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螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈荿羇袂蒇莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄荿蒃螆袆莅蒃羈肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肃蒀袂羃莂葿薂腿芈薈蚄羁膄薇螆膇肀薇衿羀蒈薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁蚂螇肅芇蚁袀袇膃蚀蕿肃聿虿螂袆蒇蚈袄膁莃蚇羆羄艿蚆蚆腿膅芃螈羂肁节袀膈莀莁薀羀芆莀蚂膆膂荿袅罿膈 遗传学2007一、一个学生用转基因技术研究一个基因的功能。该学生共得到30个独立的转基因株系,其中29个株系的表型与预测的功能基本吻合。但其中一个株系的情况很特殊,在连续三代自交后代中无法获得任何纯合的转基因株系。此外,转基因杂合体(其基因型已准确的确认)的自交后代中,仅出现杂合体和野生型(即不含有转基因的个体)两种群体,其比例大致为 2:1,但没有纯合体后代。请解释该株系表型的遗传学基础,并通过实验验证你的解释。答:该同学在对该株系转基因的过程中可能插入到一个重要的基因,该基因的失活可能会造成植株的致死。假设我们研究的基因为a,插入失活的基因为b。那么该同学获得的杂合转基因植株的基因型可能为aabb。自交后代的基因型为:aabb、aabb、aabb。其中aabb是致死的,因此转基因杂合体的自交后代中,仅出现杂合体和野生型两种群体,其比例约为2:1。实验方案:i、扩增插入位点的旁临序列,在网上的相关数据库进行比对,看看是否是植株生长过程中重要的基因。如果有相关报道是一个重要的基因,可以通过在正常植株中把该基因干扰掉,观察植株是否致死,如果致死,则证明所作的猜测是正确的。ii、也可以通过遗传学的方法间接证明。将该转基因株系中的杂合株和正常转基因株系中的隐性纯合株杂交,如图: aabb aabb p: aabb aabb 就能够得到杂合型和纯合型,并且比例接近1:1。如果是这样的结果,也可间接证明转基因过程中突变掉了一个与植株发育相关的重要的基因,导致无法得到纯合的转基因株系。(转基因过程中除了插入到基因中造成突变,还有其他的如单碱基的突变造成基因突变?)该题目考查了转基因过程中出现的问题该如何解释,需要掌握转基因的原理、过程。题干也给出了我们在研究某基因的功能的时候可以利用转基因的方法。二、一个学生用某一材料的基因组dna(genomic dna)为模版,通过pcr扩增克隆了一个基因。dna测序分析后发现其中1个碱基与数据库中公布的基因组序列不符合。a) 请解释这种差异的可能原因(给出至少2种解释);b) 发现的碱基差异一定会造成蛋白序列改变吗?若有,是哪几种?c) 为减少克隆过程中人为造成的突变,pcr扩增时应注意什么?答:a)可能原因:1、pcr过程中由于酶的保真性不好导致碱基的错配。2、可能所用的材料和数据库中所用的材料存在亚种间的差异。 b)碱基差异不一定会造成蛋白序列的改变。若有,可能会是错义突变、无义突变或是移码突变。c)注意:1、pcr过程中要用高保真的酶2、pcr反应的体系要正确 该题考查了pcr反应中出现的问题,需要掌握pcr反应的原理和步骤,并清楚pcr的应用,生物信息学的作用。 三、rna干涉(rna interference, rnai )是一种快速、有效的研究基因功能的方法,但缺点是有时会导致非特异效应,即影响了其它基因的功能,因而产生非特异性的表型。若过表达基因a序列片段构建的rnai导致了一定的表型,如何证明所观察到的表型是由于此rnai特异性地影响了其靶基因的表达所引起?举出至少两种实验方法(其中一种为遗传学方法)验证你的解释。答:i、用rt-pcr或是northern的方法检测靶基因mrna的变化水平,如果rna干扰的比对照的低,就证明观察到的表型是由于此rnai特异性的影响了靶基因的表达引起的。ii、用westen blot方法检测靶基因的蛋白表达水平。什么算是遗传学的方法呢?传统遗传学还是分子遗传学?查资料。 弄清楚rnai的原理,rnai是干扰转录水平还是翻译水平?相关知识总结:rnai现象在植物体内能以孟德尔方式遗传,并非所有基因都可被沉默,表达水平低的基因rnai现象不明显。对多因一效基因或同源性较高的基因家族,干涉会同时作用这些基因,沉默表型难以鉴定;另外,基因被沉默的表型与转基因时所引起的插入突变表型,有时难以区别。 rna 干涉是通过双链rna 的介导,在基因的转录后水平上,特异性抑制具有相应序列的基因表达,即通过双链rna 的介导特异性降解相应序列的mrna ,从而导致转录后水平的基因沉默。rna 干涉对于抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、生物体的发育和基因表达调控都有重要作用;它也为基因功能的研究开辟了一条新途径。 四、一种人类遗传病,在家族中每代都有人患病,且男女无差别。a) 请解释其遗传方式;b) 请推测其可能的分子机制(给出至少2个解释);c) 导致这种致病的突变为什么能在人群中保留下来?答:a)常染色体显性遗传b) ?c)之所以在人群中保留下来是因为该遗传病不会致死。五、有2个膜蛋白a和b,其下游的一个靶基因是t。当配体 (ligand) l存在时,t被激活表达。如果敲除a(即功能缺失性突变a),t表现为组成型表达(即没有l存在时,t也可被激活);如果敲除b或同时敲除a和b,无论l是否存在,t均不能被激活。a) 根据上述结果,推测a和b之间的关系,以及l和a、b之间的关系; b) 请设计实验证明你的推测模型。答:a)a和b以及l和a、b之间的关系如下图所示。 l a b ta本身抑制b的活性,b能激活t基因的表达。l能够与a互作,导致a没有活性,进而b能够激活t基因的表达。 b)a和l之间的关系可以用酵母双杂交的方法去验证b激活t基因的表达可以用酵母单杂交的方法去验证 遗传学20061. 简述染色体与连锁群两者之间的关系。对于某物种来讲,为什么在遗传研究的早期连锁群的数目会少于或多于该物种染色体的数目?(15分)2. 什么是复等位基因?请列举一实例加以说明。(15分)答、在同源染色体相对应的基因座位上存在三种以上不同形式的等位基因,称为复等位基因(multiple allelism)。如人的abo血型。按照abo血型,所有的人都可分为a型b型ab型和o型。abo血型由3个复等位基因决定,分别为ia;ib;i,他们组成6种基因型,但是ia 和ib间表示共显性,而ia和ib对i都是显性:iaia和iai表型上一样,均为a型ibib和ibi表型上一样,均为b型ii的表型为o型附:在决定输血的后果上,血细胞的性质比血清的性质更为重要。3. 试述同源染色体联会的遗传学意义。如果同源染色体联会出现异常,会产生怎样的遗传学效应?(20分)答、同源联会是为了进行减数分裂,在四分体时期有可能会发生同源染色体上的非姐妹染色单体交叉互换,因此发生了基因重组,为生物提供了更多种类的基因型,同时,也为了同源染色体能均等的分离到两个子细胞中,为的是保证在次级性母细胞没有同源的出现,保证了每个配子都是单倍体,为精卵结合后得到二倍体或多倍体做了保障,因此生物的后代能正常生长发育,也不至于使染色体数目紊乱,使得在配子中获得的染色体数目相同,为繁殖后代做准备。这就是它的意义 联会异常可能会发生染色体数目变异,导致得到异常的配子,因此在受精后会得到畸形的后代。 4. 在遗传学历史上,确认dna为遗传物质的主要实验证据来源于fred griffith(1928), oswald avery (1944) 以及alfred hershey 和 martha chase (1952)等人的研究。请分别简述三项研究的主要内容和结论。(15分)答:1、fred griffith在1928年发现,将高温杀死的s型细菌和活的r型细菌一起注入小鼠体内,结果不仅有许多老鼠死于败血病,而且从死老鼠血液中还发现了活的s型细菌。可是,如果注入小鼠体内的只是活的r型细菌或是死的s型细菌,都不会引起败血病。这说明,高温杀死的s型细菌使某些活的r型细菌转化成s型细菌。s型细菌有一种物质或转化因素进入了r型细菌,引起r型细菌发生了稳定的遗传变异。2、oswald avery等人(1944)的小鼠的肺炎双球菌的实验:只有光滑型(s)型菌株能够引起人的肺炎和小鼠的败血症从s型细菌中分别抽提出dna、蛋白质和荚膜物质,并把每一种成分同活的r型细菌混合,悬浮在合成培养液中。结果发现只有dna组分能够把r型细菌转变成s型细菌。而且dna的纯度越高,转化的效率也越高。这说明,一种基因型细胞的dna进入另一种基因型的细胞后,可引起稳定的遗传变异,dna赋有特定的遗传特性。3、alfred hershey用放射性同位素35s标记蛋白质,32p标记dna。接着,用分别被标记的噬菌体去感染没有被放射性同位素标记的宿主菌,然后测定宿主菌细胞带有的同位素。由此可以得出结论:噬菌体感染宿主菌细胞的物质是dna,释放出来的是跟原先感染细菌细胞一样的噬菌体。可见在噬菌体的生活史中,只有dna是联系亲代和子代的物质。5. 激素x发现于80年前,但对其信号转导了解甚少。最近的研究表明一个质膜定位的蛋白xr1可能是激素x的受体,其中最关键的证据是xr1蛋白在体外形成二聚体 (dimer) 后能结合激素x,且其结合常数接近激素x在体内的生理浓度。但是,遗传学研究的结果却不能支持生物化学研究结果。第一,在已分离鉴定的与激素x相关的近200个不同突变体中,至今没有发现xr1基因携带任何突变(即所有这些突变体中,xr1基因均为正常);第二,通过基因敲除技术完全缺失xr1基因功能后,激素x的信号转导完全正常。今年初发表的一项研究似乎为解决这个难题带来一线希望:如果过量表达xr1基因,则细胞有机体表现出对激素x超敏感。此外,如果过量表达一个点突变的xr1基因(该点突变是将一个高度保守的丝氨酸变成丙氨酸)则导致细胞有机体对激素x不敏感。请解释上述结果,你相信xr1蛋白是激素x的受体吗?为什么?(20分) 答、根据上面的描述,我相信xr1蛋白是激素x的受体。并猜想xr1蛋白是一个家族蛋白,编码它的基因xr1应该是一个基因簇。没有发现携带任何突变是因为该基因是一个基因家族,通过基因敲除技术完全缺失xr1基因后,激素信号转导完全正常。过量表达xr1,与激素结合的能力增强,因此对激素超敏感。过量表达一个点突变的xr1基因,可能造成功能域的改变,无法行使功能,但是能够与激素结合,因此造成不敏感。题目中设计的相关生物学知识要掌握。如基因敲除等。 6. 试举例简述rna编辑 (rna editing) 的主要方式(或形式)及其生物学意义。(15分)答:rna的编辑是某些rna,特别是mrna的一种加工方式,它导致了dna所编码的遗传信息的改变,因为经过编辑的mrna序列发生了不同于模板dna的变化。rna编辑 (rna editing) 的主要方式有两种形式:1、单碱基突变:哺乳动物载脂蛋白mrna的编辑是广泛研究的经典例子。如下图分别是该基因的dna序列以及在哺乳动物肝脏和肠组织中分离得到的序列。在肝脏中,该基因转录产生完整的并被翻译成个氨基酸的全长蛋白,在肠组织中只包含有个密码子的。研究发现,肠组织中该蛋白其实是全长载脂蛋白的端,它是由一个在序列上除了第位密码子从caa突变为uaa之外完全与肝脏中相同的核酸分子所编码的,突变使编码谷氨酰胺的密码子变成了终止密码。 、尿苷酸的缺失和添加研究发现,利士曼原虫属细胞色素bmrna中含有许多独立于核基因的尿嘧啶残基,而特异性插入这些残基的信息来自指导rna,因为它含有与编辑后色素bmrna相互补的核苷酸序列。一些未能配对的腺嘌呤,形成缺口,为插入尿嘧啶提供模板。反应完成后,指导rna从mrna上解离下来,而mrna被用来作为翻译的模板。 生物学意义:?注:除了rna编辑之外,有些rna,特别是前体rrna和trna,还可能有特异性化学修饰。甲基化;去氨基化;硫代;碱基的同分异构化;二价键的饱和化;核苷酸的替换。现代分子生物学p98遗传学2005一、试述有丝分裂和减数分裂对于保持物种稳定以及遗传多样性的意义。 答:细胞的增殖是通过有丝分裂来达成的。有丝分裂的结果,把一个细胞的整套染色体均等地分向两个子细胞,所以新形成的两个子细胞在遗传物质上跟原来的细胞是相同的。这有助于保持物种稳定性。减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂在配子形成过程中发生,这一过程的特点是进行两次核分裂,而染色体仅复制一次。在减数分裂过程中染色体发生交叉互换,进而进行基因重组,并且会有突变的发生,对于物种的遗传多样性有重要的意义。二、基因组学研究是近年来生命科学领域的热点之一。简述结构基因组学与功能基因组学的概念,以及利用模式物种进行基因组学研究的意义。 三、已知某物种的两个连锁群如下图所示: cm cm 图中的数字为相应遗传学位点的遗传距离(cm)。试回答:(1) 杂合体aabbcc 可能产生的配子类型和比例; (2) 设计一个实验验证另一基因x 是否位于图示中的两个连锁群上。答:(1)根据上面的连锁图分析,杂合体aabbcc可能的组合为 a bc 或a bc a bc 现在以前者为例加以说明1/2 * (1-7%)bc 1/2 * (1-7%)bc1/2 a 1/2 * 7%bc1/2 * 7%bc (2)构建杂合体aabbxx,观察后代分离比,先观察a和x,如果得到的ax:ax:ax约为1:2:1,那么a和x就不在a所在的连锁群上,如果得到的比例ax和ax的较多,而ax型较少,那么可以确定a和x连锁。再观察b和x,同理。注:对相关概念:“交换、遗传距离”等概念要清楚,并且会进行两对基因、三对基因、甚至是多对基因的相关计算。 四、转录因子包括什么主要的功能结构域?其主要的结构特点与功能是什么? 答:蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域:dna结合域(dna binding domain),多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成;转录激活域(activating domain),常由30-100氨基酸残基组成,这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类,一酸性结构域最多见;连接区,即连接上两个结构域的部分。不与dna直接结合的转录因子没有dna结合域,但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。与dna结合的转录因子大多以二聚体形式起作用,与dna结合的功能域常见有以几种:螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,hth)及 螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,hlh)这类结构至少有两个螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接,两个这样的motif结构以二聚体形式相连,距离正好相当于dna一个螺距(3.4nm),两个螺旋刚好分别嵌入dna的深沟。锌指(zinc finger) 其结构如图 所示,每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基,锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入dna双螺旋的深沟,接触5个核苷酸。例如与gc盒结合的转录因子sp1中就有连续的3个锌指重复结构。碱性-亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bzip) 这结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基,结果就导致这些亮氨酸残基都在螺旋的同一个方向出现。两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体,这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基,借其正电荷与dna双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对dna的亲和结合力明显降低。在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为c/ebp家族的一大类蛋白质能够与caat盒和病毒增强子结合,其特征就是能形成bzip二聚体结构。 五、下述是一个虚拟的分子遗传学问题。表皮毛具有重要的生物学意义。典型的表皮毛结构包括一根主干(main stem) 以及主干顶端的三个分枝(branches) 组成。形态学研究表明如果主干生长过长,通常导致顶端分枝减少至两个或更少。相反,如果主干生长过短导致分枝增加。因此主干的长度与顶端的分枝数目成负相关。为了研究表皮毛发育的机制,某研究生筛选到一个表皮毛发育异常的突变体。该突变体的表皮毛主干较野生型长,且只有两个分枝。该突变体被命名为abnormal branching(abc)。遗传分析表明abc 是一个核基因隐性突变。之后,该研究生克隆了abc 基因,发现abc基因编码一个转录因子。dna测序分析发现在abc突变体中,一个单碱基的突变导致了在一个富含碱性氨基酸的区段(5 个连续的赖氨酸或精氨酸)中的一个赖氨酸突变为甘氨酸。该研究生制备了抗abc 蛋白的多克隆抗体。通过原位免疫荧光技术,该研究生发现在野生型中abc 蛋白完全定位在细胞核中,而在abc 突变体中abc 蛋白同时定位在细胞质和细胞核中。为了更深入的研究表皮毛发育的机制,该研究生又筛选了abc 突变的抑制子突变(suppressors of abc; sab)。sab 突变能够抑制abc 突变体的表型(即abc/sab 双突变体的表型为正常)。但在野生型背景下(即sab 单突变),表皮毛变短,分枝增多(46 个分枝)。分子遗传学实验证明sab 基因编码一个f-box 蛋白(f-box protein)。该研究生证明在体外和体内(both in vitro and in vivo) abc 均与sab 互作(interaction)。westernblot 表明abc 蛋白在sab 突变体细胞中高水平富集。 根据上述结果,简要回答下述问题(第14 小题,答案请勿超过50 个字;第5小题请勿超过200 字):(1) 该研究生可能通过什么方法制备了抗原(即用于制作抗体用的abc 蛋白)?(2) 请解释为什么部分abc 突变蛋白(即赖氨酸突变为甘氨酸后)会定位在细胞质中而不是完全定位与细胞核中?(3) 过量表达abc 基因的可能表型是什么?(4) 过量表达sab 基因的可能表型是什么?(5) 请提出一个模型解释abc 和sab 在调控表皮毛发育中的作用机制。 答:(1)(2) 查找相关文献2004 遗传学一、 选答题:请在第1与第2题间选答一题。若两题均答,只按其中得分最低的一题记入总分。(每题20分)1. 列举动物遗传研究中常见的两种模式实验动物,它们各有哪些特点?对遗传学的发展有哪些主要贡献?果蝇:果蝇模型的建立大大推进了遗传学和发育生物学的进展 小鼠:在过去一个世纪的研究中,小鼠已经成为建立人类遗传性疾病的动物模型的最佳实验材料。小鼠的基因组改造技术成熟,且生理生化和发育过程和人类相似,基因组和人类90同源,所以人类疾病的小鼠模型可以基本上真实模拟人类疾病的发病过程及对药物的反应;小鼠作为遗传学研究材料的另一优势还在于其基因组计划已基本完成。基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段。 2. 在植物遗传研究中,经典遗传学实验材料常采用豌豆和玉米,而现代遗传研究则更趋向利用拟南芥菜和水稻,试述发生这种转变的主要原因,以及它们在植物遗传学发展史上的主要贡献。答:拟南芥是双子叶植物,拟南芥植物基因组小,基因组已经测序,生长周期短。水稻是单子叶植物的代表。水稻一方面是主要的粮食作物,染色体少,水稻基因组也已经测序,对水稻的研究有重要的生产实践意义。 二、 对于突变体的诱导有许多种方法,请分别列举一种化学的、物理的以及生物的突变体诱变方法。 对于表型相同的一组突变体,请设计一遗传试验,验证这些突变属于相同位点(alleles)突变还是不同位点(non-alleles)的突变。(20分) 答:突变体诱变方法:化学诱变:例如秋水仙素可以诱导多倍体。物理诱变:例如辐射,紫外照射。辐射有x射线,a射线等。生物诱变:农杆菌侵染,插入基因内部使基因失活。 实验设计:控制相同表型的一组突变体的基因型分别假定为a和b,分别用两突变体杂交,如下图: 突变体1(aabb)突变体2(aabb) 杂合体(aabb)如果杂合体表现性为野生型,那么这些突变位点属于不同位点突变,如果杂合体表现突变表型,那么这两个突变位点是相同位点的突变。 三、 转座(transposition)与易位(translocation)有什么不同?它们各自有哪些类型?对于基因组的进化各有哪些意义?(20分)答:转座和易位是两个不同的概念。易位是指染色体发生断裂后,通过断端的重接使染色体断片连接在同一条染色体的新的位置,或是同另一条染色体的断端连接转移到另一条染色体上,此时,染色体断片上的基因也随着染色体的重接而移动到新的位置。转座则是在转座酶的作用下,转座因子或是直接从原来的位置切离下来,然后插入染色体的新的位置;或是染色体上的dna序列转录成rna,rna反转录产生的cdna插入到染色体新的位置,这样,在原来位置仍然保留转座因子,而其拷贝则插入新的位置,也就是使转座因子在基因组中的拷贝数增加一份。此外转座因子本省既包含了基因,如编码转座酶的基因,同时又包含了不编码蛋白质的dna序列。 易位包含:相互易位和罗伯逊易位。转座包括:复制转座和非复制转座。 对基因组进化的意义:?复制型转座能够引入新的dna序列,增加拷贝数。四、 简述你所从事过的一项最主要研究工作。如果给你以足够的研究条件,以及3-4年的时间,你将如何进一步深化你的研究工作?(20分) 五、 负调控在生命活动中有重要的意义,除经典的操纵子模型以外,近年来还发现有泛素(ubiquitin)介导的蛋白质降解机制和micro rna(mirna)介导的转录和翻译抑制机制,请从后两者中任选一种举例说明其作用机制与生物学意义。(20分)答:在真核生物中,蛋白质的降解依赖于泛素,该蛋白只有76个氨基酸残基,序列高度保守(从酵母和人细胞中提取的泛素几乎完全相同!),生物细胞内即将被降解的蛋白首先在atp的作用下与泛素相连,这个过程需要有e1、e2、e3三个降解因子参与。一旦被降解蛋白与泛素相连接,这个复合体就被运送到蛋白降解体系中指导完全降解。 生物学意义:?microrna (mirna) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链rna 分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。 生物学意义:? 掌握相关概念:原核生物的基因调控主要发生在转录水平上,根据调控机制的不同,可分为负转录调控和正转录调控。负转录调控又分负控诱导和负控阻遏,正转录调控又分为正控诱导和正控阻遏。 2003 遗传学一、今年是dna双螺旋模型发表五十周年。请回答以下问题(20分):1、在双链dna分子中a+t/g+c是否等于a+c/g+t ?(4分)2、dna双链的两条链中是否含有相同的遗传信息?为什么?(4分)3、大肠杆菌的基因组dna的长度约为1100微米。请根据dna模型估计其基因组的碱基对数目。(4分)4、如果两种生物基因组dna在四种碱基的比率上有显著差异,那么预期在它们编码的trna、rrna和mrna上是否也会在四种碱基的比率上呈现同样的差异?(8分) 答:1、不一定2、不是,因为一条为编码链或称为有意义链,另外一条为模板链或称反义链。mrna上的信息和编码链的相同。3、每隔0.34nm有一个核苷酸,那么1100106/0.343109个。4、首先要考虑这种生物是什么类型的生物,如果是原核生物,那这个问题的答案可能是肯定的;如果是真核生物,则可能性很小 原因很简单,原核生物没有多少所谓的不编码基因,也就是真核生物里所谓的内含子,其dna的大部分将用来编码trna、rrna和mrna等rna;相反,真核生物dna序列只有约10%不到的序列用来编码trna、rrna和mrna等rna,因此dna碱基比率上的差异未必和rna上的差异类似二、在一牛群中,外观正常的双亲产生一头矮生的雄犊。请你提出可能导致这种矮生的各种原因,并根据每种原因提出相应的调查研究的提纲(注意整个调查研究工作必须在两个月microsatellite , str , sslp , snp , indel .答:短片段重复序列(short tandem repeat, str)是由2-6个碱基对作为核心单位,串联重复形成的一类dna序列,由于核心单位重复数目在个体间呈高度变异性并且数量丰富,构成了str基因座的遗传多态性。它具有分布广泛,易于检测,信息量大,有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等优点。目前str分析已广泛应用于遗传制图、连锁性分析、亲子鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域。 简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism,sslp)是据串联重复排列微卫星基序两侧的单一序列设计引物,对微卫星序列(microsatellite dna或simple sequence repeats,ssr)进行扩增,由微卫星基序重复数目的变异而产生多态性。由于中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列,因而可以将微卫星侧翼的dna片段、测序,然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行pcr扩增,从而将单个微卫星位点扩增出来。 四、在普通遗传学中,非等位基因间的相互作用有哪几种?请举例说明其中的两种相互作用?请从分子遗传学和分子生物学的角度对非等位基因间的相互作用的分子机制进行阐述,并举例说明。(20分)答:非等位基因的相互作用方式有:互补效应、上位性效应(包括显性上位和隐性上位)、修饰基因效应(包括强化基因、限制基因和抑制基因)。举例说明:互补效应:(p与r互补,p与r互补) 修饰效应中的抑制效应:(如图i对y的抑制) 隐性上位:(c对g是上位性) 显性上位:(b对y是上位 性)分子机制:?五、有哪些诱变剂可以诱发基因突变?基于突变被辨认的方法,可以将突变分为哪几种类型?哪些类型的突变对功能基因组的研究最有意义?为什么?对一个已完成基因组测序的真核生物,如何构建一个突变体库,以揭示基因组中预测基因的功能?(20分)答:辐射诱变,化学诱变中秋水仙素、亚硝胺、芥子气等都能诱发基因突变。突变分为:形态突变、生化突变、致死突变和条件致死突变。 形态突变对功能基因组的研究最有意义。能够直接应用于生产实践。构建突变体库:? 羆薄荿肄羅芄蚄羀羄莆蒇袆羃葿蚃螂羃膈蒆蚈肂芁蚁羇肁莃蒄袂肀薅虿袈聿芅薂螄肈莇螈蚀肇葿薀罿肇腿螆袅肆芁蕿螁膅莄螄蚇膄蒆薇羆膃膆莀羂膂莈蚅袈膁蒀蒈螄膁膀蚄蚀膀节蒆羈腿莅蚂袄芈蒇蒅螀芇膇蚀蚆芆艿蒃肅芅蒁螈羁芅薄薁袇芄芃螇螃袀莅薀虿衿蒈螅羇罿膇薈袃羈芀螃蝿羇蒂薆螅羆薄荿肄羅芄蚄羀羄莆蒇袆羃葿蚃螂羃膈蒆蚈肂芁蚁羇肁莃蒄袂肀薅虿袈聿芅薂螄肈莇螈蚀肇葿薀罿肇腿螆袅肆芁蕿螁膅莄螄蚇膄蒆薇羆膃膆莀羂膂莈蚅袈膁蒀蒈螄膁膀蚄蚀膀节蒆羈腿莅蚂袄芈蒇蒅螀芇膇蚀蚆芆艿蒃肅芅蒁螈羁芅薄薁袇芄芃螇螃袀莅薀虿衿蒈螅羇罿膇薈袃羈芀螃蝿羇蒂薆螅羆薄荿肄羅芄蚄羀羄莆蒇袆羃葿蚃螂羃膈蒆蚈肂芁蚁羇肁莃蒄袂肀薅虿袈聿芅薂螄肈莇螈蚀肇葿薀罿肇腿

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