（环境科学专业论文）水产品中氨基糖苷类药物残留检测的液质联用分析法研究.pdf

西南大学硕士毕业论文 摘要 效率的影响。 2 获得了提取液的最佳净化条件 比较了不同固相萃取柱( s e p - p a kc 1 8 、h r x s p e 、o a s i sm c x 和o a s i ss c x 等) 的净化效果，通过添加七氟丁酸作离子对试剂，改变提取溶液p h 值，得到1 0 种氨 基糖苷类药物在固相萃取柱上的保留条件，从而实现目标物与杂质的分离。净化条 件为：h r x s p e 柱，活化时加入七氟丁酸，调节提后取溶液p h 至4 5 ，洗脱溶剂 为甲醇和氨水甲醇。 3 获得了氨基糖苷类药物的检测条件 试验了不同的色谱柱、流动相的组成和柱温等色谱参数和质谱参数，得到检 测条件为：乙腈1 0 0m m o l l 七氟丁酸( 8 0 ：2 0 ，v v ) 作流动相梯度洗脱，流速： 0 2m l m i n ，进样量：1 0 p l ，分析物在电喷雾正离子条件下，采用多反应离子监测 模式，用外标法定量。 4 建立了水产品中氨基糖苷类药物残留的检测方法 确立了标准曲线和线性范围、检测限、回收率和精密度等方法学参数。标准 曲线的线性范围：5 0n g m 1 一1 0 0 0n g m l ，对1 0 种氨基糖苷类药物的检出限为2 0n g g - 5 0n g g 。以5 0 、1 0 0 和2 0 0n g g 的浓度水平添加时，鱼肌肉组织中1 0 种药物的 回收率为6 6 5 1 0 8 o ，r s d 为2 4 0 1 8 8 ；虾组织中1 0 种药物的添加回收 率为7 4 9 - 9 9 1 ，r s d 为3 1 1 2 4 。检测1 0 种氨基糖苷药物，日内重复实验 的r s d 为1 2 8 4 ，日间重复实验的r s d 为2 6 8 7 。 与现有氨基糖苷类兽药残留检测方法比较，本文建立的液一质联用分析方法具 有定性定量准确、抗干扰力强的特点，可以同时检测1 0 种氨基糖苷类兽药，方法 灵敏度满足国际上对氨基糖苷类药物的最大残留限量要求，适合于水产品中氨基 糖苷类兽药残留的定量和确认分析。 关键词：氨基糖苷类药物：液一质联用；残留检测；水产品 曲南大学坝士学位论文 a b s t r a c t s t u d yo nt h ed e t e c t i o nm e t h o d f 1 0 r a m i n o g l y c o s i d e sr e s i d u ei na q u a t i cp r o d u c t s b yl i qu i dc h r o m a t o g r a p h ytandemliq u i d p b y - t a n m a s s s p e c t r om e t r y a p p l i c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：a nd o n g s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gj i n z h o n g a p r o f w a n gg u o m i n ab s t r a c t a m i n o g l y c o s i d e sa r eal a r g ec l a s so fa n t i b i o t i c st h a ta r ec h a r a c t e r i s e db yt w oo r m o r ea m i n os u g a r sl i n k e db yg l y c o s i d i cb o n d st oa na m i n o c y c l i t o lc o m p o n e n t a m i n o g l y c o s i d e s a r ec l a s s i f i e d a c c o r d i n gt o t h ep a t t e r no fs u b s t i t u t i o no ft h e c y c l o d o l i c h 0 1 t h et w om o s ti m p o r t a n ts u b c l a s s e sa r es t r e p t i d i n e ( s t r e p t o m y c i na n d d i h y d r o s t r e p t o m y c i n ) a n dd e o x y s t r e p t a m i n e ( g e n t a m i c i n ，k a n a r n y c i n ，a n dn e o m y c i n ) a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c sc a nb l o c kt h es y n t h e s i so fb a c t e r i a lp r o t e i nb yb i n d i n g i r r e v e r s i b l yt or i b o s o m e s ，w h i c hc a u s e sd a m a g et ot h ec e l lm e m b r a n e s a r n i n o g l y c o s i d e a n t i b i o t i c e sh a v eb e e nw i d e l yu s e df o rm a n yy e a r si nt h ep r e v e n t i o na n dc o n t r o lo f a n i m a ld i s e a s e s ，w h i c hc a u s e ss o m ep r o b l e m si nf o o d so w i n gt od r u gr e s i d u e s a sa r e s u l tt h e r ei si n c r e a s i n gp r e s s u r eo nl a b o r a t o r i e sr e s p o n s i b l ef o rf o o ds a f e t yt om o n i t o r t h eu s eo ft h e s ed r u g sa n de n s u r et h es a f e t yo ff o o df o rh u m a nc o n s u m p t i o n t h e r e f o r e ， i ti sv e r yi m p o r t a n tt oa c c u r a t e l yd e t e c tt h e s ea n t i b i o t i c so fl o wl e v e l so fi nf o o d a tp r e s e n t ，s o m em e t h o d si n c l u d i n gm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d ，i m m u n o a s s a ya n d i n s t r u m e n t a l a n a l y s i s c a nb eu s e dt o d e t e c t a m i n o g l y c o s i d e a n t i b i o t i c e si n a n i m a l d e r i v e df o o d s ，s u c ha sp o r ka n db e ep r o d u c t s i ni n s t r u m e n t a la n a l y s i s ，h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) i sw i d e l yu s e d h o w e v e r , t h e s em e t h o d s a r em o s t l yu s e dt od e t e c to n l yo n eo rm o r ea m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c e s ，a n ds e l d o m u s e di no t h e ra n i m a l d e r i v e df o o d se x c e p tp o r ka n db e ep r o d u c t s m o r e o v e r , t h e s e m e t h o d sp l a yl i t t l er o l ei nr o u t i n ed e t e c t i o no w i n gt ot h e i rt r o u b l e s o m eo p e r a t i o na n d l o we f f i c i e n c y l i q u i d c h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t h t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( l c m s m s ) h a ss o m ea d v a n t a g e so fh i g hs e n s i t i v i t y , a c c u r a t eq u a n t i f i c a t i o n ，a n dl e s s i n t e r f e r e n c ea n da b u n d a n td e t e c t i o ni n f o r m a t i o n a n di sm o r ee f f e c t i v ei nr e s i d u a l 曲南大学硕士学位论文 a b s t m c t c o n f i r m a t i o n i nt h i s t h e s i s ，s i m u l t a n e o u sd e t e c t i o nm e t h o df o rm u l t i r e s i d u e so f a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c si na q u a t i cp r o d u c t sw a se s t a b l i s h e db yu s i n gl c m s m s t e c h n i q u e m a i na c h i e v e m e n t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s 1 o b t a i nt h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o n sf o r a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c si n a q u a t i cp r o d u c t s ：t h ee x t r a c t i o ne f f c i e n c i e sw e r ee x a m i n e db ys o m ep r o t e i np r e c i p i t a n t s ， s u c ha sp e r c h l o r i ca c i d ，t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，a n ds o d i u mt u n g s t a t e t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c yw a st h eh i 曲e s tb y5 o f t r i c h l o r o a c e t i ca c i d i na d d i t i o n ， h o m o g e n i z a t i o na n ds o n i c a t i o n a s s i s t e de x t r a c t i o nw e r ep r o v e de f f i c i e n t l yt oe x t r a c t a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c si na q u a t i cp r o d u c t s 2 o b t a i nt h eo p t i m a lp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n sf o re x t r a c t s ：s e v e r a ls o l i d p h a s e e x t r a c t i o n ( s p e ) c o l u m n ss u c ha ss e p p a kc 1 8 ，h r x s p e ，o a s i sm c x ，a n do a s i ss c x w e r eu s e di nt h i ss t u d i e d ，a n ds o m ep u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea l s oe x a m i n e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep u r i f c a t i o ne f f i c i e n c yw a st h eh 曲e s tb yu s i n gh r x s p e c o l u m nw h e nh e p t a f l u o r o b u t y r i ca c i dw a su s e da si o np a i rr e g e n t ，p ho ft h ee x t r a c t i o n w a st o a d j u s t e da s4 - - - 5 ，a n dt h ec a r t r i d g ew a sw a s h e dw i t hm e t h a n o la n da m m o n i a m e t h a n o l ( 1 0 ：9 0 ，v v ) 3 o b t a i nt h ed e t e c t i o nc o n d i t i o n sf o ra m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s ：s o m e p a r a m e t e r s o fc h r o m a t o g r a p h i ca n dm a s ss p e c t r a ，s u c ha sc o l u m n s ，m o b i l ep h a s e s ，g r a d i e n tp r o g r a m a n dc o l u m nt e m p e r a t u r ew e r ee x a m i n e d t h u s ，t h ed e t e c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d ， i e ，l cs e p a r a t i o nw a sp e r f o r m e do naw a t e r sa c q u i t yu p l c t mb e h h i l i c ( 2 1 10 0 1 t 1 1 t i ，1 7 岬i d ) w i t hg r a d i e n te l u t i o nb yc h 3 c na n d10 0m m o l lo fh e p t a f l u o r o b u t y r i c a c i da tf l o wr a t eo f0 2m 1 2 m i n ，t h ei n j e c t i o nv o l u m ew e r e10g l m u l t i r e a c t i o n m o n i t o r i n g ( m r u m ) a n de x t e r n a ls t a n d a r dm e t h o dw e r ee m p l o y e di n q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s 4 e s t a b i l s h m e n to fs i m u l t a n e o u sd e t e c t i o nm e t h o df o rm u l t i r e s i d u e si na q u a t i c p r o d u c t s ：m e t h o d o l o g i c a lp a r a m e t e r si n c l u d i n gs t a n d a r dc u r v e ，l i n e a r i t yr a n g e ，l i m i to f d e t e r m i n a t i o n ，r e c o v e r ya n dp r e c i s i o nw e r eo b t a i n e d w h e ns p i k e dl e v e l so f5 0 ，10 0a n d 2 0 0n g g ，t h er e c o v e r i e so ft e na m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c si nf i s hs a m p l e sw e r ei nt h e r a n g eo f6 6 。5 一1 0 8 o ，a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s0 s d ) w e r el e s st h a n1 8 8 w h i l et h er e c o v e r i e so f a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c si ns h r i m ps a m p l e sw e r ei nt h er a n g eo f 7 4 9 9 9 1 ，a n dr s d sw e r el e s st h a n12 4 m o r e o v e r , e a c ho fa m i n o g l y c o s i d e a n t i b i o t i c sw a so b t a i n e db yu s i n gt h i sm e t h o d ，r s d si ni n t r a d a yd e t e c t i o nw e r ei nt h e r a n g eo f2 6 8 7 ) ，w h i l et h a ti ni n t e r - d a yd e t e c t i o nw e r ei nt h er a n g eo f1 2 8 4 f o r t e na m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s i na d d i t i o n ，t h es a t i s f a c t o r yl i n e a r i t yo fc a l i b r a t i o nc u r v e s i v 西南大学硕+ 学位论文 a b s t r a c t ( 5 0n g m l 1 0 0 0n g m l ) a n dl i m i t so f d e t e r m i n a t i o n ( 2 0n g g - 5 0n g g ) w e r eo b t a i n e d c o m p a r e dw i mt h ec u r r e n t l yu s e dm e t h o d t h ee s t a b l i s h e dm e t h o di nt h i st h e s i sh a s s o m e a d v a n t a g e s o fa c c u r a c yi n q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，a n ds t r o n g a n t i - d i s t u r b a n c ea b i l i t y , a n dt h es e n s i t i v i t i e sa r eb e l o wm a x i m u mr e s i d u el i m i to ft h e i n t e m a t i o n a ls t a n d a r d sf o rs i m u l t a n e o u sd e t e c t i o no f10a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s t 1 1 i s m e t h o di ss u i t a b l ef o ri d e l l t i 6 c 撕o na n dq u 锄t i f i c 撕o no fa m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c si n a q u a t i cp r o d u c t s k e yw o r d s ：a m i n o g l y c o s i d e sa n t i b i o t i c s ；l c - m s m s ；r e s i d u ed e t e c t i o n ；a q u a t i c p r o d u c t s v 独创性声明 学位论文题目：壅庄墨主氢基蕉莲娄药堑残留检测鲍速：厦送周金扭逵 至瞳 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 标注。 学位论文版权使用授权书 日 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： 签字日期：z 卯萝 年f 月 f 导师签名：式锭也忠 日 签字日期：山哆年月r 日 西南大学硕士学位论文 文献综述 第一章文献综述弟一早义陬琢怂 随着生活水平的逐步提高，人们对食品的需求由数量型转向质量型，对动物 产品质量的要求与目前畜牧产品质量之间的矛盾日渐突出，食品安全卫生问题引 起了全社会的普遍关注。如1 9 9 6 年英国爆发的“疯牛病事件”，1 9 9 9 年比利时发 生的“二嗯英污染事件”，2 0 0 0 年日本又发生牛奶安全事故，我国近年来发生的 “三聚氰胺事件”、出口肉鸡兽药残留问题等。这些发生在世界各地的食品安全 问题，主要涉及牛肉、猪肉、鸡肉、牛奶等畜禽产品和水产品，其影响范围广、 影响面大。食品安全问题不仅危害人们的身体健康、影响国际贸易、造成重大的 经济损失，严重的还将影响社会的稳定。 加入w t o 后，我国畜禽产品和水产品的国际贸易面临更加激烈的竞争环境。 就养殖业而言，我国动物产品的总体质量水平与发达国家相比仍有一定差距，基 本的食品安全还不能完全得到保证。目前，兽药不仅用于防治动物疾病，还用于 促进生长、同步发情等非治疗用途，由此引起的食品动物组织和产品中的药物残 留对公众健康和环境安全构成了潜在的威胁。动物性食品中的药物残留对人体健 康的影响，主要表现为变态反应与过敏反应、细菌耐药性、致畸作用、致突变作 用、致癌作用和激素作用等多方面。为保护人类健康和动物产品的出口贸易，控 制兽药在动物源性食品中的残留己成为我国的当务之急。为此，建立简便、可靠、 快速和灵敏的残留检测方法，对于保证动物源性食品安全，增强我国动物源性食 品在国际市场上的竞争力，促进养殖业的稳定、健康发展，都具有十分重要的战 略意义。 1 1 氨基糖苷类药物的结构和性质 1 1 1 氨基糖苷类药物的结构 氨基糖苷类化合物( a m i n o g l y c o s i d ea n t i o t i c s ) 是一类含有两个或多个氨基糖 ( a m i n o s u g e r ) 、氨基环多醇( a m i n o c y c l i t o ) ，并通过糖苷键键合而成的一类抗生 素的总称。除了链霉素和双氢链霉素的环多醇为链霉胍( s t r e p t i d i n e ) 外，其它的 氨基糖苷类化合物的环多醇通常为2 脱氧链霉胺( 2 - d e o x y s t r e p t a m i n e ) 。( 金有豫， 2 0 0 1 ) 其部分化合物的结构式如图1 1 所示。 西南人学硕士学位论文文献综述 h 链霉胺 s t r e p t a m i n c h o h o 2 h 2 脱氧链霉胺 2 - d c o x y s t r e p t a m i n e h ，d o h o 2 n h c h 3 rc h o c h 2 0 链霉素 o h 双氢链霉索 链霉胍 s t r e p t i d i n e hn h f | h n c h 2 n h 2 图1 - 1 几种氨基糖苷类化合物的结构 f i g1 - 1s t r u c t u r e so fs e v e r a la m i n o g l y c o s i d ea n t i o t i c s 1 1 2 氨基糖苷类药物的理化性质 表1 - 1 一些氮基糖苷类化合物的物理化学性质 t a b l el - 1p h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t i e so fs o m ea m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s _ 一i i i _ 一 化合物分子式相对分子质量熔点f c 氨基糖苷类化合物属于碱性化合物，水溶性好、难溶于有机溶剂，化学性质稳定。 2 两南大学硕士学位论文 文献综述 该类化合物多为结构差异性小的化合物的混合物，其中庆大霉素由氨基糖基团甲基化 程度不同的3 种化合物组成，新霉素由立体化学异构的化合物组成。各物质的物理化 学性质见表1 1 。 1 2 氨基糖苷类抗生素的毒性与危害 氨基糖苷类药物是通过各种放线菌发酵产生的，来源于链霉菌属 ( s t r e p t o m y c i s ) 的品种及其衍生物有链霉素、妥布霉素、大观霉素和核糖霉素等， 来源于小单胞菌属( m i e r o m o n o s p o r a ) 的品种及其衍生物有庆大霉素和小诺米星， 也有来源于微生物发酵产物的人工合成物，如卡那霉素等( 张永信，2 0 0 4 ) 。 通过与细菌的核糖体不可逆结合，氨基糖苷类抗生素能干扰细菌的蛋白质合 成，造成细胞膜损坏，从而抑制细菌的生长。氨基糖苷类抗生素属静止期杀菌药， 其杀菌作用具有浓度依赖性，仅对需氧菌有效，尤其是对需氧格兰氏阴性杆菌的 抗菌作用强；具有明显的抗生素后效应；具有初次接触效应( 林文良，2 0 0 1 ； e m a n u e l e ，2 0 0 9 ) 。 氨基糖苷类抗生素极性强，口服很难吸收，仅作肠道消毒用。全身给药多采 用肌内注射，吸收迅速而完全。氨基糖苷类抗生素与血浆蛋白的结合率较低，使 其在大多数组织中浓度都较低，脑脊液中浓度不到1 ，即使在脑膜发炎时也达不 到有效浓度。而在肾皮质和内耳内、外淋巴液中浓度较高，主要以原形经肾小球 滤过排泄，。肾衰竭患者可延长2 0 3 0 倍以上，从而导致药物蓄积中毒，这可以解 释它们的肾脏毒性和耳毒性( 王明仲，2 0 0 5 ；0 n e i l ，2 0 0 8 ) 。 氨基糖苷类抗生素主要用于敏感需氧格兰氏阴性杆菌所致的全身感染。虽然 近年来有多种头孢菌素类和喹诺酮类药物在临床广泛应用，但由于氨基糖苷类抗 生素对铜绿假单胞菌、肺炎杆菌、大肠杆菌等常见格兰氏阴性杆菌的抑制作用强， 所以仍然被用于治疗需氧格兰氏阴性杆菌所致的严重感染，如脑膜炎、呼吸道、 泌尿道、皮肤软组织、胃肠道、烧伤、创伤和骨关节感染等( p e r l e t t ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 对于败血症、肺炎、脑膜炎等格兰氏阴性杆菌引起的严重感染，单独应用氨 基糖苷类抗生素治疗时可能疗效不佳，需联用其它对格兰氏阴性杆菌具有强大抗 菌活性的抗菌药，如广谱半合成青霉素、笫三代头孢菌素类和喹诺酮类等。 在碱性环境中抗菌活性增强，氨基糖苷类药物几乎不能通过胃肠道吸收，因 此很少通过口服而一般通过注射给药，注射后能够很快分布到全身。氨基糖苷类 药物不能在体内代谢，主要通过肾小球过滤排泄到尿液中，体内的残留物在肾脏 内蓄积。 耳毒性包括前庭功能障碍和耳蜗听神经损伤。前庭功能障碍表现为头昏、视 力减退、眼球震颤、眩晕、恶心、呕吐和共济失调，耳蜗听神经损伤表现为耳鸣、 西南大学硕士学位论文 文献综述 听力减退和永久性耳聋，氨基糖苷类抗生素的耳毒性直接与其在内耳淋巴液中药 物浓度较高有关，可损害内耳柯蒂器内、外毛细胞的能量产生和利用，引起细胞 膜内n a + 、k + 、a t p 酶功能障碍，造成毛细胞损伤。临床上应避免与高效利尿药或 顺铂( c i s p l a t i n ) 等其它有耳毒性的药物合用( 张爱华，2 0 0 8 ) 。 氨基糖苷类抗生素主要以原形由肾脏排泄，还可通过细胞膜吞食作用使药物 大量蓄积在肾皮质，从而引起肾毒性，轻则引起肾小管肿胀，重则引起肾小管急 性坏死，但一般不损伤肾小球。肾毒性通常表现为蛋白尿、管型尿、血尿等，严 重时可产生氮质血症和导致肾功能降低。肾功能减退可使氨基糖苷类抗生素血浆 浓度升高，这又进一步加重肾功能损伤和耳毒性。各种氨基糖苷类抗生素的肾毒 性取决于其在肾皮质中的聚积量和其对肾小管的损伤能力。 最常见于大剂量腹膜内或胸膜内应用后，也偶见于肌内或静脉注射后。其原 因可能是药物与c a 2 + 络合，使体液内的c a 2 + 含量降低，或与c a 2 + 竞争，抑制神经 末梢a c h 的释放，并降低突触后膜对a c h 的敏感性，造成神经肌肉接头传递阻断， 引起呼吸肌麻痹，可致呼吸停止。肾功能减退、血钙过低和重症肌无力患者易发 生，服用葡萄酸钙和新斯的明( n e o s t i g m i n e ) 能翻转这种阻断。不同氨基糖苷类 抗生素引起神经肌肉麻痹的严重程度顺序依次为新霉素 链霉素 阿米卡星或 卡那霉素 庆大霉素 妥布霉素。 在动物饲养过程中，通常使用的氨基糖苷类抗生素包括安普霉素( 刘晓宇等， 2 0 0 7 ) 、链霉素、巴龙霉素、庆大霉素、新霉素、安普霉素，常用于治疗肉用小牛 和猪的大肠杆菌和沙门氏菌病，庆大霉素主要用于治疗猪大肠杆菌病和痢疾。目 前一些组织规定的残留限量标准见表1 2 ( 刘晓宇等，2 0 0 7 ；葛志荣，2 0 0 6 ) 。 表1 2 动物源性食品中一些氨基糖苷类药物的限量标准( m g k g ) t a b l e1 - 2m a x i m u mr e s i d u el i m i t so fs o m ea m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c si na n i m a l - d e r i v e df o o d 4 西南大学硕士学位论文 文献综述 1 3 氨基糖苷类药物残留检测方法 1 3 1 免疫分析法 免疫分析法适用于复杂介质中痕量组分的分离和检测，是以抗原、抗体的特 异性结合和可逆性反应为基础的分析技术，具有较高的选择性和灵敏度。免疫分 析法可分为放射免疫法、酶联免疫法、荧光免疫法和化学发光免疫法等。在氨基 糖苷类药物残留检测中，主要应用酶联免疫法和放射免疫法。 1 3 1 1 酶联免疫法 酶联免疫法( e l i s a ) 是利用酶标记的抗体或抗抗体进行的抗原一抗体反应。 j i n 等( 2 0 0 5 ) 采用胶体金标记免疫层析技术，直接竞争免疫法检测了牛奶中的庆 大霉素，获得的检出限为0 5 “l ，回收率为1 1 2 。h a a s n o o te ta 1 ( 1 9 9 9 ) 用3 种酶的免疫分析法测定了奶和肾中氨基糖苷类药物残留，样品用3 三氯乙酸处 理，检出限低于o 0 5 “g 。l o o m a n se ta 1 ( 2 0 0 3 ) 以新霉胺为免疫原，建立了牛 奶中庆大霉素、卡那霉素和新霉素残留检测的e l i s a 法，在人为污染的纯牛奶中 检测限分别为9g g l 、2 1p g ，l 和1 1 3p l 。x i a oe ta 1 ( 2 0 0 8 ) 采用竞争酶联免疫 法，获得猪肾中庆大霉素的检测限为2 7g g k g 。b a x t e re ta 1 ( 2 0 0 1 ) 用免疫生物 传感器检测巴氏灭菌奶中的链霉素，链霉素己二酰肼耦合的牛甲状腺球蛋白产生 多克隆抗体，抗体与双氢链霉素的交叉反应率为1 0 6 ，与其它抗生素没有交叉反 应。该法不需前处理和脱脂，5 m i n 即可获得结果，检测限为4 1 g l 。2 0 0 5 年， 欧洲1 4 家实验室采用e l i s a 法测定了牛奶中链霉素、双氢链霉素等4 种氨基糖苷 类药物，该法能达到欧盟的残留限量要求( g a u d i ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。上述方法中，j i n 应用新标记物，获得了较低的检出限；b a x t e r 用免疫生物传感器可检测多种兽药， 且检测速度快。 1 3 1 2 放射免疫法 放射免疫法( r 队) 利用放射性元素标记的抗生素与样品中的抗生素竞争结合 有特殊位点的受体，受体存在于微生物细胞表面并被添加到样品中，利用液体闪 烁仪计数，通过检测放射性元素标记的抗生素量，推算出样品中抗生素的含量。 该法在庆大霉素、链霉素和新霉素的残留检测中已有应用。秦燕等( 2 0 0 3 ) 对比 研究了e l i s a 和r i a 法检测鸡肝中链霉素残留的结果。e l i s a 法中，链霉素标准 在o 5p g l - 1 2 8 0g g l 的范围内线性良好，定量检测限为o 0 3m g k g ；r i a 法中， 链霉素标准在2 5p g l - 5 0 0 “l 的范围内相关性较好，筛选水平为0 2m g k g 。两 种方法的检测限、精密度和回收率均符合鸡肝链霉素残留监控的最大残留限量 ( m r _ , ) 要求。龙朝阳等( 2 0 0 5 ) 用放射标记药物和样品中的残留药物竞争可利 用的细胞受体部位，样品经离心除去上清液，沉淀在闪烁液中重新悬浮，用液 西南大学硕士学位论文 文献综述 体闪烁计测量放射强度，确定了试剂的阴性控制点和筛选水平，链霉素和庆大霉 素分别在o 5 0u l 、0 2 5 “l 呈良好的线性关系。与e l i s a 法比较，刚队法前 处理简单、快速，可用于动物源性食品中氨基糖苷类药物的快速检测，但由于存 在放射性污染，实验操作难于控制，费用较高，目前已较少应用。 1 3 2 微生物法 微生物效价法利用样品中抗生素抑制特定菌株的生长来检测抗生素的方法， 是当前各国药典推荐的测定抗生素的主要方法。微生物法具有操作简单、花费少 和分析速度快的特点，但灵敏度和特异性较差。该法在氨基糖苷类兽药检测中有 一定的应用。 我国出入境检验检疫行业标准( s n0 5 3 6 1 9 9 6 ) 采用杯碟法检测肉中的卡那霉 素残留量，检测低限为0 5 m g k g ，样品加标回收率为8 3 7 9 7 o 。蔡金华等( 2 0 0 4 ) 用1 0 的三氯乙酸提取牛奶中的链霉素，冷冻、离心分离，用枯草芽孢杆菌作为 检定菌进行测定，在牛奶中3 种添加浓度( o 2 0m g k g 、o 8 0m g k g 和1 6 0m g k g ) 的平均回收率为9 7 6 。王苏华等( 2 0 0 3 ) 以葡萄球菌为测试菌种，琼脂扩散法检测 鸡蛋中的新霉素，获得的最低检出限为0 2 5m g l ( g 。 还有利用2 ，3 ，5 氯化三苯基四氮唑( t r i p h e y et e t r a z o l l i u r nc h l o r i d e ，t t c ) 与抗 生素反应的显色作用来检测抗生素残留，其原理是嗜热链球菌( s t h e r m o p h i l u s ) 在牛乳中生长时会将无色的t t c 还原为红色的三苯甲瓒。当牛奶中存在抗生素时， 会抑制嗜热链球菌的生长，t t c 则无法被还原。黄怡君等( 2 0 0 6 ) 用t t c 法检测了 牛奶中的抗菌药物，链霉素、庆大霉素和卡那霉素的最低检测浓度分别为6 6 0 m g k g 、6 2 0m g k g 和6 2 0 0m g k g 。t t c 法的缺点是检测时间较长、灵敏度低。微 生物法多利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，根据量反应平行线原理，比较 标准品与供试品对接种试验菌产生抑菌圈的大小来定量确定残留量。在实际检测 中，微生物法的影响因素较多，菌种不易筛选，准确度和灵敏度较低。但微生物 法不需要大型仪器、样品可批量处理，如能开发出合适的样品前处理方法，微生 物法也有一定的应用前景。 1 3 3 仪器分析法 1 3 3 1 气相色谱法 气相色谱法( g c ) 适合于分析热稳定性高、挥发能力强的物质，检出限低， 在有机分析中应用较广。氨基糖苷类化合物具有高极性和难挥发性，用g c 法检测 需要进行柱前衍生化，以提高其挥发性。p r e ue ta 1 ( 1 9 9 8 ) 用三甲基硅烷咪唑( t m s i ) 和七氟丁酸酐( h f b i o ) 为衍生化试剂，通过两步衍生化测定庆大霉素和卡那霉 素，气相色谱一电子捕获检测器( g c e c d ) 检测，质谱确证，在2p g 2 0 0g g 的线 西南大学硕士学位论文文献综述 性范围内，该法灵敏有效。 1 3 3 2 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h p l c ) 常用于难挥发、强极性物质的分离检测，因其专一 性强和灵敏度高在药物检测中得到广泛的应用。氨基糖苷类化合物适合于采用 h p l c 法检测。由于氨基糖苷类化合物没有特征的紫外吸收生色基团，常根据其分 子中的活泼基团( 如氨基和羰基) 与衍生化试剂反应生成有紫外吸收或有荧光的 物质，采用紫外检测或荧光检测。衍生化方法包括柱前衍生化和柱后衍生化，常 用的衍生化试剂有邻苯二甲醛( o p a ) 、茚三酮、9 一芴基甲氧基碳酰氯( f m o c c 1 ) 和1 ，2 萘醌4 磺酸钠( n q s ) 。 在蜂产品的残留检测中，陈晓红等( 2 0 0 4 ) 用n a o h 和n q s 双试剂柱后衍生 化，荧光检测器检测( 激发波长和发射波长分别为2 6 3n i n 和4 4 7n l t l ) ，获得的回 收率为8 7 9 0 , 4 - 9 3 8 。该法采用混合提取液，简化了提取步骤。周萍等( 2 0 0 6 ) 用h c l 0 4 沉淀蜂王浆中的蛋白质，优化c 1 8 和苯磺酸小柱的净化条件，有效去除杂 质干扰，检测条件与陈晓红方法相似，检测限达到0 0 0 5m g k g 。赵李霞等( 2 0 0 5 ) 用酸性甲醇溶液提取蜂蜜中的链霉素，也获得比较理想的效果。在其它基质的残 留检测中，e d d e re ta 1 ( 1 9 9 9 ) 用h c l 0 4 提取动物源性食品中的链霉素，阳离子交 换柱和c 1 8 柱固相萃取( s p e ) 净化，n a o h 溶液柱后衍生化，h p l c f d 检测( 激 发波长为2 6 0 n i n ，发射波长为4 3 5n m ) ，蜂蜜中的检测限为0 0 0 5m g k g 。王立等 ( 2 0 0 6 ) 采用类似方法测定水产品中的链霉素，获得的检出限为0 0 1 0m g k g 。 f e n n e l le ta 1 ( 19 9 5 ) 用k h z p 0 4 n a s 0 4 溶液( p h8 8 ) 提取牛奶和动物组织 中庆大霉素，邻苯二甲醛衍生化，h p l c u v d 检测( 3 3 0r i m ) ，获得的检测限分别 为0 6r t g k g 和1g g k g 。姜莉等( 2 0 0 5 ) 用h 3 p 0 4 溶液提取鲜牛奶中的链霉素，柱后 衍生荧光检测，检出限为0 0 0 5m g k g 。董晓庆等( 2 0 0 5 ) 用三氯乙酸沉淀蛋白质， o d s c 1 8 柱净化，n q s 柱前衍生化，h p l c u v d 检测( 2 5 2n m ) ，在肌肉、肝脏和 肾脏中链霉素的最低检测限为1 2 0g g k g 、1 2 3p g k g 和2 1 8g g k g 。p o s y n i a ke t a 1 ( 2 0 0 1 ) 在检测猪肉、肝和肾