（环境工程专业论文）用木糖渣联产乳酸和聚氨基葡萄糖的条件优化.pdf

山东建筑大学硕士学位论文 摘要 木糖渣是工业生产中玉米芯经酸水解制取木糖后剩下的纤维残渣，量大而集中目 前这些纤维废弃物不但没有得到有效的利用，反而造成严重的环境污染乳酸是生产聚 乳酸的材料，用聚乳酸可进一步生产生物可降解塑料以减少塑料制品对环境造成的白色 污染，这就导致了对乳酸需求量的急剧增长。聚氨基葡萄糖作为一种安全、无毒、高效 的微生物絮凝剂，在当前水资源短缺和水价提高的情况下，为水质提升处理及回用技术 提供了可靠的技术保证。本论文就是以木糖渣为原料通过米根霉l y - 0 7 发酵同时生产需 求不断递增的乳酸与用于水质安全无毒净化处理的微生物絮凝剂聚氨基葡萄糖，通过对 转化过程的研究和优化，为纤维废物资源的开发应用提供数据参考。 实验中，采用纤维素酶对原料木糖渣进行酶解，把其中的纤维素成分生物转化为还 原糖，研究p h ，温度，底物浓度，酶浓度等因素对酶解过程的影响，提高木糖渣向还原 糖的转化率；将酶解液用于米根霉l y - 0 7 发酵制乳酸，研究米根霉l y - - 0 7 在酶解液中的 生长形态并探索菌球的形成条件，采用单因素和正交实验依次确定培养基的最佳配比和 培养条件的最优组合，以使乳酸得到最大的转化率；收集发酵废液中的菌体生物量，用 化学法提取菌体中的聚氨基葡萄糖，分别对稀碱脱蛋白和浓碱脱乙酰基的条件进行优化， 最终获得与乳酸联产的高效、可生物降解的微生物絮凝剂。所得结果如下： ( 1 ) 本实验所用的纤维素酶较适宜的p h 范围为5 5 4 ，属于一种酸性酶。该纤维 素酶对木糖渣进行酶解的最佳条件为：p a 5 2 1 温度5 5 ；纤维素酶添加量4 0 u ( g 木 糖渣) ；木糖渣底物浓度1 0 0g l 。在此最佳条件下水解木糖渣，2 4 h 时水解完全，最终 所得酶解液中还原糖浓度为2 7 5 2 9 l ，对木糖渣的相对转化率为2 7 5 2 。 ( 2 ) 米根霉l y - 0 7 茵丝生长及孢子萌发速度较慢，采用酵母粉作为氮源以加快其生 长及萌发速度；同时，将发酵液的起始p h 值降低至2 5 以抑制菌丝的快速旺盛生长，避 免由于菌丝过快生长缠绕而引起菌体结团结块现象，得到了理想的菌体形态一直径2 m m 以内的菌球。 ( 3 ) 用浓缩后的木糖渣酶解液进行米根霉l y - 0 7 发酵产乳酸，通过正交试验确定了 培养基成分的最佳配比为：酶解液中还原糖浓度为5 ，酵母粉0 3 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 0 4 ，z n s 0 4 - 7 h 2 00 0 0 7 5 ，k h 2 p 0 4o 0 2 ，；培养条件的最佳组合为：温度3 3 ( 2 ， 山东建筑大学硕士学位论文 转速1 4 0 r p m ，装液量5 0 m l ，纱布层数1 0 层。在此最优条件下，米根霉l y - 0 7 乳酸发酵 的最终发酵时间为7 2 h ，此时乳酸的浓度达到了2 9 3 9 l ，对还原糖的转化率相应为 5 8 6 。 ( 4 ) 用化学法提取米根霉l y - 0 7 菌体中的聚氨基葡萄糖，确定了稀碱脱蛋白的的较 优条件为：在体积三倍于湿菌体、浓度为5 的n a o h 溶液中沸水浴处理2 h ：浓碱脱乙 酰基正交实验的优化结果为：n a o h 溶液的浓度4 0 ，处理温度l l o ，处理时间2 h 。 其中，n a o h 溶液的浓度对脱乙酰度的影响最大，且浓度大时，处理效果较好。最后得 到了灰白色片状的聚氨基葡萄糖，脱乙酰度为8 6 3 ，相对于干菌体的得率为5 4 。其 中，由于干菌体中碳酸钙的存在，使实际得率相对于理论得率偏低。 本项研究利用木糖渣为出发原料，用特征性微生物米根霉l y - 0 7 联产乳酸和微生物 絮凝剂聚氨基葡萄糖，经过研究为形成新的环境生物技术工艺奠定数据基础，从而为草 质纤维废弃物的资源化利用和新产品开发提供新的技术途经。通过应用基础性研究不但 为今后生物质利用形成新的经济增长点，而且还会带动本技术领域研究逐步深入。因此， 本项研究具有科学与技术意义。 关键词：木糖渣，米根霉l y - 0 7 发酵，乳酸，聚氨基葡萄糖，微生物絮凝剂 n 山东建筑大学硕士学位论文 o p t i m i z a t i o no fc o - p r o d u c t i o no fl a c t i ca c i da n dc h i t o s a nf r o m p r e t r e a t e dc o r nc o b d uh u i ( e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db yl u a nx i n g s h e a b s t r a c t p r e t r e a t e dc a 3 mc o bi sak i n do fc e l l u l o s i cw a s t el e f ti i lt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o np r o c e s s o fx y l o s e , w h i c hi sm a d ef r o mo o r nc o bh y d r o l y z e db ya c i d t h e r eh a sb e e nag r e a ta m o u n to f i tu s u a l l yp o o l e di n t e n s i v e l ya ts o m ep l a c e n o w a d a y s , t h e s ec e l l u l o s i cw a s t ea r cn o ti nf u l l u t i l i z a t i o n , b u th a sc a u s e ds e r i o u se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n l a c t i ca c i dc a nb eu s e dt o s y n t h e s i z ep o l y l a c t i ca c i d , af e e d s t o c kc h e m i c a lf o rb i o d e g r a d a b l ep l a s t i cw h i c hi 暑u s e d 勰- s u b s t i t u t i o nt ol i g h t e ne n v r i o n m e n t a lp o l l u t i o nc 羽【l s e db yp l a s t i c a sar e s u l t , l a c t i ca c i di si n g r e a td e m a n d t h e r ei sal a c ko fw a t e ri 跫s o u i o ca n dt h ew a t e rp r i c ei sr i s i n g i nt h i sc o n d i t i o n , c h i t o s a na s - k i n do fs a f e , n o n t o 】【i c ，h i g he f f i c i e n tm i c r o b i a lf l o c c u l a n t , s u p p l i e sr e l i a b l e t e c h n i c a lg u a r a n t e ef o rt h et e c h n o l o g yo f w a t e ra d v a n c e df f e a t m e n ta n dr 既l s o t h eo v e r a l lg o a l o ft h i ss t u d yw a st od e v e l o pa ni n n o v a t i v ep r o c e s sf o rl a c t i ca c i da n dc h i t o s a nc o - p r o d u c t i o n u s i n gp e l l e t i z e d 鼬咖o r y z a el y - 0 7f r o mp r e t r e a t e do o mc o b t h ep r o c e s so fc o n v e r s i o n w a ss t u d i e da n do p t i m i z e d , h o p i n gt op r o v i d ed a t a 时c 】f e 黝c ef o rt h eu t i l i z a t i o na n d e x p l o i t a t i o no f c e l l u l o s i cw a s t er o s o u l p 冶 i nt h i ss t u d y , c e l l u l a s e sw e r el 函e dt oh y d r o l y z ep r e t r e a t e dc o mc o b ，a n dt h ec e l l u l o s i c c o m p o n e n ti ni tw a sd e c o m p o s e di n t or e d u c i n gs u g e r t h ei n f l u e n c e so fs o m ef a c t o r s , s u c ha s t h ep h ，t e m p e r a t u r e , s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n d 锄z y n l ec o n c e n t r a t i o n , w e l er e s e a r c h e do i l t h ep r o c e s so f h y d r o l y z a t i o nb yc e l l u l a s e s ，f o rah i g h e rc o n v e r s i o nr a t eo fr e d u c i n gs u g e rf r o m p r e t r e a t e dc o mc o b h y d r o l y z a t ew a su s e dt oc u l t i v a t er h i z o p u so r y z a el y 0 0 7f o rl a c t i ca c i d f e r m e n t a t i o n t h em o r p h o l o g yo f r h z o p u so r y z a el y - 0 7c u l t i v a t e di nt h eh y d r o l y z a t ea n dt h e c o n d i t i o ni nw h i c ht h ep e l l e tc o u l df o r mw e r es t u d i e d b ye x p e r i m e n t so fs i n g l e - f a c t o ra n d o r t h o g o n a ld e s i g n , b o t ht h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o nw e r eo p t i m i z e di no r d e rt og e t ! i i 山东建筑大学硕士学位论文 h i g h e rl a c t i ca c i dy i e l d b i o m a s sf r o mf e r m e n t a t i o nw a sg a t h e r e d , a n dt h e nc h i t o s a nw a s e x t r a c t e db yc h e m i c a lm e t h o df r o mi t t h ep r o c e s s e so f r e m o v i n gp r o t e i nb yd i l u t e da l k a l ia n d d e a c e t y l a t i o nb yc o n c e n t r a t e da l k a l i w e r oo p t i m i z e d a t l a s t , t h eh i g he f f i c i e n t a n d b i o d e g r a d a b l em i c r o b i a lf l o c c u l a n tw a so b t a i n e d t h er e s u l t sa r o 嬲f o l l o w s ： ( 1 ) t h es u i t a b l er a n g eo f p hf o rt h ec e l l u l a s cu s e di nt h es t u d yw a s5 - 5 4 ，f o ri ti sak i n d o fa c i dc e l l u l a s e t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rc e l l u l a s eh y d r o l y z i n gp r e t r e a t e dc o r nc o bw e 心 a sf o l l o w s ：p h 5 2 ；t e m p e r a t u r e0 f 5 5 ；e n z y m a t i cc o n c e n t r a t i o no f 4 0 u ( gp r e t r e a t e dc o r n c o b ) ：s u b s t r a t ec o n c e n t a t i o no f10 0g l u n d e rt h i so p t i m i z e dc o n d i t i o n , 2 4 hw e 他n e e d e dt o h y d r o l y z ep r c t r e a t e dc o n lc o bc o m p l e t e l y , a n da tt h a tt i m et h ec o n c e n t r a t i o no fr e d u c i n gs u g e r i nt h eh y d r o l y z a t er e a c h e d2 7 5 2 9 l a n dt h er a t i oo ft h ec o n v e r s i o nw a s2 7 5 2 ( 2 ) t h es p o r e sg e r m i n a t i o na n dt h eh y p h ag r o w t ho fr h i z o p u so r y z a el y - 0 7a 托s l o w , s o y e a s te x t r a c tw a su s e d 舔n i t r o g e ns o u i c a ：t oa c c e l e r a t et h ec t d t i v a t i o n a tt h es a 姗t i m e , t h e p h o ft h ec u l t i v a t i o nm e d i u mw a sa d j u s t e dt o2 5b ya d d i n gh c it oi n h i b i tt h ee x c e s s i v e l yf a s t g r o w t ho ft h em y c e l i a , a v o i d i n gt h ef o r m a t i o no fl a r g ec l u m p so fr h z o p u so r y z a el y = 0 7 a t l a s t , i d e a lm o r p h o l o g y , p e l l e t so f2 m m i nd i a m e t e r , w a sg a i n e d ( 3 ) c o n c e n t r a t e dh y d r o l y z a t ew a su s e dt oc u l t u r er h i z o p u so r y z a el y - 0 7f o rl a c t i ca c i d f e r m e n t a t i o n b ye x p e r i m e n t so fo r t h o g o n a ld e s i g n , t h eo p t i m i z a t i o no ft h ec u l t u r em e d i u m w a sd e t e r m i n e d ：t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ec o m p o n e n t sa r c5 r e 蛐gs u g e ro ft h e h y d r o l y z a t e ，0 3 5 y e a s te x t r a c t , 0 0 4 m g s 0 4 - 7 h 2 0 ，0 0 0 7 5 z n s 0 4 7 h 2 0 ，0 0 2 k h 2 p 0 4 t h eo p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ：t e m p e r a t u r eo f3 3 ，r o t a t i o ns p e e do f 1 4 0 r p m ，l i q u i dv o l u m eo f5 0 m l ，l0p i e c e so ft h ep l e d g e lu n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o no fl a c t i ca c i dr e a c h e d2 9 3 9 la f t e r7 2 hf e r m e n t a t i o n , a n dt h er a t i oo ft h e c o n v e r s i o nw a s5 8 6 。 ( 4 ) c h i t o s a nw a se x t r a c t e df r o mt h em y c e l i ab yc h e m i c a lm e t h o d s t h eo p f i m i z i e d c o n d i t i o nf o rr e m o v i n gp r o t e i nw a s ：5 n a o h ，b o i l i n gw a t e rb a t hf o r2 h t h eo p t i m i z e d d c a c e t y l a t i o nc o n d i t i o nw a sa l s oo b t a i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：4 0 n a o h ，1 1o f o r 2 h t h ec o n c e n t r a t i o no fn a o hi n f l u e n c e dt h ed e a c e t y l a t i o nt h em o s t ：t h eh i g h e r c o n c e n t r a t i o n , t h eb e t t e rd e a c e t y l a t i o n 。o f f w h i t es h e e tc h i t o s a nw a so b t a i n e da tl a s t t h e d e a c e t y l a t i o nr a t i or e a c h e d8 6 3 ，a n de x t r a c t i o ny i e l do fc h i t o s a nw a s5 4 f t o mt h ed r y i v 山东建筑大学硕士学位论文 m y c c l i a h o w e v e r , b e c a u s co ft h ep l 髑谳o fc a c 0 3i nt h ed r ym y c e l i a , t h ea c t u a ly i e l dw a q c o m p a r a t i v e l yl o w e rt h a nt h et h e o r e t i co n e , t h i ss t u d yu s e dp r e t r e a t e do o mc o ba sr a wm a t e r i a lt oc o - p r o d u c tl a c t i ca c i da n d m i c r o b i a lf l o c c u l a n to fc h i t o s a nb yc h a r a c t e r i s t i c m i c r o o r g a n i s m , r h z o p u so r y z a el y - 0 7 t h i s s t u d yc a nh e l pt ol a yaf o u n d a t i o no fd a t af o rf o r m i n gn e wt e c h n i q u e so fe n v i r o n m e n t a l b i o l o g i c a lt e c h n o l o g y t h u s ，i tc a ns u p p l yan e wt e c h n i c a la p p r o a c hf o rt h eu t i l i z a t i o no f h e r b a c e o u sc e l l u l o s e sa sr e s o u l c e 8a n dn e wp r o d u c td e v e l o p m e n t t h ea p p l i c a t i o no f a c h i e v e m e n t sf r o mt h i sb a s i cr e s e a r c hn o to n l yb r i n g sn e we c o n o m i cg r o w t hp o i n tf o rt h e b i o m a s su t i l i z a t i o ni nt h ef u t u r e , b u ta l s od r i v e st h i sf i e l dg ot of u r t h e rs t u d y a f t e ra l l ，t h i s w o r kh a dg r e a ts i g n i f i c a n c ei ns c i e n c ea n de n v i r o n m e n t a lt e c h n o l o g y k e yw o r d s ：p r e t r e a t e dc o lc o b ，r h z o p u so r y z a el y - 0 7f e r m e n t a t i o n , l a c t i ca c i d , c h i t o s a n , v 原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是拳人在导师的指导下，独立进行研究取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，论文中不舍其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得山东建筑大学或其他教育机构的学位证书而使用过 的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明 本人承担本声明的法律责任。 学位论文作者签名： 担盘暨 日期 丝ki 学位论文使用授权声明 本学位论文作者完全了解山东建筑大学有关保留使用学位论文的规定，即： 山东建筑大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权山东建筑大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它手段保存、汇编学位论 文。 保密论文在解密后遵守此声明。 学位论文作者签名： ! 苤圭龌 日期 望f ! ：6 导师签 名： 齄望牝日期毒山丘一 山东建筑大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 乳酸的性质及其在环保中的应用前景 1 1 1 乳酸的结构和性质 乳酸a p 2 羟基丙酸，分子式为c h 3 c h o h c o o h ，分子量为9 0 0 8 ，是一种天然存在的 有机酸。由于分子内含有一个不对称的碳原子，所以具有光学异构现象，从而具有型 和【广型两种构型。由于乳酸分子中含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应， 如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等。其中构型不同的乳酸可以通过发生酯 化反应形成化学及物理性质很不相同的聚合物及其他衍生物。 1 1 2 乳酸在环保中的应用前景 乳酸在食品、医药、皮革、化工、印染、卷烟等行业均有广泛应用【l 】，但最具潜力 的是它在环境保护中的应用。s l - 乳酸聚合形成的聚【广乳酸( p l a ) 可用于制造生物降解塑 料、绿色包装材料及农用薄膜等1 2 1 聚l 乳酸因具有高强度热塑性、可纺织性、生物可 降性以及可从再生资源发酵，被认为是最具发展前途的日用和工业用生物降解高分子材 料之一【l 】，可望在将来代替p v c ( 聚氯乙烯) 、p p ( 聚丙烯) 等各种不可生物降解的塑 料，以消除“白色污染一所造成的环境危机1 3 1 。一旦以b 乳酸为基础的聚乳酸的生产开 发和应用有所突破，l 乳酸的需求量势必增长很快。鉴于l 乳酸在环境和医疗等方面的 巨大用途，专家们预测其市场需求将会从目前的2 0 万吨增加到1 0 0 0 万吨，市场前景十分 广阔【4 】。 1 2 米根霉乳酸发酵的研究进展 自然界中可产生乳酸的微生物很多，但产酸能力强，工业生产上用得最多的是根霉 菌属和乳酸菌属。乳酸细菌可以在5 5 发酵生产乳酸，产酸率可以达至1 j 1 8 ，但乳酸细 菌发酵常因消旋作用得到的是d l 乳酸，光学纯度偏低，不利于产品的后加工而且乳 酸菌的营养要求较为复杂；根霉与乳酸菌相比，发酵过程很少发现消旋作用，营养要求 远比细菌简单，菌体大，易于分离，有利于制得纯净的【广乳酸，因此利用根霉发酵生产 l 乳酸是目前国内外大力发展的研究课题p j 。 山东建筑大学硕士学位论文 米根霉是根霉属中生产l 乳酸的理想菌种，具有营养要求简单，发酵周期短，色素 生成少，杂质含量低，易于分离提取和产品光学纯度高等优点，此外，与乳酸杆菌等细 菌相比较，米根霉普遍具有培养条件粗犷，不易染菌的特点，是根霉属中l 乳酸发酵的 代表性菌种。由于米根霉乳酸发酵的转化率普遍都比细菌低，所以，对高产酸米根霉菌 种的选育，廉价发酵原料的选择，发酵条件的优化，以及对米根霉菌体形态的研究一直 是国内外的研究重点。 1 2 1 对高产酸米根霉菌种的选育 菌种的优良直接关系到发酵过程的控制及其产量等，是发酵过程中的一个至关重要 的影响因素。国内外科学工作者一直致力于对菌种进行改良，如筛选、定向诱变耐酸性 菌株、耐氨性菌株等，以及从分子生物学水平进行代谢控制，利用基因工程技术改良或 构建乳酸生产菌等来提高l 乳酸的产量和纯度。 国外对米根霉乳酸发酵的研究和菌种的选育工作起步较早。1 9 8 9 年h a n g 等人1 6 】对米 根霉n r r l 3 9 5 直接利用农产品发酵生产。乳酸进行研究，以碳酸钙为中和剂，每千克粗 淀粉原料( 玉米) 可生成3 5 4 克以上的。乳酸。1 9 9 4 年s u n t o m s u k 等 7 1 对米根霉通过紫外 诱变和n t g 诱变处理，得到了三株高产b 乳酸的米根霉i n l ，3 n 4 和4 n 6 ，产酸分别为1 7 6 、 1 7 6 和1 9 8 9 l ，至少比原始菌株提高了5 7 。2 0 0 3 年s k o r 3 明首次将米根霉的乳酸脱氢酶 基因在酵母菌中表达。其后又通过提高乳酸脱氢酶的活性来提高米根霉的产酸能力，其 中带有较长基因片断的质粒明显比带较短基因片断质粒的产酸量高【9 】。 我国天津、江苏、浙江、山西等地的许多科技工作者也对米根霉的乳酸发酵进行了 研究。1 9 9 1 年，蒋明珠【1 0 1 、曹本昌【l l 】等人采用米根霉发酵生产l 乳酸小试。1 9 9 4 年杨虹 等人【1 2 】利用淀粉酸性培养基富集培养，并结合高锰酸钾溴化钾平板检出的方法从土壤 中筛选出产乳酸8 1 9 l 的根霉r - 2 菌株，以其为出发菌株经紫外线诱变，从琥珀酸平板上 获得了变异株r - 2 9 1 ，以葡萄糖为碳源，其乳酸产率为1 0 3 9 l ，对糖转化率为6 8 9 。2 0 0 0 年虞东胜等【1 3 】从7 8 株米根霉中筛选出1 3 株产i 广乳酸较高的菌株，其中米根霉r s 9 2 8 产 l 乳酸最高，产酸最稳定，在1 6 的玉米淀粉水解糖为碳源的情况下，发酵6 1 h ，产l 乳酸1 4 0 9 l ，对糖转化率8 0 4 ，纯度9 7 9 。2 0 0 4 年白冬梅等【1 4 】对米根霉突变株r 1 2 0 1 进行诱变后的发酵乳酸进行研究，菌株的产酸量提高了5 2 ，同时对米根霉发酵过程中 的代谢通量进行分析，这对菌株的发酵研究有较好的帮助。古绍彬等人【挎1 7 】采用低能离 山东建筑大学硕士学位论文 子诱变方法，对出发菌米根霉p w 3 5 2 进行改良，获得高产l 乳酸菌株r e 3 3 0 3 ，其产酸比 亲株提高7 5 在最优条件下，其产酸量可达1 3 1 1 3 6g t , ，最高可达1 4 0g t , ，糖转化率 为8 6 - 9 0 。此外，在以氨水为中和剂的研究中，2 0 0 5 年匡群等人【】筛选得到一株耐氨 米根霉r h z o p u so r y z a ej s - n 0 2 - 0 2 ，从而可以适应高氮的环境、以氨水为中和剂进行l 广乳 酸发酵，平均产酸1 0 0 6 9 l 。 上述研究主要围绕米根霉高产菌种的诱变筛选，虽然在一定程度上提高了米根霉对 。乳酸的转化率，但诱变选育存在工作量大、盲目性与随机性大、突变菌株易退化、发 酵参数不稳定等缺点，效果并不理想，因此急需建立一种快速高效的筛选方法并且在 这些诱变方法中较少涉及代谢控制育种，没有将微生物遗传学的理论与育种实践密切结 合起来，对突变株的变异机理不能深入了解，有待进一步通过研究目的产物的生物合成 途径、遗传控制及代谢调节机制来进行定向选瞥1 9 1 1 2 2 利用天然或废弃的纤维素原料进行米根霉发酵生产乳酸的研究 由于葡萄糖、淀粉等原料来源丰富，使发酵法生产乳酸得到广泛的推广。但是利用 这些原料的成本依然较高，在一定程度上限制了乳酸生产聚乳酸，及其在环境保护方面 的应用【捌此外，乳酸相对来说是一种廉价产物，因此寻求廉价的原料来生产乳酸已 成为当前国际上乳酸研究课题方面的热点问题。 纤维素原料是地球上最丰富的可再生资源，全世界通过光合作用产生的植物物质每 年高达1 0 0 0 0 0 0 0 亿千克，其中8 9 目前未被人类利用，只有1 1 用作农作物产品、饲草、 造纸和建筑原料，绝大部分的纤维素原料被用作燃料或者在田间被直接烧掉，不但破坏 了生态平衡，使土壤肥力衰竭，造成农业上的恶性循环，而且污染环境，还存在火灾隐 患。中国的纤维素原料非常丰富，每年产量是1 1 4 5 0 亿千克，仅农作物秸秆、皮壳一项， 每年就可达7 0 0 0 多亿千克【2 l 】。利用天然或废弃的纤维素原料来生产乳酸，既降低了乳酸 ： 一 的生产成本，同时又解决了废弃物的处理及污染问题，一举数得，目前国内外很多学者 和研究机构都在对此进行了大量研究。 p a r k 等人瞄l 研究了利用办公废纸的酶解产物来作为米根霉发酵生产l 乳酸的原料， 在含有8 2 8 9 l 葡萄糖、7 9 l 木糖、3 4 9 l 纤维二糖的废纸水解物中培养4d 后，获得了4 9 1 g t , 的乳酸。经过进一步的研究，他们提出可能水解物中的木糖或者一些未知化合物对于 乳酸的得率有一定的抑制作用。s h i g e n o b um i u r a 等人【2 3 】研究表明，用水解纤维素和 山东建筑大学硕士学位论文 r h i z o p u ss p m k - 9 6 1 1 9 6 ，在3 l 的生物反应器中，温度为3 5 下，同时糖化发酵玉米穗 轴，每1 0 0g 未处理的玉米穗轴可生产2 4g m 的l 广乳酸。 鲁杰等人幽】采用纤维素酶对纸质餐具类纤维废弃物进行酶解，并用米根霉发酵生产 l 乳酸，研究表明，利用0 3m o l i 稀磷酸预处理纤维废弃物后，用纤维素酶酶解6 0h 后 所得的糖化液用来进行l 乳酸发酵，8 0h 后l 乳酸产量为1 5 l 。乔长晟等人瞄】以纤维素 类物质玉米芯为底物，利用纤维素酶和米根霉对l 乳酸的同时糖化发酵工艺进行了系统 的研究，在玉米芯为1 5 0 9 l 的情况下，最终产酸量达到t 2 4 8 9 l 。 1 2 3 米根霉发酵菌体形态的研究 米根霉和其它丝状真菌属微生物一样，表现出复杂的生长形态，主要有分散菌丝体、 菌球、絮状体和较大块的聚结物等嗍。其生长形态主要受以下因素的影响：菌种本身的 特性、营养供应情况、培养基的p h 值、搅拌、通气、接种量和基质浓度等【2 7 1 。菌体的形 态影响着发酵液的流变学特性和反应器的质量传递效能，对乳酸的生成和糖的消耗速率 以及糖的转化率有重要的影响作用，如当发酵罐培养中菌体以分散菌丝存在时容易造成 粘度增大，堵塞供气孔、缠绕搅拌浆，形成较大的菌团【捌。因此，研究并控制发酵过程 中菌体的形态在实际生产应用中有至关重要的作用。 y a n g 等人】发现米根霉n r r l 3 9 5 以木糖为唯一碳源生长时，会生长成直径为l m m 左 右的小球体，反复利用菌球发酵2 2 天，根据培养基的不同共生成1 7 4 2 9 l 或2 0 0 1 9 l 的乳 酸。d u 等人【2 6 1 通过控* c a c 0 3 的添加时间使米根霉呈直径为1 2m m 的小球体形态。b a i 等人【捌研究米根霉菌株r 1 0 2 1 ，结果发现菌丝呈菌球状比块状产酸率高；发酵8h 后添加 c a c 0 3 可以得到均匀的菌球( 直径1 0 - 2 0m m ) ；当孢子密度在3 1 0 6 个m l 时，菌球较均 匀。 张昆等【3 l 】对米根霉在5l 发酵罐上种子培养过程进行了研究，确定了最适宜形成菌球 的培养条件分别为：控制发酵罐内的孢子浓度在5 x 1 0 4 8 3 x 1 0 4 m l 的范围内，搅拌转速 3 5 0r m i n ，种子液p h 值稳定在2 8 0 ，以2 0 9 l 的葡萄糖浓度作为最佳种龄的经验值确定 种子培养时间为5 2h 。最后获得表面光滑的直径约为l 衄的结实菌体。 目前，在米根霉发酵生产l - 乳酸的研究中，通过控制菌体形态使之自聚成为一定大 小的球体进行乳酸发酵，因其操作简单、费用低而成为研究热点。但影响菌体形态的因 素较多，各研究者只是研究了单一因素对菌体生长形态和产酸的影响，关键是各种因素 山东建筑大学硕士学位论文 对菌体形态的协同影响还未进行过研究如想进一步应用于工业大生产，这方面还可继 续深入研究f 3 1 。 1 3 聚氨基葡萄糖的性质及其在环保中的应用 1 3 1 聚氨基葡萄糖的结构和性质 聚氨基葡萄糖即脱乙酰甲壳质，系统名称为( 1 ，4 ) - 2 氨基2 脱氧1 3d 葡聚糖，分 子量为1 2 5 9 万，是天然存在的唯一碱性氨基多糖，为一种线性聚胺，分子中含有大量 氨基( - n h 2 ) 和羟基( - o h ) 基团。聚氨基葡萄糖不能溶于水中及普通有机溶剂中，但 可溶于稀酸中，在p n 值小于6 5 时能形成粘性溶液，故平时常将聚氨基葡萄糖溶于稀 酸中使用。在酸性介质中氨基质子化，它则表现出阳离子聚合物电解质的性质，具备突 出的絮凝和螯合性能。此外，聚氨基葡萄糖还具有无毒、可被生物降解、良好的生物相 容性和成膜性等优良特性。 1 3 2 聚氨基葡萄糖在环保中的应用 目前，聚氨基葡萄糖在环境保护中主要是作为一种微生物絮凝剂应用于水处理方 面。常规使用的无机或有机絮凝剂尽管有效，但由于常规用量大、处理成本高或者 是残留物毒性大易造成二次污染，因而开发无毒、安全、价廉、无二次污染的微生物絮 凝剂就成了世界性大课题。聚氨基葡萄糖作为生物有机高分子絮凝剂，具有无毒、无害， 使用安全，易于生物降解，无二次污染等特点，在当前水资源短缺和水价提高的情况下， 为水质提升处理及回用技术提供了可靠的技术保证，具有广泛的开发与应用前景。 ( 1 ) 纯化饮用水 聚氨基葡萄糖的无毒性使其在饮用水的纯化处理方面有着得天独厚的优势，美国和 日本等发达国家的环保部门已批准用聚氨基葡萄糖净化饮用水，推荐的最高浓度为 1 0 m g l ，美国市售商品有“s e a - k l e a r 等3 2 1 。 ( 2 ) 对重金属离子的螯合和吸附作用 聚氨基葡萄糖能通过分子中的胺基、羟基与重金属离子形成稳定鏊合物【3 3 1 。因此， 可以利用聚氨基葡萄糖的这种螯合性能除去污水中的h 矿、c u 2 + 、c d 2 + 、p b 2 + 、c d + 等离 子。 ( 3 ) 处理食品工业中的废水 山东建筑大学硕士学位论文 在食品工业的废水中，絮凝剂一般有两个作用：一是提高产品质量，二是处理废水， 回收物料，提高得率且减少水污染。通常食品工业废水经聚氨基葡萄糖处理后，悬浮固 体可减少9 0 以上，c o d 可减少5 5 9 0 。此外，聚氨基葡萄糖还可用于回收废水中的蛋 白质等等【蚓。 ( 4 ) 处理印染废水 聚氨基葡萄糖分子结构中含有大量的游离氨基，在酸性条件下，其游离氨基被质子 化，使聚氨基葡萄糖分子带上了正电荷，而染液中大多数染料的的色素离子均为阴离子， 所以聚氨基葡萄糖可作为染色废水的吸附剂达到脱色目的【瑚。 1 4 用霉菌生物量生产聚氨基葡萄糖的研究进展 目前工业化生产的聚氨基葡萄糖主要是采用虾、蟹的外壳作为原材料，但原料来源 受季节和产地的影响，且易造成环境的污染。近年来国内外从真菌中提取甲壳素、聚氨 基葡萄糖的研究已悄然兴起。2 0 世纪8 0 年代，日本、美国先后开始对微生物发酵生产壳 聚糖进行研究，9 0 年代初我国也开始涉足这方面的研究【3 6 l 。霉菌细胞壁具有特殊的大分 子构成，富含几丁质，有的还直接含聚氨基葡萄糖；用生物发酵法生产聚氨基葡萄糖， 原料易得，培养方便，不受季节、地域限制，而且生产成本低，具有巨大的发展优势【3 7 捌 用生物法制备聚氨基葡萄糖包括优良菌株的选择，适当的培养基质，良好的培养条件及 有效的制取方法等过程。 1 4 1 对产聚氨基葡萄糖的霉菌的研究 2 0 世纪8 0 年代以来，许多科学家致力于能生产聚氨基葡萄糖的霉菌的研究。开始 人们认为聚氨基葡萄糖只存在于毛霉目( m u c o r a l e s ) 中，但随着研究不断深入，已经 发现聚氨基葡萄糖也可存在于另外的许多菌体中。聚氨基葡萄糖存在于细胞壁和隔膜 ! 上，主要用来组成细胞骨架，维持细胞形态【3 9 】。 一 贺淹才等培养黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 4 2 h 的菌体生物量达到9 4 2 9 l ，聚氨基 葡萄糖得率为1 2 1 1 。陈忻等【4 1 】采用经筛选的毛霉( m u c o r ) 进行培养，聚氨基葡萄糖 产率占菌体生物量的1 5 6 8 ，脱乙酰度达8 5 * 0 - 9 0 。t a n 等【4 2 】利用青霉素发酵的产黄 青霉( p e n i c i l l i nc h r y s o g e n u m ) 废菌丝体通过碱处理和乙酸提取进行聚氨基葡萄糖的生 产，获得的聚氨基葡萄糖的分子量为3 6 x 1 0 4 ，脱乙酰度为8 4 。l ( 1 l a l a p 3 】选用米根霉 山东建筑大学硕士学位论文 ( r h i z o p a so r y z a e ) 作菌种，在稻草桔杆上采用固态发酵方式( s s f ) 培养1 2 天，每公 斤发酵培养基( 干重) 生成聚氨基葡萄糖的最大得率为5 6 3 9 ，脱乙酰度为7 3 - 9 0 ， 粘度为2 7 6 8 e p 。c h a t t e r j e e 等【删用鲁氏毛霉( m u c o rr o u x i i ) 在实验室的糖蜜盐中培养 3 2 h 后，l l 培养基中聚氨基葡萄糖的最大产量达到0 6 1 9 l ，分子量为2 4 8 x i 0 4 ，1 3 乙酰化。m a g h s o o d i 等【4 5 】用黑曲霉采用固态发酵方式对获得聚氨基葡萄糖进行了研究 另有学者进行了不同菌种聚氨基葡萄糖产量的对比试验。p o e h a n a v a n i e h 等【拍l 研究 了四种有代表性的真菌，黑曲霉，米根霉，香菇( l e n t i n u se d o a e s ) ，侧耳( p l e u r o t u ss a j o ) 以及两种酵母菌，鲁氏接合酵母( z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u