（食品科学专业论文）虾青素高产菌株的推理筛选与发酵条件优化.pdf

g l u c o s p y r u v i ca c i d a c e t y lc o a a c e t o a c e t y lc o a h m g c o a m v a i p p d m a p p g p p f p p g g p p p h y t o e n e p h y t o f l u e n e t e t r a p h y d r o l y c o p e n e l y c o p e n e y - c a r o t e n e f l - c a r o t e n e e c h i n e n o n e c a n t h a x a n t h i n a d o n i r u b i n f l - c r y p t o x a n t h i n z e a x a n t h i n a d o n i x a n t h i a s t a x a n t h i n 说明 葡萄糖 丙酮酸 乙酰辅酶a 乙酰乙酰辅酶a 伊羟基p 一甲基戊二酰辅酶a 甲羟戊酸 异戊烯5 焦磷酸 二甲基烯丙基焦磷酸 栊牛儿焦磷酸 法尼焦磷酸 栊牛儿栊牛儿焦磷酸 八氢番茄红素 六氢番茄红素 四氢番茄红素 番茄红素 弘胡萝卜素 伊胡萝卜素 海胆酮 鸡油菌黄质 金盏花红素 伊隐黄质 玉米黄素 金盏花黄素 虾青素 目录 摘要1 a b s t r a c t 2 1 引言4 1 1 虾青素简介4 1 2 虾青素的生理学功能5 1 2 1 着色作用5 1 2 2 抗氧化作用5 1 2 3 抑制肿瘤作用6 1 2 4 增强免疫作用。6 1 2 5 其他作用6 1 3 虾青素应用7 1 3 1 水产养殖业7 1 3 2 医药、食品和化妆品行业7 1 3 3 其他应用。7 1 4 虾青素来源8 1 4 1 化学合成。8 1 4 2 生物获取8 1 5 红法夫酵母9 1 5 1 红法夫酵母的生物学特性9 1 5 2 红法夫酵母合成虾青素途径9 1 5 3 破壁方法1 1 1 5 4 高产菌株的选育1 2 1 5 5 摇瓶发酵培养基和发酵条件的优化1 4 1 6 本课题的研究目的、内容和意义。1 6 1 6 1 研究目的和意义1 6 1 6 2 研究内容1 6 2 材料与方法17 2 1 材料与仪器。1 7 2 1 1 菌种1 7 2 1 2 主要实验材料1 7 2 1 3 主要仪器l7 2 1 4 主要溶液18 2 1 5 培养基18 2 2 实验方法1 9 2 2 1 红法夫酵母生长曲线的测定1 9 2 2 2 种子培养1 9 2 2 3 摇瓶发酵培养19 2 2 4 紫外诱变1 9 2 2 5 微波诱变。2 0 2 3 分析方法。2 0 2 3 1 生物量的测定2 0 2 3 2 红法夫酵母内虾青素的破壁提取2 0 2 3 3 分光光度法测定提取液中虾青素的含量2 1 2 4 实验设计与数据处理2 1 3 结果与分析2 2 3 1 虾青素高产菌株的推理选育2 2 3 1 1 出发菌株的纯化。2 2 3 1 2 出发菌株的生长曲线2 2 3 1 3 紫外线诱变红法夫酵母的研究。2 3 3 1 4 微波诱变红法夫酵母的研究2 8 3 2 摇瓶发酵培养基和发酵条件的优化3 2 3 2 1 摇瓶发酵培养基和发酵条件单因素实验3 2 3 2 2 摇瓶发酵条件p b 实验3 8 3 2 3 中心组合实验3 9 3 3 红法夫酵母破壁条件的研究4 3 3 3 1 不同溶剂对红法夫酵母虾青素提取效果的影响。4 3 3 3 2 不同微波频率对红法夫酵母虾青素提取效果的影响。4 3 3 3 - 3p l a c k e t t b u r m a n ( p b ) 试验及结果4 4 3 3 4 最陡爬坡试验及结果4 5 i i 结果4 6 4 讨论5 1 4 1 高产虾青素菌株的选育5 1 4 2 摇瓶发酵培养基和发酵条件的优化5 1 4 3 微波辅助二甲基亚砜破壁方法5 2 5 结论5 3 5 1 高产菌株的推理筛选5 3 5 _ 2 摇瓶发酵培养基和发酵条件的优化试验5 3 5 3 微波辅助二甲基亚砜破壁提取红法夫中虾青素工艺5 3 参考文献5 4 致 射6 4 攻读硕士学位期间发表的论文情况6 5 i l l 天然虾青素具有极强的抗氧化、抑制肿瘤、增强免疫力、着色以及清 除体内自由基等许多作用，近年来在食品、医药、饲料、水产、化妆品等 行业得到了广泛的应用。红法夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 是天然虾青素 最具有工业化生产前景的微生物资源。提高红法夫酵母合成虾青素的水平 是实现发酵法生产虾青素的关键。新技术措施及新理论的应用是提高红法 夫酵母合成虾青素水平的基础。本研究围绕提高红法夫酵母合成虾青素水 平这一核心内容，利用现代统计分析技术、现代生物技术、现代发酵技术， 系统进行了红法夫酵母中虾青素的破壁提取方法、高产菌株的推理选育、 摇瓶发酵培养基和发酵条件优化的研究。主要获得以下研究结果： 1 实验采用多次紫外线诱变、微波诱变推理选育，得到具有硫酸铜、 伊紫罗酮和二苯胺抗性的高产菌株。最终筛选获得一株遗传稳定性良好、 虾青素产量高的突变菌株t y - i 8 ，虾青素含量较出发菌株提高了4 9 倍。 2 实验选取了玉米浆作为初始发酵培养基，进行了摇瓶发酵培养基 和发酵条件优化，实验表明：浓度为1 的玉米浆为最优的氮源浓度，葡 萄糖：蔗糖( 1 ：3 ) 为最优的碳源。在此培养基基础上，对发酵条件进行 了优化，通过响应面规范性分析及验证试验获得回归方程：y = 1 3 9 6 0 2 7 + 0 0 2 2 4 3 8 x x 2 0 0 2 3 6 2 5 x x 3 0 0 4 7 8 8 7 x 5 0 0 6 4 1 7 1 x 2 x x 2 + o 0 0 9 2 5 x x 2 x x 3 0 0 0 1 1 2 5 x x 2 x x 5 0 0 8 1 9 4 6 x 3 x x 3 + 0 0 2 7 7 x x 3 x x 5 - 0 0 7 1 2 2 1 x x 5 x x 5 。通过模型预测和验证试验得到最优的发酵条件：初始p h 6 0 、装液量 2 8 3 m l 2 5 0 m l 、接种量5 8 、温度2 0 、转速2 0 0 r m i n ，虾青素产量较 优化前提高了8 6 1 。 3 利用响应面法对微波辅助二甲基亚砜破壁提取工艺进行优化，得 到回归模型： y = 1 5 0 8 1 3 9 + 11 6 6 7 5 x x 2 1 2 2 8 5 x x 3 - 2 4 9 0 1 5 x x 5 1 7 7 6 8 8 3 x x 2 x 2 + 4 8 1x x 2 x x 3 - 0 5 8 5 x 2 x x 5 2 7 0 11 8 3 x x 3 x x 3 + 1 4 4 0 4 x x 3 x x 5 2 1 4 3 4 8 3 x x 5 x x 5 。通过模型预测和验证试验得到破壁提取的最优 条件为：4 1 6 5 m h z 微波辅助，二甲基亚砜添加量5 1 m l g ，无水乙醇添加 量2 1 4 m l g ，破壁时间2 6 m i n ，浸提温度5 0 。c ，浸提时间1 5 1 m i n ，在此 条件下虾青素的提取效果较优化前提高了2 1 5 6 。 关键词：红法夫酵母；虾青素；诱变技术；推理选育；发酵条件优化 l 虾青素高产菌株的推理筛选与发酵条件优化 a b s t r a c t t h en a t u r a la s t a x a n t h i nh a sb e e n w i d e l ya p p l i e di nf o o d ，m e d i c i n e ，f e e d ， a q u a t i cp r o d u c t sa n dc o s m e t i ci n d u s t r ya n ds oo n ，b e c a u s eo fi t ss p e c i a le f f e c t t h a tc o n t a i n ss t r o n go x i d a t i o nr e s i s t a n c e ；i n h i b i t i n gt u m o rg r o w t h ，e n h a n c i n g i m m u n i t y , c o l o r i n ga n ds c a v e n g i n gr a d i c a li nv i v oa n ds oo n p h a f f i a r h o d o z y m ai st h em o s tp o t e n t i a lm i c r o o r g a n i s mt op r o d u c en a t u r a la s t a x a n t h i n i nt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n i m p r o v i n gt h ey i e l do fa s t a x a n t h i nb yl h a f d a r h o d o z y m au s i n gf e r m e n t a t i o ni st h ek e yt e c h n o l o g yo fp r o d u c i n ga s t a x a n t h i n t h ea p p l i c a t i o no fn e wt e c h n o l o g i e sa n dn e wt h e o r i e si st h ef o u n d a t i o no f i m p r o v ey i e l do fa s t a x a n t h i nb yp h a f f i ar h o d o z y m a 。t h ew a l lb r e a k i n g m e t h o do fa s t a x a n t h i nf r o mp h a f f i a r h o d o z y m a ，r a t i o n a ls e l e c t i o no f p r o d u c i n gs t r a i na n do p t i m i z a t i o no fm e d i u mo fs h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o n p r o c e s sw e r ei n v e s t i q a t e db yt e c h n o l o g yo fm o d e ms t a t i s t i c sa n a l y s i s 、m o d e m b i o t e c h n o l o g ya n dm o d e mf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y t h em a i n l yr e s u l t s o b t a i n e df r o mt h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ： 1 t h eh i g hy i e l ds t r a i no fa s t a x a n t h i nw a sr a t i o n a ls c r e e n e du s i n gt h e r e s i s t a n c e sc o p p e rs u l f a t e ，f l - i o n o n ea n dd i p h e n y l a m i n eb ym u l t i p l eu v m u t a g e n e s i s ，m i c r o w a v ei r r a d i a t i o n am u t a n ts t r a i nt v i 8 。、i t hab e t t e r g e n e t i cs t a b i l i t ya n dh i g h e r a s t a x a n t h i n y i e l d ，w a sg a i n e df i n a l l y t h e a s t a x a n t h i ny i e l do ft h i ss t r a i nw a s4 9t i m e sh i g h e rt h a nt h a to ft h eo r i g i n a l s t r a i n 2 i nt h es t u d yt h et o m s t e e pl i q u o rw a si n i t i a lf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n d t h em e d i u mo fs h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o nw a so p t i m i z e d t h ee x p e r i m e n t s h o w n1 c o r ns t e e pl i q u o rw a st h eb e s tn i t r o g e ns o u r c e ，g l u c o s e ：s u c r o s e ( 1 ：3 ) w a st h eb e s tc a r b o ns o u r c e o nt h eb a s e d ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n w a sg o n e t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a sg o tb yc a n o n i c a la n a l y s i so f r e s p o n s e s u r f a c e y = 1 3 9 6 0 2 7 + 0 0 2 2 4 3 8 x x 2 0 0 2 3 6 2 5 x 3 0 0 4 7 8 8 7 x x 5 0 0 6 4 1 7 1x x 2 x 2 + 0 0 0 9 2 5 x x 2 x 3 0 0 0 1 1 2 5 x x 2 x x 5 0 0 8 1 9 4 6 x x 3 x 3 + 0 0 2 7 7 x 3 x x 5 - 0 0 7 1 2 2 1x x 5 x 5 a f t e rm o d e l p r e d i c t i v e a n dv e r i f i c a t i o nt e s t t h e o p t i m u mc o n d i t i o n sa b o u tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n st h a tw e r ei n i t i a lp h 6 0 山东农业大学硕士学位论文 b r o t hc o n t e n t2 8 3 m l m l ，i n o c u l a t i o na m o u n to f5 8 ，t e m p e r a t u r ew a s2 0 a n dt h er o t a t i o ns p e e dw a s2 0 0 r m i n t h ey i e l do fa s t a x a n t h i nw a s8 6 1 h i g h e rt h a nt h ei n i t i a ly i e l d 3 t h ew a l l b r o k e na n de x t r a c t i o np r o c e s sb yd i m e t h y ls u l f o x i d ew i t h m i c r o w a v e a s s i s t e dw a so p t i m i z e db yt h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d t h e r e g r e s s i o ne q u a t i o nw a sg o tb yc a n o n i c a la n a l y s i so fr e s p o n s es u r f a c e y = 1 5 0 8 1 3 9 + 11 6 6 7 5 x x 2 - 1 2 2 8 5 x x 3 2 4 9 0 1 5 x x 5 1 7 7 6 8 8 3 x 2 x x 2 + 4 8 1 x 2 x x 3 0 5 8 5 x x 2 x x 5 - 2 7 0 11 8 3 x x 3 x x 3 + 1 4 4 0 4 x x 3 x x 5 2 1 4 3 4 8 3 x x 5 x x 5 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa b o u tw a l l - b r e a k i n ga n de x t r a c t i n gw e r ed i m e t h y l s u l f o x i d e ( 51m l g ) ，a n h y d r o u sa l c o h o l ( 2 14m l g ) ，c e l lw a l lb r e a k i n gt i m e ( 2 6m i n ) ，e x t r a c t i n gt i m e ( 15 1m i n ) ，e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e ( 5 0o c ) a n d m i c r o w a v e 疗e q u e n c yu n d e rl o wt a pp o s i t i o n ( 4 16 5m h z ) ，a f t e rm o d e l p r e d i c t i v ea n dv e r i f i c a t i o nt e s t u n d e rt h i sc o n d i t i o nt h ey i e l do fa s t a x a n t h i n w a s21 5 6 h i g h e rt h a nt h ei m t i a ly i e l d k e yw o r d s ：p h a f f i ar h o d o z y m a ；a s t a x a n t h i n ；m u t a t i o nt e c h n i q u e ；r a t i o n a l s e l e c t i o n ；o p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o n 3 虾青素高产菌株的推理筛选与发酵条件优化 1 引言 1 1 虾青素简介 虾青素( a s t a x a n t h i n ) 又名虾红素，化学名称为3 ，3 二羟基4 ，4 二酮基节，7 胡萝卜素，分子式为c 4 0 h 5 2 0 4 ，相对分子质量为5 9 6 8 6 。虾 青素是一种天然非维生素a 原的类胡萝卜素，是类胡萝卜素合成的最高级 别产物。虾青素的化学结构是由四个异戊二烯单位以共轭双键形式连接， 两端又有二个异戊二烯单位组成六节环结构，它有三种旋光异构体( 3 r ， 37 r ) ，( 3 s ，37 s ) ，( 3 r ，3 s ) ，如图1 。纯的虾青素是暗红棕色粉末，熔 点2 2 4 ，不溶于水及大多数无机溶剂，具有脂溶性，易溶于氯仿、丙酮、 苯和二硫化碳等有机溶剂( 伊文刚，2 0 0 9 ) 。虾青素广泛存在于生物界， 特别是甲壳纲动物( 如对虾、蟹) 、鱼类( 如蛙鱼、虹鳟鱼) 、鸟类( 如红 鹤、火鸡等) 的羽毛、藻类和真菌中。虾青素在生物体内常与蛋白质结合 而呈蓝紫色，蛋白质变性后才呈现橙红色( g i n k a i f 等，2 0 0 9 ) 。 h o h o 、p o 3 s ，3 s o h o 3 r , 3 s 图1 虾青素的化学结构式和三种旋光异构体( 摘自李贤宇，2 0 0 5 ) f i g1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r ea n dt h r e es t e r e o i s o m e r so f a s t a x a n t h i nm o l e e u l a r 1 2 虾青素的生理学功能 1 2 1 着色作用 虾青素是用于养殖鲑鱼、虹鳟鱼类着色的最主要的类胡萝b 素 ( z h a n gby 等，2 0 0 9 ) 。虾青素添加到饲料中应用于养殖业，使一些水 生动物的皮肤和肌肉出现健康而鲜艳的颜色，可以提高鱼虾、蛋类以及各 类观赏鱼类的色泽，提高产品竞争力。( 陈晓明等，2 0 0 4 ：周元元，2 0 0 6 ： 胡重江等，2 0 0 5 ；b u t t l el 等，2 0 0 1 ) 。余俊欣等针对室内高密度循环水 养殖白虾所面临的白虾色素不足的研究表明：在幼虾饲料中添加虾青素 4 0 m g k g ，连续投喂4 周之后，即可达到增色效果，其体色与室外养成并 无差异( 余俊欣等，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 抗氧化作用 天然虾青素是单线态氧的强大淬灭剂，具有强大的清除自由基能力， 是迄今为止人类发现自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化活性远远超过现有 气 癌性；抑制乳腺癌的生长等等( t a n a k a t 等，1 9 9 5 ；裴凌鹏，2 0 0 9 ；l e es h 等，1 9 9 7 ；g r a d e l e ts 等，1 9 9 7 ；g r a d e l e ts 等，1 9 9 8 ：c h e wbp 等， 1 9 9 9 ) 。免疫学研究表明，口服类胡萝卜素具有抗癌作用，能直接作用于 免疫系统，导致肿瘤缩小( b e n d i c h a ，1 9 9 0 ) 。 1 2 4 增强免疫作用 虾青素能显著影响动物的免疫功能，在有抗原存在时显著促进脾细胞 产生抗体的能力，增强t 细胞刺激下人体内血细胞免疫球蛋白的产生， ( j y o n o u c h ih 等，1 9 9 5 ；j y o n o u c h ih 等，1 9 9 6 ) 。o k a iy 等的研究表明 虾青素能增强小鼠释放白细胞介素和肿瘤坏死因子a ，具有最佳诱导细胞 分裂的活性和具有重要的免疫调节作用可作为免疫增强剂使用，其作用比 伊胡萝卜素和角黄素强得多( o k a iy 等，1 9 9 6 ) 。 1 2 5 其他作用 除了上述功能，虾青素还有光保护作用、预防心血管疾病、维护中枢 神经系统健康、抗炎作用以及延缓衰老保护细胞的作用( 张晓丽等，2 0 0 6 ) 。 口服虾青素能强化需氧代谢，可使人的肌肉力量和耐受力明显增强 ( l i g n e l la ，1 9 9 9 ) 。 6 1 3 虾青素应用 1 3 1 水产养殖业 水产养殖业是现阶段虾青素最大的市场。t o r r i s s e n 等的研究表明， 虾青素是水产动物必须的维生素，对它们的正常生长和健康繁殖有着至关 重要的作用( t o r r i s s e noj 等，1 9 9 5 ) 。现阶段虾青素已经广泛应用于大 马哈鱼、鲑鱼、鳟鱼、红鲷鱼和罗氏沼虾等水产动物的养殖中。将虾青素 添加到饲料中不但能改善它们皮和肉的色泽，而且还有利于提高增重率、 存活率和产卵率( w h y t e ，j nc 等，2 0 0 1 ；吕玉华等，1 9 9 9 ；v a s s a l l o a r 等，2 0 0 1 ) 。将虾青素添加到饲料中，提高了水产动物的产量，加强了产 品的市场竞争力，给水产养殖业带来了巨大的经济效益，同时水产养殖业 的健康和快速发展也促进了虾青素的研究和应用。 1 3 2 医药、食品和化妆品行业 虾青素在医疗和食品行业的应用主要是利用了虾青素超强的抗氧化 性、抑制肿瘤、抗炎和免疫促进作用，生产含虾青素的保健食品和药品。 含虾青素的保健食品对提高人体免疫力，延缓衰老和预防中老年人心脑血 管疾病有一定的功效，当今心脑血管疾病多发为虾青素的广泛应用提供了 条件。现在已经生产出天然虾青素软胶囊、虾青素油以及虾青素微胶囊粉 等产品，应用到了医药和保健食品行业。 虾青素具有极强的抗氧化作用和保护皮肤免受光损伤的作用，含有虾 青素的化妆品可以有效的抵御紫外线损伤，延缓皮肤衰老以及防止皮肤光 老化，对皮肤有良好的保护作用。现阶段，虾青素以其优良的特性作为新 型化妆品原料广泛应用于膏霜、乳剂、唇用香脂、护肤品等各类化妆品中 ( 焦雪峰，2 0 0 6 ) 。目前虾青素已经在许多国家的品牌化妆品中得到了应 用，如a s t a c e l l ( 马来西亚) 、d e r m a e ( 美国) 、d h c ( 日本) 等。 1 3 3 其他应用 虾青素在蛋禽和家畜养殖业也有着广泛的应用，虾青素作为蛋禽和家 畜工业的饲料添加剂，可以提高母鸡的产蛋率、维持蛋鸡的健康，提高鸡 蛋蛋黄色素( l i g n e l la 等，1 9 9 8 ；b e r n h a r dk ，1 9 9 0 ) ，同时可提高孵化 率、降低鸡仔的死亡率、促进鸡仔的生长和饲料利用率、延长货架期等等。 7 虾青素高产菌株的推理筛选与发酵条件优化 1 4 虾青素来源 目前，虾青素的生产有化学合成和生物获取两种方式。人工合成的虾 青素作为食品添加剂己被美国食品药品管理局( f d a ) 批准使用，但价格 非常昂贵，同时人工合成的虾青素同天然虾青素在结构、功能、和安全性 等方面存在显著差异，因此人们非常关注天然虾青素的生产。目前天然虾 青素的生产主要有虾壳类提取、藻类提取以及真菌发酵等。 1 4 1 化学合成 e h o f l h l a n n l a r o e h e 公司于1 9 6 4 年首先成功地合成了角黄素 ( c a n t h a n x a n t h i n ) 。此后于8 0 年代末又合成了反式虾青素，商品名为 “c a r o p h y l l p i n k ”( t o r r i s s e noj ，1 9 8 9 ) 。虾青素化学合成法要经多步化学 和生物催化反应才能完成，因此人工化学合成相对比较困难，成本较高。 1 4 2 生物获取 1 4 2 1 虾壳类提取 水产动物虾、蟹、鱼类等体内含有虾青素，全球每年产生大量的水产 品加工废弃物，因此可以从水产品的加工废弃物中来提取虾青素，但是由 于水产品废弃物中虾青素含量很低，并且这些甲壳中灰分、几丁质的含量 较高，限制了虾青素的提取和利用，同时也提高了提取费用，因此这种方 法不适合虾青素的大规模生产，发展潜力不大( 刘宏超等，2 0 0 9 ；宋光泉 等，2 0 0 7 ) 。 1 4 2 2 藻类提取 自然界存在的一些藻类如衣藻( h a l a m i d o m o n a ss p p ) 、裸藻( e u g l e n a s p p ) 、伞藻( a c e t a b u l a r i a s p p ) 中含有虾青素。雨生红球藻( h a e m a t o c o c c u s p l u v i a l i s ) 是目前生产虾青素的主要藻类。在雨生红球藻中虾青素的积累 和藻细胞的生长往往呈相反趋势：即当条件适宜藻细胞生长时，虾青素的 合成速率通常较低；而虾青素的快速积累发生在不利于藻细胞生长的环境 条件下。利用雨生红球藻生产虾青素也存在着自养周期长的缺点，由于需 要光照，生产场所在一定程度上受到限制，并且藻类破壁释放虾青素困难， 很难实现工业化生产。 1 4 2 3 真菌 目前发现的含有虾青素的真菌主要有红法夫酵母( p h a f f i a r r h o d o z y m a ) 、粘红酵母( r h o d o t r u l a g l u t i n i s ) 和海洋红酵母等( 施安辉等， 2 0 0 2 ；伊文刚等，2 0 0 8 ) 。红法夫酵母于1 9 7 0 年在美国的阿拉斯加的高山 和日本北海道一带山区落叶松的渗出液中分离得到，是目前研究最为广泛 的生产虾青素的真菌。施安辉等人将一株野生型粘红酵母菌分别进行抗霉 素a 和e m s 诱变，筛选出虾青素高产菌株，虾青素产量较出发菌株提高 了2 3 2 倍同时菌株经扩大培养、提取，获得的虾青素添加剂，在对虾养 殖和蛋鸡饲养中做饲养试验，获得了理想的饲养效果，但也存在着虾青素 产量不高的缺点，同时粘红酵母合成虾青素的条件要求比较严格，特别是 虾青素和类胡萝卜素其转化规律研究的还不太清楚，这些都阻碍了对粘红 酵母发酵生产虾青素的研究。红法夫酵母是目前研究的最对的真菌，红法 夫酵母具有可以利用多种碳氮源、不需要光照、培养时间短、能够在发酵 罐中高密度培养的优点( e r i c a ，1 9 9 1 ；h o l p 等，1 9 9 9 ) 。由于野生红法夫 酵母的虾青素产量比较低，国内外的学者在高产菌株的选育方面做了很多 的研究并取得了很好的效果，但是仍然不能很好的满足工业化生产的需 要。 1 4 2 4 其他微生物 据报道，细菌m y c o b a c r e r i u m 和b r e v i b a c t e r i u m 以及土壤杆菌 a g r o b a c t e r i u ma u r a t i u m 中含有虾青素，但是这些菌体生长较慢且虾青素 含量很低，无工业应用前景( 张亮等，1 9 9 9 ；周元元，2 0 0 6 ) 。 1 5 红法夫酵母 1 5 1 红法夫酵母的生物学特性 红法夫酵母是真菌界( f u n g i ) 、真菌f - j ( e u m y c o t a ) 、半知菌亚门 ( d e u t e r o m y c o t i n a ) 、隐球酵母科( c r y p t o c o c c a c c e a e ) 、红法夫酵母属 ( d e u t e r o m y c o t i n a ) 的唯一一种。繁殖方式为无性繁殖中的芽殖，无有性 繁殖。红法夫酵母所产生的1 0 多种类胡萝卜素中，主要有虾青素、伊胡 萝卜素、1 ，胡萝卜素、h d c o 等，其中虾青素占4 0 9 5 ，虾青素含量随 菌种和培养方法的不同而有很大的差异。红法夫酵母具有有氧呼吸和发酵 两种代谢方式，有细胞壁，是目前主要用于生产虾青素的真菌。 1 5 2 红法夫酵母合成虾青素途径 目前红法夫酵母合成虾青素途径研究的很多，主要可以分为两个阶 9 虾青素高产菌株的推理筛选与发酵条件优化 段：第一阶段是胡萝卜素的合成阶段；第二阶段是夕胡萝i - 素经氧化 ( 酮基化) 和羟基化形成虾青素。对于第一阶段的合成路线目前已经有了 定论，而第二阶段可能有两种途径。徐学明等在综合研究前人的观点的基 础上，提出了较为系统的、全面的虾青素的生物合成途径。以葡萄糖为出 发底物，整个合成代谢途径大致可分为6 个阶段( 徐学明等，2 0 0 0 ) ： 第l 阶段：由葡萄糖出发，经e m p 途径生成丙酮酸，再氧化脱羧生成乙 酰辅酶a ，再经过一系列反应生成m v a ； 一 e m p 途径，一 氧化脱羧 一 g l u c o s l 一p y r u v i c a c i d l 一a c e t y l c o a m v a i l h m g - c o a 瓦ia c e t o a c e t y lc o a 第2 阶段：由m v a 生成i p p ； 第3 阶段：由i p p 生成g g p p ； i i p p l i 。m a p p 卜叫g p p 卜叫附卜叫g g p p 第4 阶段：由g g p p 经过二聚作用生成八氢番茄红素； l g g p p l p h y t o e n el 第5 阶段：在脱氢酶的作用下，由八氢番茄红素经过2 次脱氢作用生成四 氢番茄红素； 第6 阶段：从四氢番茄红素合成虾青素，可通过2 个途径：一个涉及到双 环中间产物，在加2 个酮基、2 个羟基之前，在伊环化酶( f l - c y c l a s e ) 的 作用下，先在碳链两端形成2 个白芷酮环；另一个涉及到单环中间产物， 先在碳链一师_ , t l j 形成一个白芷酮环，再加2 个酮基、2 个羟基，再在碳链另 论文 一端形成另一个白芷酮环。 1 5 3 破壁方法 酵母菌属于单细胞真核微生物，其细胞壁的厚度大约为0 1 0 3 哪， 当细胞老化时，厚度还会增加。酵母细胞壁的主要构成为葡聚糖 ( 3 5 4 5 ) 、甘露聚糖( 4 0 4 5 ) 、蛋白质( 5 1 0 ) 、几丁质( 1 2 ) 、 脂类( 3 8 ) 、无机盐( 1 3 ) ( 杨翠竹等，2 0 0 6 ) 。红法夫酵母特殊 的细胞壁结构导致它的细胞壁异常坚硬，不利于胞内虾青素的提取，给红 法夫酵母虾青素的研究、开发及利用带来了不便。 目前对红法夫酵母破壁方法的研究主要有酸热法破壁、碱法破壁、酶 法破壁和有机溶剂破壁。研究发现酸热法破壁所得提取液中总类胡萝卜素 浓度最高，碱法破壁次之，二甲基亚砜法破壁所得提取液中虾青素浓度最 高( 陈晓明等，2 0 0 0 ；倪辉等，2 0 0 4 ) 。由于虾青素在酸热条件下非常容 虾青素高产菌株的推理筛选与发酵条件优化 易降解，在碱条件下容易不可逆地发生酯化反应，故这两种方法破壁效果 虽好，提取液中总类胡萝b 素的浓度很高，但虾青素却受了严重的破坏。 实验表明以蛋白酶、甘露聚糖酶为主的复合酶( 李兴鸣等，2 0 0 6 ) 、胞壁 溶解酶( 曾子丹等，2 0 0 7 ) 以及将红法夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养( 蹇 华丽等，2 0 0 7 ) 可以对红法夫酵母进行有效破壁，但是破壁提取效果不能 达到最佳，综合考虑二甲基亚砜破壁法不仅能取得较好的破壁效果，而且 不会破坏虾青素的结构，是提取虾青素的理想方法。 微波技术应用于生物胞内耐热物质的分离提取具有选择性高、穿透力 强、加热效率高等显著的特点，具有方便、快速、简单、安全等优点。微 波破壁提取分离技术已经应用于各种天然有机物的提取工艺研究( 唐小俊 等，2 0 0 8 ；胡楠等，2 0 0 9 ；吴雪辉等，2 0 0 9 ；李宇亮等，2 0 0 9 ) 。微波破 壁技术与冻融法和超声波法相结合，在破壁提取方面取得了很好的效果 ( 杨自嵘等，2 0 0 6 ；王传虎等，2 0 1 0 ) 。微波破壁技术已经应用到雨生红 球藻中虾青素的提取工艺中( 王灵昭等，2 0 0 7 ) ，但是在红法夫酵母中虾 青素的破壁提取技术方面未见报道。 1 5 4 高产菌株的选育 1 5 4 1 推理选育 传统的选育方法一般是在经过诱变之后，根据孢子量多少、菌落的形 态及菌落色素分泌情况等来挑选菌落，而这些因素跟环境条件有很大关 系，因此传统的选育方法具有一定的盲目性，而且工作量大，效率低。推 理选育跟传统的选育方法的根本区别在筛选方法方面，高产菌株的推理选 育是根据产物的生物合成和代谢调控进行设计，有目的的定向筛选具有某 种特定性状的突变株，再从中筛选出高产菌株，来减少实验的工作量和育 种的盲目性，提高效率( 施巧琴等，2 0 0 2 ；王则，2 0 0 9 ) 。目前推理筛选 的理论依据有：耐碳分解阻遏物突变株的筛选、耐氮分解阻遏物突变株的 筛选、耐前提及结构类似物突变株的筛选、代谢途径障碍突变株的筛选、 形态突变株的筛选、耐自身产物及其类似物突变株的筛选、耐金属离子突 变株的筛选、耐磷酸盐突变株的筛选、抗次生代谢产物生物合成酶抑制剂 突变株的筛选、诱导酶突变株的筛选等( 朱传合，2 0 0 6 ) 。 1 5 4 2 高产虾青素菌株的诱变育种 1 2 山东农业大学硕士学位论文 诱变育种是一种常用的菌种选育方法，现阶段国内外的学者针对红法 夫酵母采用的诱变育种方式主要有紫外线诱变( j o h n s o n ，1 9 8 9 ) 、n t g 诱变( m e y e r ，1 9 9 3 ) 、e m s 诱变( c a l op 等，1 9 9 5 ) 、6 0 c o y 射线( 汪文 俊等，2 0 0 5 ) 、紫外线和氯化锂复合诱变( 谢虹等，2 0 0 6 ) 、紫外线诱变和 亚硝基胍诱变( 孙乃霞等，2 0 0 6 ) 、低能氩离子注入和紫外线复合诱变( 林 晓等，2 0 0 7 ) 、c s l 3 7 吖射线重复辐照，并交替进行亚硝基胍( n t g ) 诱 变( 王普等，2 0 0 2 ) 等，都取得了一定的效果。现阶段对高产虾青素菌株 的诱变选育多采用同一诱变因子多次诱变，多种诱变因子复合诱变，多种 筛选剂的组合筛选等。 微波对生物体同时具有热效应和非热效应，热效应主要是在磁场的作 用下产生能量的作用，非热效应目前在机理上尚未得到完整的解析和理 论。近年，微波技术作为一种新型的物理诱变育种技术，已经在工业微生 物的诱变育种方面得到了很好的应用，如霉菌( 郭峰等，2 0 0 4 ) 、衣康酸 产生菌( 梁海秋等，2 0 0 6 ) 、康乐霉素c 产生菌( 周建琴等，2 0 0 2 ) 、井 岗霉素生产菌株( 陈力力等，2 0 0 3 ) 、l 乳酸细菌( 徐伟等，2 0 0 9 ) 等菌 株改良方面做了许多研究，取得了很好的效果。同时还将微波诱变技术应 用到了高产生长素及耐药性根瘤菌株以及选育耐药高效溶磷苜蓿根瘤茵 ( 李剑峰等，2 0 0 9 ) 方面。将微波技术应用于红法夫酵母的诱变育种中海 未见报道，王灵昭等利用微波法对雨生红球藻中虾青素的最佳萃取溶剂和 最佳破壁方法进行了探讨究，并在单因素试验的基础上，利用响应面法对 微波萃取的条件进行了优化( 王灵昭等，2 0 0 7 ) 。 1 5 4 3 基因工程改良菌种特性以及原生质体融合技术 基因工程已经在改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品 方面得到了很好的应用，有关红法夫酵母生物合成途径的相关基因的研究 也有报道。w e r y 等建立并优化了用于红法夫酵母分子生物学的转化体系 ( w e r yj 等，1 9 9 8 ) 。m i s a w a 等应用异源互补技术对红法夫酵母类胡萝卜 素生物合成基因做了许多研究( m i s a w an 等，1 9 9 8 ) 。v e r d o e s 等人研究 了关于红法夫酵母番茄红素脱氢酶的基因( v e r d o e sjc 等，1 9 9 9 ) ，并将 筛选得到的x d e n d r o r h o u 的i d i 基因导