肌肉特殊染色.doc

肌肉冰冻切片常用组织学及酶组织化学染色技术（）苏木精和伊红染色（Hematoxylin and Eosin, HE） 1 苏木精溶液染色10分钟 2流水冲洗10分钟 2 伊红溶液染色3分钟 4流水冲洗1分钟 5梯度酒精脱水，透明树胶封固 骨骼肌HE染色（肌膜核蓝色，肌纤维粉红色，结缔组织淡红色） （二）改良Gomori三色染色方法（Modified Gomori Trichrome, MGT） 1 Harris苏木精10分钟 2 水冲洗 10分钟 3 Gomori氏溶液30分钟 60分钟 402%醋酸浸洗1分钟 5酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。 骨骼肌MGT染色（核紫红,肌纤维暗绿色,胶原亮绿色 ,线粒体红色） （三）PAS反应法(Periodic Acid Schiffs reaction, PAS) 1 固定于Carnoiy氏固定液10分钟 2流水冲洗2分钟 305%过碘酸5分钟 4蒸溜水洗12分钟 5Schiff氏溶液1530分钟 6流水洗510分钟 7Harris苏木精溶液2分钟 8流水洗5分钟 9脱水、透明、封固（合成树胶） 骨骼肌PAS染色结果：糖原红色，肌内肌原纤维用清晰可见A纤维染色反应强，B、C、型纤维呈中间型。 （四）苏丹黑B染色 1.苏丹黑溶液20分钟（加盖防气化） 2 流水洗 1 过滤的苏木精染1分钟 4 流水洗2分钟 5 甘油明胶封固 结果：脂类物质染成黑色，。（五）四氮唑还原酶(NADHtetrarolium redutase, NADHTR ) 1. 孵育于下列基质内30分钟，37 0.05M（或0.2M）Tric缓冲液（PH7.4） 30ml 硝基四氮唑（BNT）30mgNADH 24mg 2. 蒸馏水洗。 3. 甘油明胶封固。 骨骼肌NADHTR染色(型肌纤维紫兰色，型肌纤维淡灰色)。（六）琥铂酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，SDH） 染色步骤 1孵育于下列基质30分钟,37 （琥泊酸钠100 mg 硝基四氮唑兰 10 mg 吩嗪二甲脂硫酸盐0.3 mg 0.1M Tris缓冲液30ml 调PH7.2 ）2顺序在60%、90%、60%丙酮顺序脱水及蒸馏水清洗 3甘油明胶封固。 骨骼肌SDH染色（型纤维色深，A、C中间型，B染色浅）（七） 细胞色素氧化酶染色（COX）1 下述基质内孵育14小时 37 DAB（3， -3，-二氨基联苯二氨盐酸盐）30mg 01M醋酸缓冲液 14.0ml 1%氯化锰 1.5ml 01%新鲜过氧化氢 0.15ml 2 蒸馏水冲洗 3 1%硫酸铜冲洗5分钟 4 蒸馏水冲洗 5 甘油封固 肌纤维呈褐红色，代表线粒体反应，细胞色素氧化酶缺陷时则无色。（八）腺苷三磷酸酶(Adenosine Triphosphatase, ATPase) 1.制备下述溶液：A）碱性溶液： 0.1M 巴比妥钠 1份体积 0.18M CaCl2 1份体积 蒸馏水 3份体积 调PH 9.7-11.0 B）主要孵育液及上清液： 0.1M 巴比妥钠 2份体积 0.18M CaCl2 1份体积 蒸馏水 7份体积 上述溶液分成二份即B（-）与B（+），B（-）为上清液，B（+）液为孵育液，即将B液20ml+ATP-Na:50mg调PH9.7。 C）酸性反应液： 0.2M-巴比妥醋酸缓冲液 0.2M-巴比妥醋酸盐溶液 5份体积 0.1M HCL 10份体积 蒸馏水 8份体积 调PH 4.2-4.62碱性PH染色片置于A液15分钟 310分钟后将酸性PH染色片置C液内5分钟 4取出 5全部切片置于B（+）溶液内45分钟 6制备下述溶液 1% CaCl2 2g/200ml 2%CoCl2 1g/50ml 0.01M- 巴比妥钠溶液 1000ml 7 1% Cacl2溶液内洗三次10分钟. 8 2% Cocl2 溶液内3分钟 9流水洗2分钟 100.01M-巴比妥钠溶液内洗8次 111%黄色硫化铵30秒 12流水洗15分钟 013脱水、50%100%酒精 14二甲苯透明两次 15封固 （九）AMP染色(单磷酸腺苷脱氢酶)adenosine monophosphate deaminase1） 反应液 蒸馏水 14ml AMP 6mgNBT 15mg 3MKCl 1ml(搅拌同时慢慢加入)0.1N NaOH 调整PH6.1DTT 8mg2)室温1小时反应3）150mKCl-1.5mM citrate(PH6.0) 2次洗净4）自然干燥5）甘油胶封片固定（十）Acid Phosphataso染色（酸性磷酸酶）1）反应液 萘酚AS-BI（naphtol AS-BI） 1ml巴比妥醋酸钠缓冲液(veronal acetate) 5ml蒸馏水 14ml4%NaNo2(sodium nitrite) 0.8ml 副品红碱液(pararosaniline) 0.