（植物学专业论文）麻疯树（jatropha+curcas+l）毒蛋白curcin基因及其启动子的初步研究.pdf

叫川大学硕上学位论文 麻疯树( 乃t r o p h ac u i “c h sl ) 毒蛋白c u r c i n 基因 及其启动子的初步研究 专业：植物学 研究生：张金平指导老师：陈放教授 摘要 麻疯树基因组中c u r c i n 基因家放的叫个成员的d n a 序列通过p c r 扩增被 分离并测序。序列分析表明它们不含内含子( i n t r o n ) ，都编码i 型核糖体失活 蛋白( t y p e - 1r i b o s o m e - i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ，t y p e 一1r i p s ) 。实验证明c u r c i n 基因 如同其他r i p s 一样，由基因家族编码。 这四个c u r c i n 基因家族成员和另两个已报道c u r c i n 基因家族成员开放阅读 框( o p e nr e a df r a m e ，o r f ) 的序列比对结果显示c u r c i n 基因家族成员可被分 为两个亚类群，亚类群之间各基因序列相似怔( i n d e n t i t y ) 为8 6 5 ，两个亚 类群内部各基因序列相似性分别为9 1 5 和9 9 6 。分别将这四个c u r c i n 基因 家族成员命名为c u r a 2 、c u r a 3 、c u r b 2 、c u r b 3 。对四条基因o r f 的生物信息 学分析得知c u r a 2 、c u r a 3 可能是麻疯树胚乳贮存的c u r c i n 基因家族成员的d n a 序列，而c u r b 2 、c u r b 3 可能是被真菌及逆境胁迫诱导的c u r c i n 基因家族成员的 d n a 序列。在用e x p a s y 蛋白质组学分析服务器( e x p e r tp r o t e i n a n a l y s i ss y s t e m p r o t e o m i c ss e r v e r ) 进行比较模建( c o m p a r a t i v em o d e l i n gm e t h o d ) 过程中发现， c u r a 系列基因所编码的多肽链都可以产生三维结构，而c u r b 系列基因所编码 的多肽链却不能产生三维结构，推测其具有与其他同源r i p s 不同的三维结构。 s o u t h e r n 杂交结果显示，麻疯树基因组中至少有三个以上c u r c i n 基因家族成员。 根据已报道的麻疯树毒蛋白c u r c i n 基因全长序列，设计合成三对p c r 引物， v 四朋1 大学 哦 ：学位论文 从麻疯树基因组中扩增出五条启动子，分别命名为c p a l 、c p a 2 、c p a 3 、c p a 4 、 c p a 5 。将所得序列与已知麻疯树毒蛋白c u r c i n 启动子序列比对分析，发现麻疯 树毒蛋白c u r c i n 基因启动予区存在部分变异，变异涉及到几个假定的顺式调控 元件。五条启动子片段大致来源于三个基因，其中c p a l 与c p a 2 同属一条基因 的不同长度的片段，c p a 3 与c p a 5 副属另一条基因的不同长度的片段，而c p a 4 与前两条基因都不在同一基因序列上。随后，将五个麻疯树毒蛋白c u r c i n 基因 启动子片段插入用b a m hi 和h i n d i i i 双酶切切除了c a m v3 5 s 启动子的p b l l 2 1 载体中，成功构建了麻疯树毒蛋白c u r c i n 基因启动子表达载体p b i c p a l 、 p b l c p a 2 、p b i c p a 3 、p b i c p a 4 、p b l c p a 5 。 烟草叶片瞬时表达和g u s 组织化学染色实验证明，在用含有麻疯树毒蛋白 c u r c i n 基因启动子表达载体的农杆菌感染烟草叶片并共培养6 0 h r 以后，c p a l 、 c p a 2 启动子可以启动g u s 基因表达，而其余启动子在此期间不能启动g u s 基 因表达。将表达载体转入烟草形成再生苗，验证证明，一般条件下所有启动子 都不能启动g u s 基因在烟草植株叶片中表达。实验结果初步说明，c p a l 与c p a 2 启动子在受到某种信号分予的诱导后才能启动其下游基因表达，而在一般条件 下，c p a l 与c p a 2 处于受抑制状态，不能启动其下游基因的表达。而c p a 3 、c p a 4 、 c p a 5 的启动条件可能与c p a l 、c p a 2 不同。 本研究为麻疯树毒蛋白c u r c i n 基因家族的表达调控、分子进化提供了理论 基础。 关键词：核糖体失活蛋白麻疯树毒蛋白c u r c i n 基因基因家族启动子 v l 些型茎兰堡主兰堡垒墨 一 p r e l i m i n a r ys t u d i e so i lc u r c i ng e n e s a n dt h e i r p r o m o t e r si nj a t r o p h ac u r c a sl m a j o r ：b o t a n y m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：z h a n gj i n p i n gs u p e r v i s o r ：p r o f c h e nf a n g a bs r r r a c r f o u rp u t a t i v ef u l l l e n g t hc u r c i ng e n e s ，t e r m e dc u r a 2 ，c u r a 3 ，c u r b 2a n dc u r b 3 r e s p e c t i v e l y , w e r ei s o l a t e db yt h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p e r ) a m p l i f i c a t i o n a c c o r d i n gt o af u l l l e n g t hc u r c i ng e n es e q u e n c ed a t aa n dr e v e a l e dt oe n c o d et h e t y p e 一1r i b o s o m e i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ( m p s ) t h es e q u e n c ea l i g n m e n t a n da n a l y s i s o ft h ef o u rp u t a t i v ec u m i ng e n e sa n dt h eo t h e rt w or e p o r t e dc u m i ng e n e si n d i c a t e s t h a tt h ec u r c i ng e n e f a m i l yi nt h ej a t r o p h ac u r c a sg e n o m ec a nb ed i v i d e di n t ot w o s u b f a m i l i e s t h ei d e n t i t yo ft h eg e n es e q u e n c e si nt h et w os u b f a m i l i e si s8 6 5 ，a n d t h ei d e n t i t yo ft h eg e n es e q u e n c e si ne a c hs u b f a m i l yi s 9 1 5 o r9 9 6 o n e s u b f a m i l y se x p r e s s i o nm i g h tb ei n d u c e db ys t r e s s e s ，s u c ha sf u n g i ，l o wt e m p e r a t u r e a n dd r o u g h t t h eo t h e rs u b f a m i l ym i g h te x p r e s si nt h ee n d o s p e r mo fp h y s i cn u t s g e n o m i cs o u t h e r nb l o ts u g g e s t st h e r ea r et h r e eo rm o r ec u r c i ng e n ec o p i e si nt h e g e n o m eo fj a t r o p h ac u r c a s f i v ed n a p r o m o t e r so fc u m i ng e n e s ，t e r m e dc p a l ，c p a 2 ，c p a 3 ，c p a 4 ，c p a 5 ，i n t h ej a t r o p h ac u r c a sg e n o m e w e r ea m p l i f i e db yp c ra m p l i f i c a t i o n s e q u e n c e c o m p a r i s o ns h o w st h a tt h ef r a g m e n t sa r e d i f f e r e n ti ns o m ep a r t sf r o mt h ee x i s t e d s e q u e n c e d a t aa n ds o m ec i s r e g u l a t o r y e l e m e n t sa r ec o n c e r n e di nt h e s ep a r t s a n a l y s i so ft h e s ep r o m o t e r s s e q u e n c ed a t as u g g e s t st h e s ep r o m o t e r sr o o ti nt h r e e c u r e i ng e n e s ，s u b s e q u e n t l y ，t h ef i v ep r o m o t e r sw e r ei n s e r t e di n t op b l l 2 1r e o r 四川i 大学硕士学位论文 l a r g ef r a g m e n t sg e n e r a t e df r o md i g e s t i n gp b l l 2 1b yb a m hi a n dh i n d l i it o c o n s t r u c tt h ee x p r e s s i o nv e c t o r so ft h ep r o m o t e r s t h er e s u l t so ft o b a c c ol e a v e st r a n s i e n te x p r e s s i o na s s a ya n dh i s t o c h e m i c a lg u s a c t i v i t ys t a i n i n gs h o wc p a la n dc p a 2c a np r o m o t eg u sa c t i v i t ya f t e r6 0 h rc o - c u l t u r e ， b u tt h eo t h e rp r o m o t e r s ，c p a 3 ，c p a 4 ，c p a 5 ，a r en o ta b l et op r o m o t eg u s a c t i v i t yi n t h i s p e r i o d i nt h e l e a v e so ft h et r a n s g e n i ct o b a c c or e g e n e r a t e dp l a n t l e t s ，a l lt h e p r o m o t e r sc a n n o tp r o m o t eg u sa c t i v i t y t h i sr e s u l t ss u g g e s tc p a la n dc p a 2c a nb e i n d u c e db ys o m es i g n a l s ，b u tc p a 3 c p a 4 ，c p a 5m a ya c td i f f e r e n t l y t h i sr e s e a r c hi sa ni m p o r t a n tf o u n d a t i o nt os t u d yt h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o n m e c h a n i s ma n dm o l e c u l a re v o l u t i o no fc u r c i ng e n e f a m i l y k e yw o r d ：r i b o s o m e i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ( r i p s ) c u r c i n j a t r o p h a c u r c a s g e n e - f a m i l yp r o m o t e r i i 四川大学硕士学位论文 2 1 核糖体失活蛋白的酶学功能一 2 2 核糖体失活蛋白的一级结构与分类一 2 3r i p s 的三级结构一一一一一一一 3 r ip s 的基因结构和组织构成一 3 1i 型r i p 基因一一一一一一一一一一 32i i 型r ip 基因一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 4 2 4 2 4 5 4 7 4 7 4 8 3 ，3r l p 基因表达的调节一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一5 0 3 4r lp s 的自然分布、起源与分子进化一一一一一一一一一一一一一一一一一一5 1 4 i i 型r ip s 的进化适应性一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一5 3 5 研究展望一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一5 4 参考文献一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一5 5 致谢一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一6 2 声明一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一6 3 图片目录 第一章 图1 1 麻疯树核d n a 提取( a ) 与p c r 扩增c u r e in 全长基因( b ) 的电泳图一9 图1 2 六个麻疯树毒蛋白c u r ( ；i n 基因o r f 推定氨基酸序列的n j 距离树t 1 图1 3c u r a l 、c u r a 2 、c u r a 3 、c u r b l 、c u r b 2c u r b 3 基因推测氨基酸序列比对图一1 3 图1 4 同源蛋白比较模建法预测的c u r a 2 基因推测多肽链三维结构一一一1 4 图1 5 五条基因( c u r a 2 、a 3 、b 2 、b 3 和全长c l i r c i n 基因) 的启动子序列比对图一一1 7 图1 6s o u t h e r n 杂交确定c t j r c i n 基因家族成员的拷贝数一一一一一一一一一一一一1 6 第二章 图2 1 用三对引物( 5 j p l 一3 j p ，5 j p 2 - 3 j p ，5 j p 3 - 3 j p ) 分别从麻疯树核基因组中扩增d n a 片段的电泳图( 左) 以及用h jn d i h j f nb a m hi 双酶切测序载体的电泳图( 右) - - 3 0 图2 2 克隆得到c u r o i n 基因启动子( c p a l ，c p a 2 ，c p a 3 ，c p a 4 ，c p a 5 ) 与已报道c u r e i n 全长基因启动子( f l c 一5 ) 序列比对图一一一一一一一一一一一一一一一一一一一3 3 图2 3c l i f c i n 基因启动子表达载体构建示意图( 左) 与双酶切验证表达载体构建准确性 电泳图( 右) 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一3 4 图2 4 菌落p c r 鉴定根癌农杆菌转化子电泳图一一一一一一一一一一一一- - 3 2 i i i 四川大学硕士学位论文 图2 5 烟草叶片g u s 基因瞬时表达梯度共培养( 3 u s 染色照片一3 5 图2 6 烟草再生苗核d n a 的p c r 鉴定结果电泳图一一一一一一一一一一一一一3 6 图2 7 烟草再生苗叶片g u s 染色结果一一一一一一一一一一一一一一一一一一3 7 第三章 图3 1r ip s 作用于大鼠核糖体2 8 sr n a 的活性位点( 上) 以及三种r i p s 的一级结构对 比图( 下) 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一4 5 图3 2 美洲商陆抗病毒蛋白p a p 的三维结构一一一一一一一一一一一一一一一一一一4 6 图3 - - 3s a m b u c u $ n e r a 果实中s n a iv f 和s n a v f 的前体加工过程示意图一- - 5 0 表格目录 第一章 表1 1 六条c u r e i n 基因o r f 区的基本理化参数比较表一一一一一一一一一一 第二章 表2 1 烟草组织培养用m s 培养基配方一一一一一一一一一一一 1 0 第三章 表3 - - 1 商陆抗病毒蛋白的等价体一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一4 7 四川大学钡上学位论文 第一章麻疯树毒蛋白c u r e jn 基因家族成员的分离 与描述 1 引言 麻疯树( 妇帅砌c u r c a sl ) 是大戟科( e u p h o r b i a c e a e ) 麻疯树属( j a t r o p h a l ) 植物，广泛分布于世界热带亚热带地区，在我国主要分布于四川、云南、 贵州、广东、广西、海南、福建、台湾等省区，是一种多用途油料作物。其种 子胚乳中的毒蛋白c u r c i n 具有抗癌活性【”。c u r c i n 蛋白是麻疯树种子胚乳中大 量积累的贮存蛋白，是种子萌发的氮源。早期研究主要集中在c u r c i n 的毒性上 “】。近期，本实验室开始对c u r c i n 的分子生物学基础进行深入研究。林娟等人 首先从麻疯树种子胚乳m r n a 中克隆得到了c u r c i nm r n a 的c d n a ( g e n b a n k 登录号：a y 0 6 9 9 4 6 ) 以及一条c u r c i n 的基因组基因( g e n b a n k 登录号：a f 4 6 9 0 0 3 ) 【5 j 。随后，魏琴等人克隆得到一种被真菌及逆境诱导的c u r c i n 家族成员j f i p 的c d n a ( g e n b a n k 登录号：a y 4 3 5 2 1 4 ) 1 2 5 】。序列分析证明，这两种蛋白其实 都属于编码i 型r i p 的基因家族。目前已知的r i p s 有三种类型，其中i 型r i p s 的结构和功能是最基本的，它们具有r n an 糖苷酶( r n an g l y c o s i d a s e ) 活 性与多聚腺嘌呤核苷酸糖营酶( p o l y n u c l e o t i d e ：a d e n o s i n eg l y c o s i d a s e ) 活性。i 型r i p s 没有细胞结合位点，所以不能穿透正常细胞的细胞膜，因而只对那些主 动摄取外源物质的细胞如滋胚层细胞和癌细胞有毒性叽到目前为止，5 0 多种 i 型r i p s 已经被测序和或克隆。大多数含r i p s 的植物产生几种r i p 的等价形 式，这些r i p 的等价体可以一起出现在同一器官中，也可以在特定的器官中分 别表达。这些等价体或从一个基因家族不同成员的表达产生，或从一个基本基 因产物的不同加工过程和或糖基化产生1 8 】。c u r c i n 基因家族成员之间d n a 序列 高度相似的现象，使我们怀疑先前由基因组步查技术得到的c u r c i n 基因全长序 列( g e n b a n k 登录号：a f 4 6 9 0 0 3 ) 可能是一条来源不司基吲家族成员的拼接序 列【6 j 。这罩，我们根据这条序列设计引物，从麻疯树基因组d n a 中分离出四个 c u r c i n 基因家族成员的d n a 序列。此外，我们还利用基因组s o u t h e r n 杂交的 1 p q 川大学硕士学位论文 方法大致确定了c u m i n 基因在基因组中的拷贝数。 目前，应用x 一射线晶体衍射和核磁共振已经测定出了1 0 0 0 0 多种蛋白及 其复合物的结构，但是与已测定的3 0 多万种蛋白质序列相比，还有很大的差距， 大大地影响了人们对蛋白质结构和功能关系的研究。因此，发展一些可以不依 赖实验并较为准确地预测蛋白质结构的方法显得格外重要。蛋白质结构理论预 测的方法都是基于氨基酸一级结构决定蛋白高级结构的理论基础上的，大致可 以分为三类：比较模建法、反向折叠法和从头预测法。其中比较模建法 ( c o m p a r a t i v em o d e l i n gm e t h o d ) ，又称同源结构预测，是发展得最成熟的蛋白 质结构预测方法。这是一种根据大量已知的蛋白三维结构来预测序列已知而蛋 白未知的蛋白结构。若待模建蛋白序列与模板序列经比对( a l i g n m e n t ) 后序列 相似性( s e q u e n c ei d e n t i t y ) 在3 0 ( 也有人说3 5 、4 0 ) 以上，则它们可能 是同源蛋白，那么它们可能具有相同或相似的三维结构。同源蛋白模建的步骤 如下：1 ) 目标蛋白序列与模板序列的匹配：2 ) 根据模板结构构建目标蛋白结 构模型；3 ) 目标蛋白的结构保守区的主链模建；4 ) 结构变异区s c r s 的主链 模建：5 ) 侧链结构的预测；6 ) 对模建结构进行优化和评估【2 9 】。s w i s s m o d e l ( w w w e x p a s y o o r g s w i s s m o d s w l s s m o d e l h t m l ) 是常用的同源蛋白比较模建 服务器。本研究也是用这个服务器来对c u r c i n 基因家族成员来进行模建的。这 些生物信息学的分析对进一步研究c u m i n 基因的表达调控和基因进化提供了有 用的资料。 2 材料和方法 2 1 实验材料、试剂与仪器 2 1 1 试验材料 植物材料：麻疯树( j a 印o p h ac u r c a sl ) 成熟种子采集自四川攀枝花干热河谷 地区，在盆土中萌发生长2 月以上，采集新鲜叶片提取核d n a 。 菌株：大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) j m l 0 9 菌株由本实验室保种。 2 1 2 试剂与仪器 质粒载体：p m l 8 一t 载体购自t a k a r a 公司。 酶：d n a 聚合酶为v e n td n a 聚合酶，购自n e we n g l a n db i o l a b s 公司；限制性 核酸内切酶h i n d l i l 、b a m hi 、d r aj 、e c o r v 及连接溶液r 购自t a k a r a 公司。 2 p u 川大学碗上学位论文 引物：由赛百胜公司合成。 5 j p l ：5 一a a t 肖rt g g a at a g a ag a c t ft g 一3 3 j p 0 ：5 一a a c t ag t a g a a a c t tt a = r r tg t c 一3 提取介质i ：t r i s0 2 m o l l ，e d t a n a 25 0 m m o l l ，n a c io 2 5 m o l l ，p h 8 0 提取介质i i ：t r i s0 1 m o l l ，e d t a n a 22 0 m m o l l ，n a c l1 4 m o l l ， 2 ( m v ) c t 公a 3 ，p h 8 0 。 l b 液体培养基：胰蛋白胨1 0 9 l ，酵母粉5 l ，n a c l5 9 l ，用5 nn a o h 调p h 至7 0 。高压灭菌。l b 固体培养基即在液体培养基的基础上加入1 5 l 琼脂粉。 s o b 液体培养基：胰蛋白胨2 0 9 l ，酵母粉5 9 l ，n a c lo 5 9 l ，k c lo 1 9 9 ，l ， 用5 n n a o h 调p h 至7 0 ，高压灭菌。 s o c 液体培养基：在灭菌s o b 液体培养基中加入2 0 m m o l l 过滤除菌的葡萄糖。 d n a 凝胶回收试剂盒：购自杭州维特洁生化技术有限公司。 平末端d n a 片段克隆试剂盒：p g m te a s y 平末端d n a 片段克隆试剂盒，购 自天为时代公司。 抗生素：氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) 储存液浓度1 0 0 m m l ，使用浓度1 0 0 ug m e 。 抽滤除菌。购自a m e r s h a n 公司。 s o u t h e r n 杂交试剂盒：“d i gi - u 啦p r i m ed n a l a b e l i n ga n dd e t e r c f i o ns t a r t e rk i t i i ”购自r o c h e 公司。 w a s h i n gb u f f e r ：0 1 m o l l 马来酸( m a l e i c a c i d ) ，0 1 5m o i l n a c l ，p h 7 5 ，o _ 3 ( v v ) t w e e n 一2 0 ，1 5 2 5 可稳定存放。 m a l e i ca c i db u f f e r ：0 1m o l l 马来酸，0 1 5 m o i l n a c l ，用固体n a o h 调节p h 值到7 5 ，1 5 2 5 可稳定存放。 d e t e c t i o nb u f f e r ：0 1 m o l lt r i s h c i ，0 1 m 0 1 l n a c l ，p h 9 5 ，1 5 2 5 可稳 定存放。 b l o c k i n g b u f f e r ：用m a l e i ca c i db u f f e r 将试剂盒v i a l6 中的i o x b l o c k i n g b u f f e r 稀释成1 b l o c k i n gb u f f e r ，使用前新鲜配制。 a n t i b o d ys o l u t i o n ：使用前将试剂盒a 14 中的抗地高辛碱性磷酸酶 ( a n t i d i g o x i g e n i n a p ) 在1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，从表面吸取必要体积用b l o c k i n g b u f f e r 稀释1 ：1 0 0 0 0 ，2 8 可存放1 2 h r 。 2 0 s s c ：3 m o l l n a c l 、o 3 m o l l 柠檬酸钠，p h 7 0 ，高压灭菌。 胶片显影液d 7 6 ：5 2 。c 温水7 5 0 m l ，甲基对氨基酚硫酸盐2 9 完全溶解后加无 1 四川大学硕士学位论文 水亚硫酸钠1 0 0 9 ，加对苯二酚5 9 ，硼砂2 9 ，加水至1 0 0 0 m l 。 停影液：在一定体积的蒸馏水中滴数滴醋酸即可。 柯达酸性坚膜定影液f 5 ：6 0 。c 7 0 热水6 0 0 m l ，大苏打2 4 0 9 ，无水亚硫酸 钠1 5 9 ，2 8 醋酸4 8 m l ，硼砂7 5 9 ，铝钾矾1 5 9 ，加水至1 0 0 0 m l 。 p c r 仪：b i o m e t r a 公司生产的p e r s o n a lc y c l e r 。其它化学药品为进口或国产分 析纯试剂。 2 2 实验方法 2 2 1 麻疯树核d n a 的提取与纯度检测 根据w a n g 等人【9 】发表的提取植物核d n a 方法提取麻疯树叶片细胞核 d n a ：在液氮中研磨1 9 新鲜去主脉的麻疯树叶片，研磨同时加入少许p v p 粉 末。将研磨好的叶片粉末状物质转入5 0 m l 大离心管中，加入2 0 m l 冰冷的提 取介质i 和5 0 0 ul2 1 3 一巯基乙醇，在0 c 放置1 0 r a i n 。4 。c7 0 0 0 r p m 离心 1 0 m i n ，收集沉淀。加入5 m l 6 5 预热的提取介质i i 和1 0 ul 2 b 巯基乙醇， 6 5 水浴中保温2 0 至4 0 r a i n ，期间应不时振荡。加入等体积氯仿，异戊醇( 2 4 ：1 ) ， 混合均匀后，4 。c7 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，将水相转入另一离心管，然后重复本 步骤2 3 次。可在此步将水相分装至1 5 m l e p p e n d o r f 离心管中，每支小离心 管0 6 0 8 m l 液体。加入2 3 体积的冰冷的异丙醇( 体积允许条件下可以加2 倍体积冰冷乙醇) ，摇匀后- - 2 0 放置3 0 m i n 或更长时间以沉淀d n a 。在4 c 最高速离心5 m i n ，沉淀在室温下重悬于2 0 0ul 无菌水中，加1 2 体积的5 m o l l n a c i 溶液( 1 0 0 1 tl ) ，摇匀后，加两倍体积( 6 0 0 ul ) 的无水乙醇，- - 2 0 放 置3 0 r a i n 或更长时间。4 。c 最高速离心5 r a i n ，7 0 乙醇洗涤沉淀鼹次，在空气 中干燥l o m i n 。将沉淀溶解于无菌水或t e 溶液中。 应用分光光度法定量分析d n a 或r n a ，具体操作步骤如下【2 6 】：用t e 或 蒸馏水对待测样品做适量的稀释。用t e 或蒸馏水作为空白，在波长为2 6 0 n m ， 2 8 0n n l 及3 1 0l l r n 处调节紫外分光光度仪读数至零，加入样品溶液于三处波长 处读取o d 值，记录o d 值，并通过计算确定d n a 或r n a 的浓度和纯度。公 式如下：s s d n a = 3 3 ( o d 2 6 0 - - o d 3 1 0 ) 稀释倍数：d s d n a = 5 0 x ( o d 2 6 0 - - o d 3l o ) x 稀释倍数；s s r n a = 4 0 x ( o i ) 2 6 0 - - o d 3 l o ) 稀释倍数。o d 2 6 c l o d 2 8 0 对d n a 而言，大约为1 8 ，高于1 8 则可能有r n a 污染，低于1 8 则有蛋白质 污染。 4 纠j i l 大学砷上学位论文 2 2 2 聚合酶链反应扩增c u f c i n 全长基因 p c r 反应所用引物( 5 j p l 和3 j p 0 ) 根据已经提交g e n b a n k 的全长c u r c i n 基因( g e n b a n k 登录号：a f 4 6 9 0 0 3 ) 设计n 反应体系中将m g “浓度调至4 r a m 。 由于预计p c r 产物片段为1 8 0 0 b p 左右，故用具有3 一5 外切酶活性的高保 真d n a 聚合酶扩增该片段，以减少错配。p c r 设定程序如下：9 5 5 r a i n ，9 4 4 0 s e c ，5 6 4 0 s e c ，7 2 2 m i n ，第二步至第四步循环3 5 次，7 2 8 m i n 。 扩增结果用1 琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色检测。 2 2 3c u r c in 基因序列测定 先将p c r 产物用胶回收纯化，再在p c r 产物3 末端加腺嘌呤核苷酸， 乙酸铵提纯加a 后的p c r 产物，连接p m d l 8 - t 载体，并转化大肠杆菌j m l 0 9 感受态细胞，获得转化子后用菌落p c r 方法检测，检测阳性菌落送出测序。 p c r 产物凝胶回收操作按照试剂盒使用说明进行。回收的p c r 产物末端 加a 程序按照p g m te a s y 平末端d n a 片段克隆试剂盒使用说明进行：取d n a 片段水溶液1 7 ul ，加a 反应液4ul ，t a q 酶1ul ，7 2 水浴1 5 m i n 。用乙酸 铵纯化d n a 片段方法如下 2 7 1 ：将待纯化的d n a 反应体系转移至于净的1 5 m l 的e p p e n d o r f 离心管中，加入1 2 倍体积的7 5 m o l l 乙酸铵，充分混合均匀。 加入2 5 倍体积的9 5 乙醇溶液，混合均匀。冰浴3 0 m i n 。在台式离心机上以 最大速度离心1 5 m i n 。弃上清液，空气中晾干沉淀，用适量的灭菌水重悬沉淀。 将外源基因片段与t 载体连接起来的时候，应该事先估计外源基因片段的浓度 或摩尔数，保证外源基因片段与t 载体的摩尔数之比大致为3 ：1 2 8 。取t 载体 0 5u l 加外源片段d n ax “l ，加连接溶液i ( 0 5 + x ) ul ，连接体系放1 6 保温半小时或过夜。 大肠杆菌感受态制备与外源基因转化感受态细胞方法如下：【2 8 j 用氯化钙制 备大肠杆菌感受态细胞程序如下：从3 7 。c 培养1 6 2 0 h r 的细菌平板中挑取一 个单菌落( 直径2 3 m m ) ，转入1 0 0 m l s o b 培养基中。3 7 。c 剧烈振荡( 3 0 0 r p m ) 培养3 h r ，至o d l 6 0 0 = 0 3 - - 0 5 。将菌液转移到干净的并用冰预冷的5 0 m l 大离心 管中，在冰e 放置1 0 r a i n ，使培养物冷却至o 。在4 冷冻离心机中，4 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n 回收细胞。倒出上清液，将管倒置l m i v _ ，以使最后残留的痕星培养 液流尽。以1 0 m l 冰冷的o 1 m o l 几氯化钙溶液重悬每份沉淀，放于冰上。在4 冷冻离心机中，4 0 0 0 r p m 离一1 5 , 1 0 r a i n 回收细胞。倒出巴清液，将管倒置l m i n ， 四川大学顶一匕学位沦文 以使最后残留的痕量培养液流尽。每5 0 m l 初始培养物用2 m l 冰冷的0 1 m o l l 氯化钙溶液重悬。新鲜制备的感受态细胞可以直接用于转化外源基因。也可分 装小份，每支e p p e n d o r f 离心管中装1 0 0 ul 细胞悬液并加入7 uld m s o 。先 放液氮里冷冻，再转入7 0 冰箱储存。将新鲜制各的或一7 0 保存的1 0 0 ul 感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞悬浮。加入1 5ul 连接液， 轻轻混合均匀。冰上放置3 0 m i n 。4 2 水浴热激6 0 9 0 s e c ，冰上放置2 m i n 。 加4 0 0t lls o c 培养基，3 7 2 5 0 r p m 振荡培养l h r 。室温下4 0 0 0 r p m 离心5 m i n ， 用枪头吸去4 0 0g tl 上清液，用剩余的液体将细胞悬浮。用此悬浮菌液涂布盛 有固体l b 培养基的9 0 r a m 平板( 加入相应用作筛选标记的抗生素，如氨苄青 霉素、卡那霉素等) ，此培养基平板要事先用2 0 ul 1 0 0 m m o l l i p t g 和4 0 “l 2 0 m g m l x g a l 涂布表面，若无需蓝白斑筛选则可以不加i p t g 和x g a l 。平板在 3 7 。c 下正向放置l i a r 使其吸收过多的液体，然后倒扣培养过夜。 菌落p c r 检测前须先将转化子重新划平板，这样既可以扩大细菌数量，又 可以防止菌落p c r 挑菌过程中挑取到未转化的质粒而出现假阳性反应。挑取待 测菌落作为模板，以5 j p l 和3 j p 0 作为引物进行p c r 。p c r 程序与本章实验方 法1 2 2 同。将验证后显示阳性的菌落作穿刺培养，送交t a k a r a 公司测序。 2 2 4 用生物软件进行序列分析 序列比对用v e c t o rn t iv i i 、m e g a 3 0 软件进行。序列同源性搜索用n c b i 数据库( n a t i o n a lc e n t e ro fb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，h t t p ：w w w n c b i n i h g o v ) 中 b l a s t 软件进行。启动子区功能基序在p l a c e 数据库( p l a n tc i s a c t i n g r e g u l a t o r yd n a e l e m e n t sd a t a b a s e ，h t t p ：w w w d n a a f f r c g o j p p l a c e ) 中进行。 蛋白质三维结构预测在e x p a s y ( e x p e r tp r o t e i na n a l y s i ss y s t e m ) p r o t e o m i c s s e r v e r 上的同源蛋白比较模建软件s w i s s m o d e l ( w w w e x p a s y o r g s w i s s m o d s w i s s m o d e l h t m l ) 进行。 2 2 5s o u t h e r n 杂交确定基因组中c u r ein 基因拷贝数 s o u t h e r n 杂交操作按照试剂盒使用说明手册e 描述的方法：1 ) d i g 探针 标记；2 ) 标硭效率检测；3 ) 模板d n a 的提取、酶切与电泳；4 ) d n a 转膜与固 定：5 ) 杂交；6 ) 免疫检测。 i ) 探针标记步骤如下：通过p c r 方法并胶回收获得lug 模板d n a ，p c r 6 列川大学坝上学位论文 程序与本章实验方法1 2 2 同，p c r 产物凝胶回收操作按照试剂盒使用说明进 行。用无菌水将1ug 模板d n a 定容剑1 6 u l 反应体系；9 5 。c 水浴中变性d n a 1 0 r a i n 后置冰上急冷；将试剂盒v i a l1 中的d i g h i g hp r i m e 混匀，加4 p l 到 变性的d n a 中，短暂离心以混合均匀后3 7 温浴2 0 h r 以上；6 5 温浴1 0 r a i n 以中断反应。 2 ) 标记效率检测：将标记好的探针用试剂盒v i a t3 中的d n a 稀释缓冲液 按照以下倍数稀释：i ，i 0 2 ，1 0 3 ，1 0 4 ，1 0 5 ，1 0 6 ，1 0 7 ；将稀释的探针各取1u l 点在尼龙膜上，在8 0 烘箱里烘2 h r 以使核酸固定在膜上；将膜转入2 0 m l m a l e i ca c i db u f f e r 中，1 5 2 5 缓慢振摇2 m i n ；在1 0 m l b l o c k i n gs o l u t i o n 中 浸泡3 0 m i n ；在a n t i b o d ys o l u t i o n 中浸泡3 0 r a i n ：用1 0 m lw a s h i n gb u f f e r 洗两 遍，每遍1 5 m i n ；在1 0 m ld e t e c t i o nb u f f e r 中浸泡2 5 m i n ：将尼龙膜的d n a 面朝上置于一块平整的保鲜膜上，取试剂盒b o t t l e5 中c s p d r e a d y t o u s e0 ，l m l 滴在膜上，立即折叠保鲜膜覆盖上去，使底物在尼龙膜上均匀铺开，注意要防 止气泡产生，1 5 2 5 温浴5 m i n ；把保鲜膜和尼龙膜放平，挤出多余液体，将 保鲜膜四边折叠密封好后，在暗室中覆盖一张x 光胶片，在显影央中显影2 4 h r 。 用如下方法将曝光后的x 光胶片洗出：将x 光胶片用镊子夹出置于胶片显影液 d 7 6 中显影1 0 s e c 以上。当出现影像后，即刻置于停影液中泡1 r a i n ，最后置于 柯达酸性坚膜定影液f - 5 中泡1 5 m i n ，即可取出观察。 3 ) 模板d n a 的提取、酶切与电泳：提取麻疯树核d n a 如本章实验方法1 2 1 所述。选择限制性核酸内切酶d r ai 与e c o r v 双酶切麻疯树核d n a 。d r ai 与 e c o r v 反应体系如下：根据麻疯树核d n a 的用量，在通用缓冲液h 中加适当 量的d r ai 与e c o r v 3 7 水浴6 h r 以上。酶切后按照以下程序浓缩d n a 2 7 1 ： 先估计待浓缩d n a 溶液体积，加入5 m o l l n a c l 使终浓度到0 1 m o i l ，混匀后 加2 倍体积的冰冷无