（化学工程专业论文）新型胶原真皮支架材料的制备与性能表征.pdf

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c o s t a n ds i m p l ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g y t h ep a r a m e t e r so ft h ep r e p a r a t i o nw e r eo p t i m i z e d a n dt h ep r o p e r t i e so ft h es c a f f o l dm a t e r i a lw e r ec h a r a c t e r i z e d ( 1 ) t h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yw a sd e s i g n e db a s e do nt h et r a d i t i o n a lm e t h o d so f a d m p r e p a r a t i o na n dt h em a t u r ep r e t r e a t m e n t so fl e a t h e rt e c h n o l o g yu s i n gp o r c i n e s k i na st h er a wm a t e r i a lw h i c hw a ss t r u c t u r a l l ya n di m m u n o l o g i c a l l ys i m i l a rt oh u m a n s k i n t h ep r e p a r a t i v es c a f f o l dm a t e r i a lc o n t a i n e dn op o r c i n ec e l l sa n db o r ei d e a l m i c r o s t r u c t u r eb a s e do nr e t a i n i n gn a t i v e c o l l a g e n t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e p r e t r e a t m e n t sr e m o v e df i n ef a i r , s w e a tg l a n d ，s u b c u t a n e o u st i s s u ea n ds oo n t h e c o m b i n e dt r e a t m e n t sw i t he n z y m e ，a l k a l i ，s o d i u md o d e c y ls u l f o n a t ea n ds o d i u m c h l o r i d es o l u t i o nc o n t r i b u t e dt ot h ef i n a le a s yo p e r a t i o n ，l o wc o s ta n di d e a lp r o p e r t i e s o ft h es c a f f o l d a f t e ro p t i m i z a t i o n sb ya d j u s t i n gc o n c e n t r a t i o n sa n dt i m ea n d 3 山东大学硕士学位论文 a n a l y z i n gm i c r o s t r u c t u r e ，m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，p o r o s i t i e s ，a m i n oa c i dc o m p o s i t i o n s a n ds oo n ，t h ef i n a lt e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r sw e r ec h o s e na sf o l l o w s ，2 0g l 。1s o d i u m h y d r o x i d ea n d0 8g l 。1s d ss o l u t i o nf o r1 5h 3 0g - l 。1t r y p s i n 3 0g l 1 1 3 9 8 e n z y m e 2 0g l 1s d ss o l u t i o nf o r61 1 ，4 0g - l s d sf o r4h ，a n d6 0g l 。1n a c l s o l u t i o nf o r2 4h ( 2 ) t h ep r e p a r a t i v es c a f f o l dm a t e r i a lw a sa n a l y z e dc o n t a i n i n gh es t a i n i n g o b s e r v a t i o n ，f t i ra n a l y s i s ，u v - v i se x a m i n a t i o n ，a m i n o a c i d s a n a l y s i s ，s e m o b s e r v a t i o n ，p o r o s i t ya n a l y s i s ，m e c h a n i c a lp r o p e r t ym e a s u r e m e n t ，b i o d e g r a d a t i o n a n a l y s i si nv i t r o ，c l s mo b s e r v a t i o na n ds oo nt oc h a r a c t e r i z ei t sp h y s i c a l ，c h e m i c a l a n db i o l o g i c a l p r o p e r t i e s ，s u c h a s c o m p o n e n t s ，m i c r o s t r u c t u r e ，t e n s i l es u e n g t h ， b i o d e g r a d a t i o n ，c e l lg r o w t ha n ds oo n t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t n oc e l l sw e r e o b s e r v e d ，f t i ra n du vs p e c t r as h o w e dt h et y p i c a lc o l l a g e np e a k s ，t h ec o n t e n to f c o l l a g e nw a s81 4 7 一8 7 。3 4 ，t h es c a f f o l dm a t e r i a lp o s s e s s e dp o r o u ss t r u c t u r ew i t h i n t e r c o n n e c t e dp o r ec h a n n e l sw h i c hd i a m e t e rw a sa b o u t10 0 “ma n dp o r o s i t yw a s a b o u t8 9 0 0 ，i tc o u l db ec o m p l e t e l yd e g r a d e di nv i t r oa f t e r7 2hi nc o l l a g e n a s e s o l u t i o n ，m o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s ( 3 t 3 ) c u l t u r e do nt h es c a f f o l d m a t e r i a l p r o l i f e r a t e dw e l la n dd i s t r i b u t e de v e n l y t h ep r e p a r a t i o nm e t h o di ss i m p l e ，l o w c o s t t h ep r e p a r a t i v ec o l l a g e nd e r m a l s c a f f o l dm a t e r i a lc o m b i n e sa d v a n t a g e so fb o t ha d ma n dc o l l a g e ns p o n g e i ts a t i s f i e s p e r f o r m a n c es t a n d a r d so fd e r m a ls c a f f o l dm a t e r i a li ns k i nt i s s u ee n g i n e e r i n ga n di s e x p e c t e dt oh a v eg r e a tp o s s i b i l i t i e sf o ra p p l i c a t i o ni nt i s s u ee n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：t i s s u ee n g i n e e r i n g ；d e r m a ls c a f f o l dm a t e r i a l ；c o l l a g e n ；p r e p a r a t i o n ； 4 p r o p e r t y 山东大学硕士学位论文 a d m c l s m a c e l l u l a rd e r m a lm a t r i x 符号说明 脱细胞真皮基质 c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y 共聚焦激光扫描显微镜 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e f t i r h e 二甲基亚砜 f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y傅氏转换红外线光谱分析仪 h e m a t o x y l i n - e o s i n苏木精伊红 0 【一m e m a l p h am i n i m a le s s e n t i a lm e d i u m t l - 最低必需培养基 m t t o d p b s s d s s e m t h i a z o l lb l u e o p t i c a ld e n s i t y 噻唑蓝 光密度 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓溶液 d o d e c y l s u l f a t es o d i u ms a l t 十二烷基硫酸钠 s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y v n 忒i su l t r a v i o l e t - v i s i b l e 扫描电子显微镜 紫外可见光 5 山东大学硕士学位论文 6 一 山东大学硕士学位论文 第一章绪论弟一早珀下匕 1 前言 皮肤关系人们的生活质量甚至生命健康，作为人体与环境的第一道屏障，皮 肤又很容易受到损害。人体本身具有一定的重建功能，可实现受损皮肤的自我修 复。但当皮肤受损面积大、受损程度严重时，必须借助外科手术才可保证皮肤结 构与功能的重建。皮肤移植需要足够的皮源，自体移植与异体移植都具有一定的 局限性，组织工程皮肤的出现解决了这个问题。皮肤组织工程应用细胞生物学和 工程学的原理和技术，设计、构造和培养皮肤组织替代物，以实现对皮肤结构与 功能的修复与重建。真皮支架材料是皮肤组织工程的三要素之一，天然或提取的 胶原被很好地用作皮肤真皮支架材料。本文以异种( 猪) 皮为原料，选择合适的 试剂，优化制备工艺，制备了一种维持真皮中胶原天然结构的支架材料，并对其 各项性能进行了表征。该胶原真皮支架材料制作成本低，制备工艺简单，各项性 能符合皮肤组织工程对真皮支架材料的性能要求，在组织工程领域具有良好的应 用前景。 2 人体皮肤的损伤与愈合 皮肤是人体最大的器官，几乎覆盖全身，总面积( 成人) 约为1 5 2 0m 2 【。 它是人体与外界环境之间的第一道屏障，使人体免受物理性、化学性、生物性的 侵袭，对健康十分重要。某些伤病会导致皮肤的局部或大面积缺损，造成机体不 同程度的损伤。人体本身具有极强的修补能力，受损皮肤的结构和功能可得到不 同程度的自我恢复。当皮肤损伤严重时，外科手术的介入变的十分必要。皮肤组 织工程是以修复和重建受损皮肤结构与功能为目的的一门学科。 2 1 皮肤的结构与功能 2 1 1 皮肤的结构 2 1 皮肤厚约o 5 4 0n h n ，由表皮和真皮构成，还包括毛囊、汗腺、皮脂腺、指 甲、趾甲等皮肤附属器，以及血管、淋巴管、神经和肌肉。图1 1 为人体皮肤结 构示意图。 表皮是皮肤的浅层结构，厚约0 0 7 1 4i n n l ，由胚胎时期的外胚层发育而来。 它主要由角质形成细胞( k e r a t i n o c y t e ) 构成，表皮从内到外又可以分为五层：基底 层、棘层、颗粒层、透明层、角质层。如图1 2 。 7 山东大学硕士学位论文 图1 1 人体皮肤的结构【3 】图1 2 表皮的结构【4 】 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fh u m a ns k i nf i g 1 2t h es t r u c t u r eo fh u m a ne p i d e r m i s 基底层由一层圆柱形或立方形细胞组成，细胞排列整齐，呈栅栏状，是 唯一可分裂的角质形成细胞。基底层不断产生新细胞，向浅层推移。 棘层棘层细胞呈扁平状，由基底层细胞增殖而来，一般4 8 层。有棘状 物，便于他们牢固地攀靠在一起。 颗粒层细胞呈梭状或扁平状，一般1 3 层。细胞中充满着含有角质素的 颗粒，随着角质素的增加，细胞会逐渐的角质化而死亡。 透明层细胞较扁，一般2 3 层。胞质呈均质状，有强折光性。 角质层细胞扁平，几十层不等。细胞已死，不含细胞核和其他细胞结构。 这些紧密连接的死细胞构成皮肤的屏障层。它们最终呈小片脱落，形成皮屑。 表皮除了含有角质形成细胞外，还含有三种散于角质形成细胞之间的非角质 形成细胞：黑素细胞( m e l a n o c y t e ) 、朗格汉斯细胞( l a n g e r h a n sc e l l ) 、梅克尔细胞 ( m e r k e l sc e l l ) 。 黑素细胞大多散于基底层，可分泌黑色素。黑痣、雀斑、肤色都与黑色 素有关。恒温动物的黑素细胞还可产生红色或黄色的色素。 朗格汉斯细胞主要散于棘层浅部，是一种抗原呈递细胞。有吞噬作用， 但比巨噬细胞作用弱。它还能把一些物质转化为维生素d 。 梅克尔细胞主要位于基底层，可能为接受机械刺激的感觉细胞。 真皮位于表皮之下，厚为o 4 2 4i n i 1 。可分为乳头层和网状层。乳头层与表 皮基底层紧密相连，突向基底层，形成波浪状接触面，含丰富的毛细血管网和感 山东大学硕士学位论文 觉神经末梢。网状层与乳头层无明显界限，主要由粗大的胶原纤维束和弹性纤维 组成。纤维束排列多与体表面平行。此外还有较大的血管、淋巴管以及汗腺、毛 囊、皮脂腺、神经、神经末梢。真皮由致密结缔组织构成，其内分布着各种结缔 组织细胞和大量的胶原纤维、弹性纤维。 表1 1 真皮的主要组成 t a b 1 一lm a i nc o m p o n e n t so fh u m a nd e r m i s 名称形态与主要作用 胶原纤维 网状纤维 弹性纤维 成纤维细胞 组织细胞 肥大细胞 淋巴细胞 基质 成束状，有弹性，构成皮肤真皮的骨架。 环绕皮肤附属器和血管周围，是未成熟的胶原纤维。 呈波浪形，富有弹性。 呈梭状，产生胶原纤维、弹性纤维和基质。 吞噬生物、代谢产物、色素、异物等。 储存和释放肝素、组织胺等物质。 参与免疫反应。 无定形胶样物质，可抗皱、抗老化。 基底膜是位于表皮和真皮交界处厚约o 5 1 0 微米的薄膜。由表皮细胞和真 皮结缔组织细胞分泌而来。当表皮细胞损伤或受刺激时，基底膜发出信息，让真 皮细胞去修补。此外，真皮中分布着丰富的毛细血管，毛细血管具有三层结构： 内膜，由内皮细胞和一层内弹性膜组成。中膜，由几层平滑肌细胞和弹性纤 维组成。外膜，由成纤维细胞，i i i 型胶原和弹性纤维组成。 2 1 2 皮肤的功能 皮肤的基本功能是防止水分、电解质、营养物质的丢失，阻止外界有害的或 机体不需要的物质入侵。总结起来皮肤具有如下功能 5 1 ： 保护功能：防止机械、物理性刺激；防止化学性腐蚀；防止生物性侵袭。 调节功能：调节体温，调剂机体电解质平衡。 吸收功能：能吸收脂溶性物质( 油脂、乙醇、乙醚) ，水溶性物质吸收少。 分泌和排泄功能：分泌汗液；分泌皮脂；排泄代谢产物。 感觉功能：含有丰富的感觉神经末梢，感受各种刺激。 呼吸作用：与环境进行氧气和二氧化碳的交换。 9 山东大学硕士学位论文 新陈代谢：皮肤在晚1 0 点到凌晨2 点代谢活动最活跃。 免疫功能：表皮与真皮都有参与免疫反应的细胞，如角质形成细胞、朗格 汉斯细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等。 2 2 皮肤的损伤| 6 , 7 j 当皮肤受到损伤时，皮肤的各种功能缺失甚至丧失，严重影响人们的生活质 量甚至生命健康。烧伤、创伤和慢性溃疡等皮肤伤病都会导致皮肤的局部或大面 积缺损。据统计，美国每年的烧伤患者高达1 5 0 万人，其中7 5 0 0 0 人属于严重烧 伤者，死亡人数在5 0 0 0 1 2 0 0 0 。在我国，每年因烧伤、机械损伤或慢性皮肤溃疡 而需要医治的患者高达数千万。皮肤受到损伤的程度不同，治疗的手段和愈合的 效果也不同。烧伤创面深度多用三度四分法来描述。如图1 3 。 表 皮 真 皮 皮 下 组 织 图1 3 三度四分法示意卧8 】 f i g 1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h r e ed e g r e ea n df o u rc l a s s e sm e t h o d i 度烧伤：伤及基底层、透明层及颗粒层，也可累及部分棘层。基底层细胞 未受损失。一般2 3 天愈合，不留疤痕。 浅i i 度烧伤：伤达表皮全层及部分真皮浅层。创面修复依赖创面周围的表皮 基底层细胞和毛囊上皮细胞。一般1 0 1 4 天愈合，不留疤痕。 深i i 度烧伤：表皮及真皮浅层细胞全部坏死，真皮深层部分细胞肿胀变性。 创面修复依赖真皮深层中残存的皮肤附属器上皮细胞。愈合需要3 4 周，遗留不 同程度的疤痕。 1 0 山东大学硕士学位论文 i i i 度烧伤：伤至全层真皮之下。不能自行愈合，需植皮愈合。 2 3 皮肤的愈合 机体本身具有强的修补和重建功能，最终使组织的连续性得以维持，使皮肤 的结构与功能得到不同程度的恢复。这种修复过程称为再生( r e g e n e r a t i o n ) ，是通 过损伤处周围未受损伤皮肤组织中的细胞的分裂增殖来完成。但当皮肤损伤严重 时，只有借助外科手术才能得到很好的恢复，如全厚皮损伤，且直径超过4 c m 时 9 , 1 0 】。 2 3 1 表皮损伤后的愈合 当表皮损伤真皮完整时。损伤周围表皮中的基底层细胞开始分裂增殖，横向 移动，闭合伤口，同时纵向生长，使表皮增厚。在毛囊和汗腺处也可以提供供表 皮再生的表皮干细胞。 2 3 2 部分真皮损伤后的愈合 真皮浅层损伤时，组织可完全再生，即结构与功能恢复到损伤前的状态。当 真皮损伤较深时，组织不完全再生，即结构与功能难以恢复到伤前状态。由纤维 组织代替损伤的组织，最终形成瘢痕。愈合过程通常分为：炎症期、增殖期和重 塑则1 1 1 。 炎症期形成血凝，阻塞破裂的血管，为细胞的迁移提供临时介质。吞噬 细胞发挥作用，清除受损、坏死组织和外来异物。 增殖期表皮中，基底层细胞分裂增殖( 损伤后1 2 天) ，横向迁移，覆盖 创面。真皮中，损伤后3 4 天，形成肉芽组织( 主要由成纤维细胞、巨噬细胞、 疏松的i i i 型胶原、新生毛细血管构成) 。迁移、分裂或分化而来的成纤维细胞分 裂增殖产生胶原等物质，毛细血管为组织的修复提供氧气也营养物质。 重塑期肉芽组织向瘢痕组织转化，表现为：i 型胶原增加；胶原纤维交 联增加；透明质酸和水分减少；细胞凋亡增d l ：l l 毛细血管网消退等。作用是改善 组织的结构和强度，以尽可能恢复组织原有的结构和功能。 2 3 3 真皮完全损伤后的愈合 真皮全厚皮损伤，且直径超过4 c m 时，需要外科手术的介入，一般有两种 方案【1 2 】。当受损范围不大时，取自体刃厚皮( 含有表皮和部分真皮) ，移植到皮 肤受损处。被取皮的部位，通过角质形成细胞的迁移、增殖实现自我修复。当损 山东大学硕士学位论文 伤范围很大时，通常需要两部手术：首先移植真皮替代物，待真皮层中实现血管 化时，移植表皮材料( 通常是薄的刃厚皮，有时是细胞或组织工程皮肤) 9 , 1 0 , 1 3 。 3 皮肤组织工程真皮支架材料 3 1 皮肤组织工程简介 。 组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) - - 词最早是在1 9 8 7 年美国科学基金会在华盛 顿举办的生物工程小组会上提出，1 9 8 8 年正式定义为：应用生命科学与工程学 原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构和功能关 系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功 能和形态的生物替代物的- - t - j 新兴学科 1 4 , 1 5 】。组织工程是生物学、材料学、工程 学、外科学、分子生物学等相结合的领域，最终目的是产生有生物学功能的组织 替代物，解决组织器官来源受限的问题。它的三大要素是：支架材料、种子细胞、 生长因子【1 6 1 。 皮肤组织工程是组织工程的重要组成部分。它是将体外培养的皮肤种子细胞 ( 主要是角质形成细胞和成纤维细胞) ，与天然细胞外基质、复合或合成的可降 解生物相容性材料相结合，形成细胞材料复合物，在体外培养一段时间后植入 机体内，用以修复皮肤缺损。种子细胞会继续增殖或被受体细胞替代，血管慢慢 长入，支架材料逐渐降解被吸收。形成在形态与功能上与正常皮肤一致的新皮肤。 目前，应用皮肤组织工程学技术产生的组织工程皮肤产品有：表皮替代物、真皮 替代物和双层活皮肤替代物。 表皮替代物，由角质形成细胞膜片及其支撑系统组成，缺乏真皮；真皮替代 物，由结合了成纤维细胞的生物支架和表面的合成表皮( 一般是硅橡胶膜) 构成， 往往通过二次手术重建完整皮肤；双层活皮肤替代物，表皮与真皮含有活细胞， 结构与天然皮肤结构相似。这些产品以模拟皮肤屏障、消除创面为主要目标。制 备具有完整结构与功能的皮肤替代物目前还存在困难。构建具有皮肤附属器的组 织工程皮肤正处于研究阶段【17 1 。 3 2 商品化的组织工程皮肤 3 2 1 表皮替代物 e p i c e l t l 8 , 1 9 。由美国g e n z y m et i s s u er e p a i r 公司生产的自体表皮膜片，2 - 8 层细胞厚。可与自体刃厚皮联合使用，自体刃厚皮无法供给时也可单独使用。 1 2 山东大学硕士学位论文 e p i d e x 2 0 , 2 l 。由瑞士m o d e xt h e r a p e u t i c a s 公司生产的自体表皮膜。应用 毛发细胞技术，从病人身体上拔出毛发，利用毛发中的细胞，在6 周内体外培养 成小片皮肤，再将其移植至病人伤口处，加速伤口愈合。 m y s k i n 2 2 - 2 4 。由英国a l t d k al t d 生产的自体表皮替代物。细胞取自病人 本身，它将一层角质形成细胞( 表皮细胞) 植于一层聚合物上，以减轻细胞向伤 口内部的转移。同时使用硅胶层协助细胞的迁移、伤口的愈合。 3 2 2 真皮替代物 a l l o d e r m l 2 5 , 2 6 1 。由美国l i f e c e l l 公司生产。厚约0 7 9 3 3 0 m m 。它以人尸 体皮全厚皮为原料，通过冻融的专利技术，去除细胞成分，保留胶原束的分布与 结构。它具有天然的真皮基质组成与结构，抗原性小，移植成功率高。 p e 肌a c o l 2 7 1 。由美国c o v e d i e n 公司生产。厚为0 4 m m 或1 5 r a m 。它以猪 真皮为原料，去除真皮细胞，维持真皮的天然三维结构，然后使用六亚甲基二异 氰酸酯( h e x a m e t h y l e n ed i i s o c y a n a t e ，h m d i ) 进行交联处理制得。 i n t e r g r a l l 3 , 2 s 】。由美国i n t e g r al i f es c i e n c e s 公司生产。厚约1 3 m m 。它用 戊二醛交联牛i 型胶原和鲨鱼6 硫酸软骨素构成真皮，表皮由一层硅橡胶薄膜构 成。移植后，当真皮层产生血管后( 约三周) ，揭去硅橡胶薄膜，换成表皮替代 物。 t r a n s c y t e 2 9 1 。以前也称d e r m a g r a f t t c 。由美国a d v a n c e dt i s s u es c i e n c e 公司开发。它是将新生儿成纤维细胞接种到胶原尼龙网( 不可降解) 上构成。 由于尼龙网不可降解，t r a n s c y t e 只能起到临时替代物的作用。 d e r m a g r a f t t 3 0 , 3 1 l 。由美国a d v a n c e dt i s s u es c i e n c e 公司开发。厚约o 1 9 m m 。 它是将新生儿的成纤维细胞接种到可生物降解的尼龙网( p o l y g l a c t i n ) 上，使之在 上生长增殖。它不含巨噬细胞、淋巴细胞、血管和毛囊。 3 2 3 双层活皮肤替代物 a p l i g r a f t 3 2 1 。由美国o r g a n o g e n e s i s 公司生产。厚约0 4 0 7 5 m m 。真皮支 架由牛胶原构成，先在其上种植新生儿包皮成纤维细胞，待形成真皮层后，种植 新生儿包皮角质形成细胞，构成表皮层。最终形成含有异体双细胞的皮肤替代物。 p e 册a d e m 【3 3 】。由美国c u t a n o g e n 公司生产。支架由胶原构成，其上种植 取自病人真皮的成纤维细胞和取自病人表皮的角质形成细胞，共同构筑双细胞皮 山东大学硕士学位论文 肤替代物。 o r c e l 3 4 1 。由美国f o r t i c e l lb i o s c i e n c e 公司生产。厚约1 01 t i i t i 。支架由为 双层i 型牛胶原基质：上层为无孔的牛胶原凝胶，其上接种捐赠者角质形成细胞。 下层为交联的牛胶原多孔海绵，其上接种捐赠者成纤维细胞。 3 3 真皮支架材料的性能标准 组织工程发展迅速，新理论、新技术不断涌现，不同的观点也存在争议。甚 至是有些术语及翻译也尚未做到完全规范和统一。虽然缺少统一的标准，但通过 实验研究与理论分析，仍在某些方面达成了被普遍接受的共识。皮肤组织工程真 皮支架材料是皮肤组织工程的基础与重点。它需要满足一定的物理、化学、生物 性能，以满足为细胞贴附、生长、增殖、迁移提供良好环境的要求。 表1 2 理想真皮支架材料的性能标准【3 5 。8 】 t a b 1 2p e r f o r m a n c es t a n d a r d so fi d e a ld e r m a ls c a f f o l dm a t e r i a l 1 4 山东大学硕士学位论文 表1 2 显示皮肤组织工程对理想真皮支架材料的一些性能要求。通常，原料 构成决定着支架材料的生物活性，