酵母菌生产絮凝剂条件优化毕业论文.doc

酵母菌生产絮凝剂条件优化毕业论文目 录 摘 要1关键词11 前言11.1 胞外生物高聚物絮凝剂（EBF）的絮凝作用机理21.2 胞外生物高聚物絮凝剂（EBF）絮凝活性的影响因素31.3 微生物絮凝剂的发展趋势42 材料和方法42.1 菌种42.2 原料与试剂42.3 主要仪器与设备52.4 试验方法.82.4.1培养基的配制52.4.2菌株发酵产絮凝剂条件优化52.4.3絮凝率的测定方法83 结果与分析63.1培养温度对絮凝活性的影响63.2培养基pH值对絮凝活性的影响73.3转速对絮凝活性的影响83.4培养时间对絮凝活性的影响83.5 L9 （34）正交试验优化方案104 结果与讨论104.1 菌株絮凝剂的热稳定性检测 114.2 pH值对絮凝活性的影响 114.3 菌液投加量对絮凝活性的影响 114.4 金属离子对絮凝活性的影响11参考文献12致 谢13酵母菌生产絮凝剂条件优化学 生 ：陈 敏指导老师：管桂萍（湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128）摘 要：本研究旨在对一株酵母菌发酵生产絮凝剂的培养条件进行优化，在单因素试验的基础上采用正交试验，确定了该菌株产絮凝剂的最佳条件为：温度30、pH值5.0、转速160r/min、培养时间72h，其絮凝活性可达21.1%。关键词：酵母菌 ；絮凝剂；正交试验Optimization of the flocculanting conditions of a yeastStudent: Chenmin Tutor: Guan Guiping（Institute of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128）Abstract This study was aimed to optimize the flocculanting conditions of a yeast. By means of Orthogonal Test on the basis of single factor experiment, the test showed that the optimum fermentation conditions as follows: culture temperature 30, pH5.0, rotation speed 160r/min, culture time 72 h. The flocculanting activity could get to 21.1%.Key words Yeast; Flocculants; Orthogonal test1 前言 絮凝剂又称沉降剂，是一类可使溶液中不易沉降的固体悬浮颗粒凝集、沉淀的物质。絮凝技术是目前国内外用来提高水质处理效率的一种既经济又简便的水处理技术。絮凝剂包括有机合成絮凝剂、无机絮凝剂和微生物絮凝剂等多种，其中微生物絮凝剂是利用生物技术，通过生物发酵、抽提、精制而得到的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、无毒、廉价的水处理剂。微生物絮凝剂是天然高分子絮凝剂的重要种类，它是微生物在特定培养条件下，其生长代谢至一定阶段产生的具有絮凝活性的代谢产物和菌体。其主要活性成分是具有两性多聚电解质的蛋白质、多糖、纤维素等1。按照来源不同，微生物絮凝剂主要可分为三类：（1）直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、放线菌、真菌和酵母。（2）利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂。如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等成分均可用作絮凝剂。（3）利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂。微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物，主要成分为多糖及少量多肽、蛋白质、脂类及其复合物。这种分泌到细胞外的具有絮凝活性的高聚物称为细胞外生物高聚物絮凝剂（EBF）2。目前国内外对EBF的研究较多，EBF的结构各异，已知的絮凝剂微观立体结构有两种：（1）纤维状。从苦味诺卡氏菌提取的絮凝剂蛋白质中含有75的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，该絮凝剂可以形成丝绸一样的纤维，是絮凝体形成过程中的颗粒间联结物。（2）球状。从酱油曲霉中获得的絮凝剂中有聚已糖胺、蛋白质、2-葡糖酮酸等3种成分3。1.1 胞外生物高聚物絮凝剂（EBF）的絮凝作用机理 生物絮凝剂具有絮凝活性的有效成分主要是多糖、蛋白质、多肽、DNA和脂类等生物大分子，与其他有机高分子絮凝剂，主要成分、分子结构和所带活性基团相似。因此，水絮凝学中传统的三种絮凝机理：吸附架桥作用，电荷中和作用、网捕卷扫作用和“化学反应”作用，同样适用于生物絮凝剂。（1）吸附架桥作用 絮凝剂大分子在颗粒之间借助离子键、氢键和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒，适宜的条件下产生“架桥”现象，从而形成一种三维网状结构而沉淀下来，“架桥”的必要条件是颗粒上存在空白表明4。该学说可以解释大多数生物絮凝剂引起的絮凝现象，以及一些因素对絮凝的影响，并为一些实验所证实，因此受到人们的普遍接受。（2）电荷中和作用机理 水体中的污染物颗粒和胶体粒子一般带有负电荷，具有链状结构的生物高分子絮凝剂及其水解产物整体表现为带有一定正电荷，靠近这些颗粒物质或者被吸附到胶粒表面上时，将会中和颗粒表面上的一部分电荷，减少静电斥力，从而使胶粒间能发生碰撞而凝聚5。当絮体凝聚到足够大时，在重力作用下沉降下来。（3）网捕卷扫作用机理 当生物絮凝剂投量一定且形成小粒絮体时，可以在重力作用下沉降。在沉降过程中，大量的絮体在拥挤沉降阶段，如同一张过滤网在下降，不断卷扫水中的胶粒及超微细颗粒，最终产生沉淀分离，这种想象被称为网捕卷扫作用6。该作用是一种物理机械作用。当水中胶体杂质浓度很低时，所需絮凝剂量与原水杂质含量成反比，即原水中胶体含量少时，所需絮凝剂量大；反之亦然。（4） “化学反应”作用 生物絮凝剂高分子中的某些活性基团与被絮凝物质的相应基团发生化学反应，聚集成较大分子而沉淀下来。絮凝过程是一个复杂的理化过程，在水处理中常不是单独孤立的现象，而往往是上述机理同时存在、协同作用而最终实现的，只是在某一特定情况下以某种或某几种现象为主而已。1.2 胞外生物高聚物絮凝剂（EBF）絮凝活性的影响因素 （1）EBF絮凝活性的内在影响因素一般来说，相对分子量大的EBF在絮凝过程中有更多的吸附点和更强的桥联作用，因此有更高的絮凝活性。克氏杆菌6产生的絮凝剂分子量超过2106，协腹产碱杆菌7产生的絮凝剂分子量达到2.2106。一些特殊基团由于在絮凝剂中充当颗粒物质的吸附部位或维持一定的空间结构，对絮凝活性有很大的影响，用高锰酸钾处理Asp絮凝剂的已糖胺多聚物部分，使其氧化而释放出氧，活性就消失8。絮凝活性也与细胞表面疏水性有关，处于对数生长后期的细胞，表面疏水性增强，其絮凝活性升高。处理污水可降低微生物絮凝剂的细胞表面疏水性，其絮凝性能会明显下降，而聚合阳离子却可增强细胞表面的疏水性，从而可提高细胞的絮凝活性9。（2）EBF絮凝活性的外在影响因素温度对生物絮凝剂的絮凝活性有明显的影响。絮凝物质结构上含有蛋白质或肽链的絮凝剂都是热不稳定的，高温可使这些高分子物质空间结构改变，导致变性，从而使絮凝活性下降。如芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus spPY90）10和气池中丝状菌（N.amarae）11的絮凝物都在高温下降低甚至丧失絮凝活性。但那些由糖类构成的絮凝剂则是热稳定性的，例如由酱油曲霉（Aspergiilus sojae）12和枯草芽孢杆菌Bacillus spDP-152分泌的絮凝剂都是热稳定性的，在沸水中加热15 min后还能保留最初絮凝活性的50以上13。生物絮凝剂的活性是随pH值的变化而变化的。这主要是因为pH值能通过改变酸碱度来改变絮凝剂大分子和胶体颗粒的表面电荷、带电状态、中和电荷能力，从而影响它们之间的靠近和行为。生物絮凝剂在一定pH值范围内，胶体颗粒的表面电荷有所下降，使得颗粒之间的互相排斥力减弱，从而有利于絮凝剂与颗粒的桥联作用，促成架桥形成和颗粒的沉淀。不同絮凝测pH值的变化敏感程度不同，Bacillus sp.PY一90在酸性条件（pH 3-5）下的絮凝活性很高14，拟青霉菌属（Paecilomyces sp）的絮凝产物在pH值为4-7.5范围内具有最大活性。这是由于pH值影响胶体颗粒表面电荷和微生物絮凝剂的性质、数量，从而影响它们之间的靠近和吸附行为。1.3 微生物絮凝剂的发展趋势鉴于目前国内外的研究状况，微生物絮凝剂的主要发展趋势体现在以下几个方面：寻找快速有效的絮凝剂产生菌筛选方法，将研究范围从目前占主导地位的中温好氧菌扩展到其他种类的微生物，并从系统发育学的角度对菌种筛选进行预测；从生产工艺的角度出发，选用廉价的工业废料作为培养基以降低培养基配制成本，建立高效生化反应器，优化发酵的运行条件，使微生物絮凝剂的生产真正实现产业化水平；加强对微生物絮凝剂的物质结构特性、絮凝特性和絮凝机理以及它在处理不同水质废水时的共性与特性的研究；对絮凝基因进行更加深入的研究，并利用现代分子生物学技术获得的高效絮凝基因，通过转基因技术，构建高产絮凝剂的工程菌；将微生物絮凝剂拓展到概念更广的生物絮凝剂研究范畴，例如Haruhiko Yokoi研究发现，在厌氧条件下肠杆菌Enterobacter spBY-29能够同时产生氢和絮凝剂15；加强微生物产絮凝剂代谢机理的研究，通过对代谢途径和相关酶促反应的分析，提供适宜的培养条件，对絮凝剂的产生进行更加有效的调控。相信随着微生物絮凝剂以及絮凝剂产生菌研究的不断深入，微生物絮凝剂必将冲破发展的瓶颈。实现工业化生产，真正取代无机絮凝剂和有机合成絮凝剂，成为高效、环保的新一代絮凝剂。传统无机及人工合成的有机高分子絮凝剂易引起老年痴呆症和具有“三致”效应，其应用越来越受到限制。微生物絮凝剂是由微生物菌体分泌的生物高分子物质，是一种新型的天然有机高分子絮凝剂。因微生物絮凝剂具有产生菌易得、高效、无毒、不会造成二次污染和絮凝范围广泛等优点，日益受到研究者重视。本试验拟通过优化酵母菌发酵工艺，以期获得生产生物絮凝剂的最佳方案。2 材料和方法2.1 菌种耐高温酵母（由湖南省畜牧研究所提供）2.1主要试剂葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司），琼脂（上海山浦化工有限公司），高岭土，HCl（国药集团化学试剂有限公司），NaOH（国药集团化学试剂有限公司），CaCl2（国药集团化学试剂有限公司），FeCl3（国药集团化学试剂有限公司），MgSO4（国药集团化学试剂有限公司），NaCl（国药集团化学试剂有限公司）等均为分析纯。2.3 主要仪器与设备恒温摇床（上海福马实验设备有限公司，上海新苗医疗机械制造），离心机（华普达，YXJ-2），可见分光光度计（上海元析仪器有限公司，V-5000），试管（北京玻璃集团公司泰州分厂），容量瓶（北京玻璃仪器厂），电磁炉（联创），电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，DHG-9076A），电子天平（湘仪天平仪器设备有限公司，MP-510），电热恒温水浴锅（华普达，HH-60），超净工作台（苏州净化设备有限公司，SM-CJ-1B（U），高压蒸汽灭菌锅（TOMY，SX-500），恒温培养箱（上海博讯实业有限公司）。2.3 试验方法2.3.1 培养基的配制（1）母种培养基：PDA培养基1.培养基成分：马铃薯200g， 葡萄糖20g， 琼脂20g， 水1 L，pH自然2.配制方法：把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入20克琼脂，煮沸溶解后加葡萄糖20克补足水分，分装，灭菌，备用。（2）发酵培养基：PD培养基1.培养基成分：马铃薯200g ，葡萄糖20g， 水1 L，pH自然2.配制方法：把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，补足水分。煮沸溶解后加葡萄糖20克，补足水分，分装，灭菌，备用。2.3.2菌株发酵生产絮凝剂条件优化（1）初始pH值的选择。将培养基初始pH值设为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，测定絮凝率，考察其对絮凝活性的影响。 （2）产絮凝剂最佳时间的选择。考察不同培养时间（36h、48h、60h、72h、84 h）对絮凝活性的影响。（3）产絮凝剂最佳温度的选择。考察不同培养温度（20、25、30、35、40 ）对絮凝活性的影响。（4）产絮凝剂最佳摇床转速的选择。考察不同摇床转速（120、140 、160 、180 、200rmin）对絮凝活性的影响。（5）正交试验设计本次试验采用L9(34)正交试验设计法，它表示需作9次实验，最多可观察4个因素，每个因素均为3水平，以得出最佳的培养条件。试验设计见表1。表1 发酵条件优化正交试验因素和水平设计Table 1 Design table of factors and levels of the fermentation condition orthogonal optimization experiment因子数水平A温度（）BpHC转速（r/min）D培养时间（h）1232530355671401601804860722.3.3絮凝率的测定方法试验用絮凝率来定量表示微生物絮凝剂的絮凝活性。方法如下：在250 mL烧杯中加入150 mL 1gL的高岭土悬浊液，先加入2 mL l的CaCl2溶液，再加入2 mL发酵液，混合、搅拌（以200 rmin快搅1 min，再以50 rmin慢搅3 min），静置沉降3min，取上清液。用721分光光度计在550nm处测其上清液吸光度，以不加培养液的高岭土悬浊液作对比，通过絮凝率来表示絮凝活性，公式如下：絮凝率（E）=（A-B）/A100% 注：A为对照上清液的吸光度；B为样品上清液的吸光度。3 结果与分析3.1培养温度对絮凝活性的影响温度是影响微生物生长发育的重要因素，不同微生物对温度的敏感程度不同。因此考察不同培养温度（20、25、30、35、40）对絮凝活性的影响。由图1可知该菌株产絮凝剂的最佳温度范围在25到35之间。培养温度在30时，絮凝率最高，高温培养时菌株生长快，对菌生长有利，但絮凝活性降低。由此可见温度过高不利于絮凝剂的积累。而温度过低则使菌株生长速度降低酶活性下降，代谢产物积累时间延长，不利于絮凝剂的产生。由此选择25、30和35三个水平做正交试验。培养条件设为：转速均为160 rmin，培养时间均为60小时，pH自然，温度分别为20、25、30、35、40，实验结果如图1所示：图1：培养温度对絮凝活性的影响Figure 1 Effect of different temperature on flocculating activity 3.2培养基pH值对絮凝活性的影响培养条件设为：转速均为160 rmin，培养时间均为60小时，培养温度均为30，培养基初始pH值设为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，实验结果如图2所示：图2培养pH值对絮凝活性的影响Figure 2 Effect of different pH on flocculating activity pH值能通过改变酸碱度来改变絮凝剂大分子和胶体颗粒的表面电荷、带电状态、中和电荷能力，从而影响它们之间的靠近和行为，进而影响絮凝剂的絮凝活性。由图2可知，当初始pH值为6.0时，该菌株生长旺盛且其絮凝活性达到最大值，当pH值为4.0时，菌种絮凝效果极差。pH值超过6.0，絮凝率逐渐下降，菌种生长缓慢。综上可知，该菌株适合在中性偏酸的环境中生长，过酸或过碱都会影响其生长和絮凝剂的产生。由此选择pH值为5.0、6.0和7.0三个水平做正交试验。3.3转速对絮凝活性的影响培养条件设为：培养温度均为30，pH值均为6.0，培养时间均为60小时，转速分别设为120、140、160、180、200rmin. 实验结果如图3所示：氧含量是影响微生物生长的因素之一，不同的微生物对氧的需求量不同，因此考察不同摇床转速（120、140 、160 、180 、200rmin）对絮凝活性的影响。由图3可知，转速在120到160 rmin范围内随着转速的增加，其絮凝活性增加，这是因为转速太低，不利于菌株吸收营养物质，其絮凝活性在转速160 rmin时达到最大值，之后随着转速的增加，其絮凝活性反而降低，说明转速太高不利于菌体产生絮凝剂。由此选择140、160和180 rmin三个水平做正交试验。图3 转速对絮凝活性的影响Figure 3 Effect of different rotation speed on flocculating activity3.4培养时间对絮凝活性的影响培养条件设为：转速均为160 rmin，培养温度均为30，pH值均为6.0，培养时间分别为36、48、60、72、84 h。实验结果如下：图4 培养时间对絮凝活性的影响Figure 4 Effect of different culture time on flocculating activity在试验过程中，为及时了解菌种在培养过程中的生长情况，需定时测定菌体量（以660nm 处的光密度值OD表示）及絮凝效果，以便及时的控制培养条件，获得最佳培养物。图5 生长曲线和絮凝活性对比图Figure 5 The comparison between the growth curve and flocculating activity由图4和图5可知，该菌在培养过程中生长曲线与絮凝活性曲线基本呈平行关系，发酵液的絮凝率随菌生长量的增加同步升高，在菌生长稳定期（72h）达到最高絮凝率，以后随培养时间的增加，菌体生长达到极限后开始下降，絮凝活性虽有下降，但幅度较小。引起絮凝的活性物质可能是由微生物发酵过程中产生的初级代谢产物。通过生长曲线的测定，判定该菌种的最佳培养时间为72h，并由此选择48、60和72h三个水平做正交试验。3.5 L9 （34）正交试验优化方案表2 L9（34）因素水平编码表Table 2 Factors and levels of L9（43）orthogonal test因素温度（）ApHB转速（r/min）C培养时间（h）D实验结果实验1实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9均值1均值2均值3极差11122233315.40018.50016.5673.10012312312317.16717.06716.2330.93412323131216.56717.93315.9671.96612331223117.13316.26717.0670.86615.816.214.220.218.217.115.516.817.4通过正交试验，由表5的极差值可以看出，4种因素对该菌株发酵生产絮凝剂的影响程度为：ACBD，其中培养温度影响最为显著，转速其次，培养时间影响最小。其最佳组合为A2B1C2D1，但正交设计最佳组合为A2B1C2D3，故将两组合进行验证实验，测得组合A2B1C2D1絮凝率为19.8% ，A2B1C2D3组合絮凝率为21.1%，故该菌株发酵生产絮凝剂的最佳组合为温度30、pH值5.0、转速160r/min、培养时间72h。4 结果与讨论 该菌株发酵生产絮凝剂的能力较差，经优化设计后仅达到21.1%。由正交试验可知，影响其絮凝活性的几个因素相互作用较小。为了进一步研究该微生物絮凝剂的稳定性及其絮凝活性的影响因素，对其进行了简单的试验。4.1 菌株絮凝剂的热稳定性检测将絮凝剂的提取液置于100水浴加热30min，絮凝活性下降50%；继续加热至60min后，则絮凝活性不再继续下降。这可能是由于该絮凝剂含有蛋白质，在遇高温时，蛋白质变性所引起的，从而使絮凝活性下降。而继续加热后，絮凝效果不再下降，这说明微生物絮凝剂中还含有一部分多糖物质。由此推断该絮凝剂组成中可能包含一部分热稳定性物质及另一部分热不稳定性物质。4.2 pH值稳定性对絮凝活性的影响经测定，在pH0-14范围内，以相同的2 mL加样量加入高岭土悬浮液，该絮凝剂表现出不同的絮凝效果，在pH0-4范围内其絮凝效果提高很慢，在pH4-7范围内直线上升，而该菌株发酵生产絮凝剂的最佳pH值为6.0，说明在6.0这一点，该菌株生产絮凝剂产量最高，而该絮凝剂活性最高的pH值为7.0，之后絮凝活性又快速下降。4.3 菌液投加量对絮凝活性的影响 在10 mL高岭土悬浮液中加入不同体积的发酵液，以每10 mL投加0.1 mL、0.15 mL、0.2 mL、0.25 mL菌液进行试验。结果表明，以每10 mL高岭土悬浮液接种0.2 mL菌液时的絮凝效果最佳。据分析，最佳投量值大约是固体颗粒表面吸附大分子化合物达到饱和时的一半吸附量，因为此时大分子化合物在固体颗粒上架桥几率最大16。4.4 金属离子对絮凝活性的影响 将CaCl2、FeCl3、MgSO4、NaCl四种无机盐配制成浓度为100g/mL的溶液，取一定量加入到高岭土悬浮液与微生物絮凝剂的反应体系中测定其对絮凝活性的影响，结果表明Fe3+和Ca2+对絮凝效果有不同程度的促进作用，但Fe3+有二次污染问题而不宜采用，因此，Ca2+是较理想的选择。据了解，有些微生物产生的絮凝剂中含有金属离子，金属离子可以加强微生物絮凝剂的架桥作用和电性中和作用，对微生物絮凝剂的絮凝活性有重要意义，甚至是必须条件。即使对于不含有金属离子的微生物絮凝剂，添加一些金属离子也能提高絮凝效果17-20。但金属离子的浓度不能太高，否则由于大量离子占据絮凝剂分子的活性位置，使其与悬浮颗粒隔开而抑制絮凝活性。 经发酵条件优化后，该菌株生产絮凝剂的絮凝率只有21.1%，远低于一些期刊上报道的数据。一方面可能是因为该菌株生产絮凝剂的能力较差，可以通过诱变处理，筛选出产絮凝剂能力较强的突变株。另一方面可能是因为该菌株所产絮凝剂的絮凝活性较低，可对此絮凝剂进行化学修饰，改变它的反应基团，从而提高其絮凝活性。参考文献1潘索娟，伺玉凤，李刚，等.生物大分子絮凝剂BFSVISD的絮凝性能J水处理技术，2008，34（8）：38-412毛艳丽，闫永胜，刘端群，等.微生物絮凝剂及其产生菌的研究新进展.微生物学报， 2008，35（10）: 1616-1620.3Nakamura JPurification and chemical analysis of microbial cell flocculants produced by Aspergiilus sojae AJT002Agri Biol Chem，1 976，40（3）：619-6244马放，张金风，远立江，等复合型生物絮凝剂成分分析及其絮凝机理的研究环境科学学报，2005，25（11）：1491-1496.5阮敏，杨朝晖，曾光明，等多粘类芽孢杆菌GAl所产絮凝剂的絮凝性能研究及机理探讨环境科学，2007，28（10）：2336-2341.6Dermlim W，Prasertsan P，Docile HScreening and characterization of bioflocculant produced by isolated Klebsiella sp Applied Microbiology and Biotechnology，1 999，52（5）：698-7037Kumar CGJoo HSChoi JWPurification and characterization of an extracellular polysaccharide from haloalkalophilic Bacillus spEnzyme and Microbial Technology.2004，34：673-68 18Kurane RDevelopment and utilization of microbial flocculantBio Ind,1988，5（10）：74l-7499 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