混合时，磁体通过抗体的作用结合到表达相应抗原的细胞的膜表面，当磁体标记的细胞通过磁场时，细胞因磁性作用而被吸附，当磁场解除后，标记的细胞就可被洗脱而分离出来。与流式分选技术相比较，磁性分选的方法不需要昂贵的设备和专业的技术，几乎所有实验室都有条件开展；操作也非常简单，而且分选的时间短有利于保持细胞活力；从分选的纯度上，磁性分选也只是稍稍逊色。因此这项技术颇受研究者青睐，已经成为细胞分选中应用的主流技术。免疫磁珠的标记方法可以分为直接标记和间接标记。直接标记就是厂商已直接把单克隆抗体偶联到磁珠上，使用时只需把细胞和磁珠混合孵育后就可过柱分选。但是一般直标的磁珠种类有限，通常都是常用的抗体如CD34、CD133等等。间接标记是把首先对细胞进行普通的一抗标记，然后再与偶联二抗的磁珠混合。间接标记的方法更加灵活，对部分表达微弱的抗原还能增加磁性吸附的作用。实际上，由于依赖特殊的磁珠，磁性分离法的研发基本上依靠厂商推动，技术方案上研究者也只能亦步亦趋。关于具体的操作方案，各家厂商都在网站上都提供详细的技术资料，本章只择其要点而不一一赘述。从直观的操作方式给免疫磁性分选法分类，大致可分为依赖分离柱和非依赖分离柱两类。依赖分离柱的的磁性分选法的特点是使用磁性微珠和特制的分离柱，经典代表是MACS系列产品，其注册商标MACS(Magnetic-activated cell sorting，磁性激活细胞分选)几乎成为免疫磁珠分离法的代名词。MACS分离柱是类似注射器针筒的塑料容器，但是填充有不同规格铁珠，装置于配套的永磁体后柱体内即能形成高强度的磁场。MACS 的磁珠由多聚糖和氧化铁构成，直径约50nm，论体积仅为细胞的 百万分之一，但经过分离柱的磁场时细胞即可被小小的磁珠牵附在分离柱上，未结合磁珠的细胞则流经分离柱而进入收集管。将分离柱与磁铁分开，柱中的磁场消失，结合磁珠的细胞就能被洗脱下来。由于有过柱和洗脱的过程，操作相对复杂，新手需要一定的训练。非依赖分离柱的分选的特点是无需分离柱，磁珠和细胞结合之后将细胞悬液管直接置于永磁体形成的强磁场中，标记上的细胞便直接贴附在管壁上，除去上清，洗涤数次后留下的就是标记的细胞，也直接收取上清中的细胞。目前采用这种方式的产品有Dynabeads和EasySep等。由于过柱操作，分选流程上也更加简化，同时避免了过柱的过程对细胞的影响。但是没有分离柱增强磁场的作用，Dynabeads采用体积更大的磁珠(与细胞相仿的数量级)来增强磁性吸附作用，吸附到的细胞进行后续操作前需要将细胞与磁珠解离。 EasySep虽然仍采用了较小的磁性微珠，但宣称能保证吸附的效果。从分选策略上来分类，免疫磁性分选方法有可分为阳性分选(positive selection strategy)，清除分选(depletion strategy)和联合策略(combined strategy)等。简单的说，阳性分选就是磁性标记目标细胞群而富集这些细胞，而清除分选是磁性标记那些不需要的细胞而去除之。联合策略顾名思义就是将前两者综合使用，如在清除分选去掉不需要的细胞之后采用阳性分选获得目标细胞群，或是联合两次针对不同抗原阳性分选的多重分选(MultiSort)。虽然具有很多优点，磁性分选的也有一些比较明显的缺陷，首先是死细胞的非特异性吸附问题，这个问题需要通过分选前预处理来解决。其次分选过程是一个“黑箱”，无法在分选时实时地了解到目标细胞群在总细胞群中的比例，也无从知晓分选后目标细胞在收集到的细胞中的纯度。为了克服这个问题，通常研究者需要对收集到的细胞再做流式检测，也即是用相同抗原荧光抗体去标记收集到的细胞。在产品的选择上，显然各厂家都宣扬自身的优点，研究者也很难对分选的效率和纯度进行绝对的比较。既往来看，MACS应用比较广泛，尤其肿瘤干细胞的文献报道大多采用MACS，而其他的新产品和技术的应用也在不断的增加。客观的讲，具体的方法各有所长，研究者需要对分选的策略(分选阳性细胞或去除阳性细胞)，是否兼容流式检测和减少对细胞影响等因素进行综合考虑。结语细胞分选技术相当丰富，除了在本章中具体介绍的荧光激活细胞分选和免疫磁性细胞分选方法之外，还有很多技术比如密度梯度分离法，免疫淘洗法，亲和层析法和细胞电泳法。随着技术的不断发展，很多方法的使用逐渐地减少了，或者成为其他方法的辅助和补充。在肿瘤干细胞的研究中，流式分选和免疫磁性法占据了主要的位置，这两者方法可以相互裨益，也是目前应用前景最为广阔的分选方法。对比流式细胞分选和免疫磁性分选，毫无疑问后者更经济实用，但是应用的限制也显而易见，也就是每次分选只能依赖于单个膜抗原，而实体瘤干细胞的研究却常常为缺乏膜抗原的表达而苦恼不堪。从这个方面来看，擅长多参数分选的流式细胞仪凸显出它的优势。流式可以检测的细胞特征不仅仅局限于表观的特征，比如细胞大小，某抗原的表达；还可以深入的发掘功能方面的特征，根据染料拒染能力而建立的侧群细胞分选就是最好的例证。随着研究的进展，流式分选所显现出的趋势就是由细胞膜外转入细胞内，有静态的膜蛋白表达发展到检测细胞信号通路的活性和蛋白质的相互作用，而这恰恰是缺乏膜抗原的实体瘤干细胞分选所需要的。这些应用方向的例证包括：用荧光染料Aldefluor检测细胞中ALDH酶的活性，并以此分选乳腺癌干细胞；利用荧光蛋白报告系统来分选Oct-4、Nanog通路被激活的细胞等等。从目前来看，似乎限制流式细胞分选应用的因素并非机器设计，而是缺乏更多有创意的方法。我们还必需清楚，肿瘤干细胞研究中现有的细胞分选方法远非完美，有研究者曾经评价在实体瘤组织中分选肿瘤干细胞“与其说是科学，更像是手艺”。的确，冗长的操作过程中包含了很多无法精确控制的因素，比如酶处理过程中膜蛋白的丢失，分选时细胞活力的下降，这些实验过程本身给结果带来的偏倚程度也殊难判断。因此，我们需要慎之又慎，完善实验的设