（食品科学专业论文）几种香型白酒指纹图谱的研究.pdf

中文摘要 白酒的指纹图谱基本反映了该白酒的化学成分及其含量分布情况，其作用是反映复杂 成分的白酒内在质量的均一性和稳定性。具有特征明显、专属性强、重现性好的特点，且 操作方便、快速，是一种实现对白酒多组分多指标分析的理想方法。 本文首先以贵州茅台酒为研究对象，确定了白酒的气相色谱分离方法与条件，并对所 确定的方法进行了方法学考察，实验结果证明仪器精密度良好、实验方法可靠、样品2 4 h 内稳定，符合指纹图谱的技术要求。 本文建立了低度浓香青酒、五星习酒、高度浓香青酒、泸州老窖特曲酒、贵州茅台酒、 金沙回沙酒、酱香青酒、董基酒、成品董酒、桂林三花酒的对照指纹图谱，并通过考察指 纹图谱的技术参数及相似性分析，得出结论：泸州老窖和五星习酒的勾兑质量最为稳定， 贵州茅台酒次之；不同年份酿造的董基酒组分差异很大。 本文通过对白酒指纹图谱技术参数的比较研究及相似性分析。得出以下结论： 1 低度浓香白酒的组成成分最简单，中度浓香白酒之间的品质差异最小，不同度数 香白酒之间的相似度差异很大。 2 酱香型白酒组成成分复杂，所含组分7 5 以上相似，各色谱峰相对面积分布分散显 著，不同品牌的酱香白酒各具特色。 3 董滔的组成成分复杂，各色谱峰相对面积分布较为分散。 4 米香型白酒组成成分简单，所含组分9 1 以上相似，各色谱峰相对面积分布比较集 中，且陈酿年数越少，相对峰面积分布越集中。 5 清香型白酒组成成分简单，所含组分仅6 0 以上相似，不同地域的清香型酒各具特 色。 6 - 不同香型的白酒各具特征组分，萱酒与其它香型白酒的相似度均较大，浓香型白酒 与酱香型白酒之间相似度差异最大。 关键词。白酒；指纹图谱；气相色谱 a b s t r a c t t h ef i n g e r p r i n to fd i s t i l l e d s p i r i t sr e f l e c t si t sc h e m i c a lc o m p o s i t i o na n dc o n t e n td i s p o s i t i o n i tu t i l i z e dh o m o g e n i c i t ya n ds t a b i l i t yt or e f l e c tt h ei n t e r n a lq u a l i t yo ft h ed i s t i l l e ds p i r i t sw i t h c o m p l i c a t e dc o m p o s i t i o n i th a sl o t so fg o o dc h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha so b v i o u sc h a r a c t e r , s t r o n g s p e c i f i c i t y , g o o dr e p r o d u c i b i l i t y , a l o n gw i t ht h ec o n v e n i e n ta n d f a s tm a n i p u l a t i o n s ot h e f i n g e r p r i n ti sa ni d e a lm e t h o d ef o ra n a l y z i n gm u l t i c r i t e r i ai nd i s t i l l e ds p i r i t s i nt h i sp a p e r , b ys t u d i n gk w e i c h o wm o u t a i ，t h es e p a r a t i o nm e t h o da n dc o n d i t i o no fg a s c h r o m a t o g r a ma n di t sf e a s i b i l i t yw e r ed e t e r m i n e d g o o de q u i p m e n t sp r e c i s i o n ，r e l i a b l ee m p i r i c a l m e t h o d , s t a b l es a m p l ei n n e r2 4 hw e r ep r o v e d a l lo ft h e s em e e tt h et e c h n i c a ls t a n d a r do ft h e f i n g e r p r i n t w ee s t a b l i s h e dm a n yc o n t r a s tf i n g e r p r i n t s , s u c ha sl o wd e g r e ea r o m aq i n g j i u ，w u x i n x i j i u ， h i g hd e g r e ea r o m aq i n g ，i na n ds oo n i t st e c h n i c a lp a r a m e t e ra n ds i m i l a r i t yw e r es t u d i e d t h e c o n c l u s i o nw a st h a tt h eq u a j i t ) ro fl u z h o u l a o j i a oa n dw u x i n x i j i uw a st h em o s ts t a b l e ； k w e i c h o wm o u t a iw a sl e s st h a nt h a to ft h e m ；d o n g j i j i uo fd i f f e r e n ty e a r sh a daf a rd i f f e r e n t c o m p o s i t i o n w i t ht h ef i n g e r p r i n to fd i s t i l l e ds p i r i t s , t h et e c h n i q u ep a r a m e t e ra n ds i m i l a r i t yw e r es t u d i e d t h ec o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h em o i t yo fl o wa r o m aw i n ew a st h es i m p l e s t t h eq u a l i 哆d i f f e r e n c eo fm i d d l ea r o m a w i n ew a st h es m a l l e s t t h es i m i l a r i t ) ，o fa r o m aw i n ew i t hd i f f e r e n ts e m b l a n c ew a st r e m e n d o u s 2 t h em o i t yo fj i a n g x i a n gd i s t i l l e ds p i r i t sw a sc o m p l i c a t e d i t ss i m i l a r i t yo fc o m p o s i t i o n w a sm o r et h a n7 5 t h ed i s t r i b u t i o no fe a c hc h r o m a t o g r a p h i cp e a l 【r e l a t i v ea r e ad i s p e r s e s s i 驴i 矗c 跹y d i f f e r e n tj i a n g x i a n gd i s t i l l e ds p i r i t sh a di t so w nc h a r a c t e r i s t i c 3 t h em o i t yo fd o n g j i uw a sc o m p l i c a t e d t h ed i s t r i b u t i o no fe a c hc h r o m a t o g r a p h i cp e a k r e l a t i v ea r e ad i s p e r s e sm o d e r a t e l l y 4 t h em o i t yo fm i x i a n gd i s t i l l e ds p i r i t sw a ss i m p l e i t ss i m i l a r i 够o fc o m p o s i t i o nw a sm o r e t h a n9 0 t h ed i s t r i b u t i o no fe a c hc h r o m a t o g r a p h i cp e a kr e l a t i v ea r e aw a sc o n c e n t r a t e t h el e s s a g e i n gy e a r s , t h em o r ec o n c e n t r a t et h ep e a l 【o fr e l a t i v ea r e aw a s 5 t h em o i t yo fq i n g x i a n gd i s t i l l e ds p i r i t sw a ss i m p l e 。i t ss i m i l a r i t yo fc o m p o s i t i o nw a s m o r et h a n6 0 d i s t i l l e ds p i r i t sw i t h i nd i f f e r e n tr e g i o n sh a di t so w nc h a r a c t e r i s t i c 6 t h ed i s t i l l e ds p i r i t sw i t hd i f f e r e n tf l a v o rh a si t sc h r a t e r i s t i cm o i t y t h es i m i l a r i t yb e t w e e n d 0 n g j i ua n dd i s t i l l e ds p i r i t sw i t ha l lt h eo t h e rf l a v o ri sh i g h t h es i m i l a r i t yd i f f e r e n c eb e t w e e n a r o m aa n dj i a n g x i a n gi st h em o s t k e yw o r d s ：d i s t i l l e ds p i r i t s ；f i n g e r p r i n t ；g a sc h r o m a t o g r a p h y 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 学位论文原创性说明和关于论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盘鉴 日 期：2 鲤笈垒旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：差墨蛊导师签名： 1 0 1 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 第一童 1 1 白酒概述 第一章绪论 白酒( d i s t i l l e ds p i r i t s ) 又名烧酒或火酒，是我国传统的蒸馏酒，也是世界七大蒸馏酒之 一，在漫长的发展过程中，其独特的工艺、风格和优异的色、香、味深受广大饮用者的喜欢【l 】， 在国内外有着广阔的市场【2 】，在食品工业和整个国民经济中占有重要的地位。 1 1 1 1 白酒的主要香味成分与风格 据文献报导 2 - 4 1 ，白酒的风格，就是指由白酒的色、香、味共同组成的具有独特的典型 性，也是香气和e 1 味协调平衡的综合感觉，与其所含主要香味成分有直接关系【5 1 。白酒中主 要成分是乙醇和水，约占总重量的9 8 ，雨香味成分( 酸、醅、醇、醛及芳香族化合物等) 仅占2 。却决定着酒的香气、香型与风格 6 1 ( 见表1 ) ，构成了白酒的不同流派【7 ，8 l 。 表1各香型白酒不同的风格特征 高温大曲高温 酱茅酱香细腻，酒体丰 高粱高温石窖堆积两次投料 香台未定满，醇厚柔和，回味 小麦大曲泥封八次发酵长期 型酒长，空杯留香持久 陈酿 桂 米林p 苯乙醇蜜香清雅，入口绵大米为原料，小 香 三 乳酸乙酯甜，落口爽净，回味 大米d , 1 1 t l 陶坛曲固态糖化，液 型 花乙酸乙酯怡畅态发酵液态蒸馏 酒 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 第一章 山 麸曲酱香中高 馅香 芝 东己酸乙醑酒香幽雅，入口丰满高粱温麸曲高粱主料 为主 席景p 一苯乙醇醇厚，纯净回甜，余 小麦大曲砖窖加麦魏高温堆 浓清 香芝丙酸乙醑香悠长( 焦香)麸皮缪e 入窖，砖窖发 兼备 酒 酵 2 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 第一章 ( 1 ) 酸是形成白酒香味的主要物质，也是形成酯的必要条件，一般意义上认为有酸才 有酯，酸多酯才多。 白酒中的有机酸绝大部分都是挥发性酸，各类酸因其刺激阈和离解度的差异，在香气和 口味上也有不同。优质白酒总酸含量不低于l o o m g l o o m l ，因有机酸的组成与量比不同， 所形成的风味也有区别，一般以有机酸种类多、含量高者，其风味较优。 白酒中有机酸主要有乙酸、己酸、乳酸和丁酸等，其和为总酸的9 0 。9 8 。同时不同香 型酒中所占比例也不一样，如清香型白酒中，乙酸含量最高；浓香型白酒中己酸含量最高， 其次为乳酸；酱香型白酒中有机酸种类多，含量特别高。 ( 2 ) 酯类化合物是指有机酸与有机醇在分子间脱水而生成的一类化合物。白酒中酯类 化合物多数是具有果实气味的挥发性化合物，是构成白酒香味的主要成分，其总含量约 2 0 0 4 0 0 m g ，1 0 0 n l l ，对形成各种酒的典型性起着关键性作用。 白酒中主要酯类成分是乙酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯等，其和为总酯含量的8 0 以 上，称为三大酯。白酒中三大酯含量及量比的变化，决定了酒的香型、风格与流派。己酸乙 酯突出是浓香型白酒的特点，乙酸乙酯为清香型和米香型白酒的主体香。从酯的单体香味来 看，以脂肪族1 也个碳的香气弱，持续时间短；3 5 个碳的具有脂肪臭，含量不宜过多；如1 2 个碳的香气浓，持续性较长；1 2 个碳以上的酯几乎没有香气了。 酯类化合物的呈味作用会因为它的呈香作用非常突出和重要而被忽略。实际上，由于酪 类化合物在酒体中的绝对浓度与其组分相比高出许多，而且它的阈值较低，其呈味作用也是 相当重要的。在白酒中，酯类化合物在其特定浓度下一般表现为微甜、带涩，并带有一定的 刺激感，有些醑类还表现出一定的苦味。 ( 3 ) 高级醇含量在白酒中占有极为重要的地位，凡比乙醇含碳原子多的醇类统称为高 级醇，它是白酒中醇甜和助香剂的主要物质，有的高级醇自身香气强，同时它又是构成酒类 中某些酯的基础物质，形成酯类特有的香气。 在白酒中，高级醇主要有正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、丙三醇和2 丁二醇等，是构成白酒香味成分必不可少的组分，其总含量必须适中，过少则失去白酒的固 有风味，过多则易产生苦涩味。其中异戊醇、异丁醇、正丁醇和正丙醇等成分带苦涩味，而 丙三醇和2 , 3 丁二醇则可改善白酒的甜度和自然感。大多数醇有乙醇或杂醇油的气味，持续 时间长，有后劲，对白酒风味有一定的作用。 ( 4 ) 羰基化合物对形成白酒的主体香较为重要，其中酒香与醛类化合物的含量及种类 有密切关系。 主要醛类有乙醛和乙羧醛，似果香，味甜带涩，具有酒头气味；其余成分含量甚微，以 异戊醛香味较好，似苹果香，味带甜；糠醛呈黄褐色，似杏仁，有焦臭，带苦涩味，气味最 差。总醛含量过高，不仅白酒风味不好，而且影响饮酒者的健康。 3 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 第一章 ( 5 ) 芳香族化合物在白酒中也占有重要地位。芳香族化合物如4 乙基愈疮木酚、苯甲 醛、香草醛和酪醇等是酱香型白酒的重要香味成分。舢乙基愈疮木酚具有酱香感。苯甲醛似 扁桃香，稍有苦杏仁味。酪醇具有幽雅的香气，但味奇苦，它由曲子及微生物分解酪氨酸生 成。在白酒生产中，制酒师傅常说，曲重火大酒苦，就是由于生成较多的酪醇所致。b 苯乙 酵在豉香型白酒中含量最高，米香型白酒次之，它具有蜜香玫瑰味。 ( 6 ) 含氮化合物。白酒中的含氮化物可能是构成酱香型及芝麻香型白酒的又一重要香 味成分。有关研究表明，目前我国大多数白酒的毗嚷类化合物以四甲基吡嗪和三甲基吡嗪含 量最高。有些白酒，如白云边酒中2 , 6 - - - i 甲基吡嗪含量居多。 ( 7 ) 呋哺化合物。呋喃化合物中的呋喃甲醛在极稀薄情况下稍有桂皮香气，浓时冲辣， 味焦苦涩。在酱香型自酒中含量突出，成为该香型酒的特征成分之一。 此外，含硫化合物、醚类以及其它化合物的香味特征，有待于进一步研裂9 j 。 这些成分在酒中的地位和作用为：酯类是白酒香的主体，中国白酒是以乙酯类为主，酸 是味的主体，并起重要的协调作用，醇类是香与后味过渡桥梁，含量恰到好处，甜意绵绵， 在酒中起调和作用，醛类主要是协调白酒香气的释放和香气的质量【l o l 。 1 1 2 香味成分及其量比与白酒质量的关系 决定白酒质量和风格的不是它的主要成分一酒精和水，而是众多微量的呈香呈味成 分，王忠彦等f l l 】根据香味成分含量的高低把白酒中这些呈香呈味成分分为：色谱骨架成分 和微量成分。色谱骨架成分是含量大于l 一2 m g l o o m l 的成分，属于白酒的色谱常规定量分 析指标，在任何一个白酒厂的色谱分析报告单上均可找到，是我国白酒的优势成分，也是白 酒的主干成分，是观察白酒各种成分的不同含量对酒质影响的主要依据之一，其量比关系决 定着我国白酒的香型及质量。微量成分，即非色谱骨架成分，是白酒中含量极低、挥发性极 差的成分。它们的数量之多，来源之复杂，为白酒的研究工作带来和增添了十分庞大的影响 因素。王忠彦指出，深入研究微量成分在白酒中起什么作用，以及它们的含量及量比关系如 何影响白酒的质量，将对白酒品质的发展，尤其对传统固态发酵酒的保护和新型白酒的开发 有着深远的意义。 白酒档次的提高取决于微量成分的提高，在对国家名优酒进行广泛色谱分析的基础上， 提出了许多模仿国家名优酒风格的组成成分设计方案及数学模式，不论配方设计何等优良、 计量如何准确，实践证明，以食用酒精为基础酒，把色谱骨架成分都用上，却不能做出一样 的白酒【。曾发现“五粮液”的样品和某些“全兴大曲”样品有近乎相同的色谱骨架成分。 事实也都说明要使白酒形成风格，质量上档次，仅有那些含量较高的色谱骨架成分是不行的， 还必须有适量微量成分以及相应成分的量比关系。 4 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文第一章 1 1 3 白酒香味成分的分析方法研究进展 在6 0 年代以前，由于受分析手段所限，一般采用常规的化学分析方法测定白酒中的总 酸、总酯、总醛、甲醇和杂醇油等成分。1 9 6 4 年，原中国轻工业部组织的茅台、汾酒试点 研究组采用纸层析色谱法、薄层色谱和柱色谱定性及半定量检出白酒中酸和酯及芳香族类化 合物等成分协1 2 】。首次提出了己酸乙酯是浓香型白酒的主要香味成分，乙酸乙酯是清香型白 酒的主体香味成分。1 9 6 5 年，内蒙古轻工研究所以纸层析定量了几种名白酒的氨基酸，并 采用柱层析定量白酒中的酸、酯成分。1 9 6 6 年，该所用气相色谱定量分析了白酒中较高沸 点的酯类，如辛酸乙酯和乳酸乙酯等f 1 3 ，1 4 1 。 7 0 年代初期，由内蒙古轻工研究所研制成功的d n p 混合柱，直接进样法测定白酒的香 味成分，为白酒行业的色谱分析做出了重大的贡献。1 9 8 0 年原轻工业部食品发酵科学研究 所应用色谱一质谱法分析了茅台酒的挥发性成分，测定了白酒中的挥发性酚元化合物。1 9 8 1 年至1 9 8 3 年，原轻工业部日用化学研究所对汾酒的香味成分进行了剖析研究。采用毛细管 色谱与质谱联用技术共剖析出汾酒的香味成分2 0 4 种，其中酯类8 0 种、有机酸1 8 种、醇类 2 0 种、羰基化合物1 8 种、缩醛类3 7 种、酚类及内酯1 1 种、含氮化合物6 种、醚类1 4 种。 1 9 9 1 年1 0 月，轻工业部食品发酵研究所与湖北省白云边酒厂和山东省景芝酒厂合作，开展 了“其它香型名优白酒特征香味组分的剖析研究”，采用p e g 2 0 m 交联柱直接进样分析白酒 香味成分，一次直接进样可检出6 7 种组分，用动态顶空进样技术。可检出白酒中7 4 种成分。 1 9 9 7 年食品发酵工业科学研究所蔡心尧等【1 5 】选用f f a p 键合毛细管柱直接进样分析白酒香 味成分时，采用三内标物法对贵州茅台酒一次进样，定性、定量测定了醇类1 4 种、酯类2 0 种、羰基化合物7 种、有机酸l o 种、缩醛3 种、吡嗪2 种、呋喃化合物1 种，共5 7 种组分， 结果重现性良好，效果更优于p e g 2 0 m 交联柱，但是f f a p 不能分离乙酸乙酯与乙缩醛。 目前通常采用填充色谱分析( 选用邻苯二甲酸二壬酯( n d p ) 和吐温6 0 ( l x v e e n 6 0 ) 2 0 ：7 的混合柱( 简称n d p 混合柱) 1 1 6 1 或者聚乙二醇( p e g 2 0 m ) 柱【1 5 1 ) 和毛细管色谱( 选 用p e g 2 0 m 柱旧或者f f a p 柱( f f a p 是p e g 2 0 m 与二硝基对苯二酸的反应产物f 1 固) ) 及固 相微萃取衍生化法分析1 1 9 1 。对白酒中那些挥发性极低的物质，需要利用高效液相色谱进 行分离和检测。银燕于1 9 9 4 年用高效液相色谱测定酒中的有机酸【加l 。 白酒检测手段和技术方法的发展，为白酒划分香型提供了科学的依据，更加清楚的认识 到中国传统白酒与世界知名的蒸馏酒在主要的质量中酸、酯、醇方面的差异，为中国白酒与 世界接轨提供了参考。 5 2 0 憾贵州大学硕士研究生论文 第一章 1 2 指纹图谱概述 1 2 1 指纹图谱的含义及特点 指纹图谱鉴定始于1 9 世纪末2 0 世纪初的犯罪学和法医学，由于基因学的发展，近代将 指纹分析的概念结合生物技术延伸到d n a 指纹图谱分析，而且应用范围从犯罪学扩大到医 学和生命科学的领域t 2 1 1 。 指纹图谱是指样品经适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够表示该样品特性的色 谱或光谱的图谱，并使待测物的检出尽可能多地反映其全貌1 2 2 l 。指纹图谱不强调个体的绝 对唯性( 个体特异性) ，而强调同一群体的相似性，即物种群体内的唯一性( 共有特征性) 嘲。 相似性是通过色谱的模糊性和整体性来体现，模糊性强调的是对照样品与待测样品指纹图谱 的相似性，而不是完全相同；整体性强调的是比较色谱特征的“完整面貌，而不是将其“肢 解”，这样才能在不同环境的样品色谱中搜索和提取与该样品指纹图谱整体“面貌”相关的 特征，加以鉴别 2 4 1 。所以说色谱特征的整体性及模糊性是色谱指纹图谱分析的最基本的属 性。指纹图谱分析强调准确的辨认，而不是精密的计算，比较图谱强调的是相似，而不是相 同，这是与传统的分析观点和要求根本不同所在。与传统质量控制模式的区别在于：指纹图 谱是综合地看问题，也就是强调化学谱图的“完整面貌”即整体性，反映的质量信息是综合 的。 1 2 2 指纹图谱的检测方法 目前获得指纹图谱的主要手段是色谱法、光谱法、波谱法、联用技术以及其他方法嘲。 光谱指纹图谱如近红外光谱、高分辨核磁共振谱在特定的条件下可以发挥它的优势；但总体 讲色谱具有分离、鉴别以及量化三重功能，提供的质量信息一般较光谱要丰富，所以目前多 应用色谱指纹图谱，将色谱中表达出的各个成分的“状态”作为一个整体来辨认，将各成分 色谱峰的顺序、比例和相互的制约关系当作某一品种的特性，如同人的指纹一样加以辨认， 而且加上量化的信息，以判断产品质量是否稳定和一致。这种多成分、多层次的综合整体特 征更接近于真实的质量，并使之可视化成为可能。 1 2 2 1 色谱法 ( 1 ) 薄层( 1 1 c ) 指纹图谱 t l c 在色谱方法中相对是最易开展的方法，具有操作简便、快速、经济等特点，通过 荧光显色或使用显色剂，可以提供直观形象的图案；易于比较。在此基础上又发展了薄层扫 描法，以及其它和计算机相结合的技术，在色谱指纹图谱中有着广泛的应用闻。 ( 2 ) 高效液相色谱( 翔p l c ) 指纹图谱 6 2 0 0 8 贵州大学硕：e 研究生论文第一章 h p l c 在色谱方法中是使用相当广泛的一种方法，具有分离效率高、分离速度快、重现 性好、应用范围广等特点。其分离原理使其非常适合分析混合的复杂体系，并且通过与不同 性能的检测器联用，可以有针对性的检测分析样晶中不同的化学成分。 ( 3 ) 气相色谱( g c ) 指纹图谱 g c 具有分离效能高、分离速度快等优点，所得的色谱轮廓，其重现性好、分辨率高， 由于是封闭系统色谱，外界影响的因素较少，稳定性好，检测设备可选性较大，在具体使用 时，多与质谱检测器( m s ) 联用，特别适用于挥发性样品的指纹图谱的研究与应用。 ( 4 ) 高效毛细管电泳( h p c e ) 指纹图谱 h p c e 是一类比较新的液相分离分析技术，综合了电泳和色谱的一些特点，因此其分析 对象也十分广泛，包括了从小的无机离子到大的蛋白质和高分子聚合物等。具有分离效能高， 分析速度快，消耗低，环保等特点。 ( 5 ) 高速逆流色谱( h s c c c ) 指纹图谱 h s c c c 是一类新的液液萃取分离技术，它利用相对移动的两种互不相溶的溶剂，在处 于动态平衡的两相中将具有不同分配比的组分分离，分离效能高、低成本、样品的前处理简 单，可适用于任何极性范围样品的分离，因此很适用于指纹图谱分析。 1 2 2 2 光谱法 ( 1 ) 红外光谱法( m ) 瓜是以研究物质对红外辐射的吸收特性而建立起来的一种定性定量分析方法。红外光 谱具有高度的特征性，对单一化合物来说，没有两个化合物的红外光谱是完全一致的，即每 种化合物都有自己特征的红外吸收光谱鲫。 ( 2 ) 紫外光谱法( u v ) u v 是由分子中电子能级的跃迁而产生的，当单色光照射被测物质后，物质对光线产 生吸收，记录仪记录下吸收度波长曲线。由于物质结构不一样，其紫外光谱也不一样。 各种色谱技术均有其自身的优点和不足，相互阅可以取长补短，而选择何种技术，具体 应用时，取决于样品的性质和工作的目的。 1 2 3 指纹图谱评价标准 对得到的指纹图谱信息进行科学准确的分析，最大限度的获取其中的有用信息，这也是 指纹图谱研究工作当中非常重要的一个环节。在指纹图谱研究中i 对指标参数的设置以及评 价标准还很不统一。2 0 0 1 年以前的文献多采用直接比对法，即将待测样品的图谱与标准图 谱进行直接比较，这种方法受人为因素影响较大，缺乏量化的数据和统l 的标准，存在着一 定的局限性，不利于指纹图谱的推广应用及规范化1 2 s 1 因此，有学者在此基础上提出了各 7 2 0 0 8 贵州大学硕：卜研究生论文 第一章 种观点和方法建立指纹图谱的指标参数和评价标准，如相对指数，重叠率，n 强峰等印删， 用量化的数据进行比较。更加合理、客观。 除此之外，对各种计算机图谱解析技术以及化学计量学的研究也成为一个热点。例如采 用模糊信息分析法、人工神经网络法、灰色关联聚类法、化学模式识别法等方法对得到的指 纹图谱进行解析，以及建立相似度计算判别软件进行判别分析。 样品的化学成分通过实验方法可以表征为色谱指纹图谱，图谱的峰可以代表相应的物质 基础，若物质基础成分群相同，所表现的指纹图谱应该完全一致：若基本相同，应该相似； 若差异大，相似度低。因此，相似度作为重要指标被确立。相似度作为指纹图谱评价指标， 使研究针对的目标不再是图谱上的某个峰，而是将图谱所有峰( 或所有信号点) 作为一个向 量来处理，全面反映指纹图谱之间的共性和个性差异，提高了指纹图谱的信息利用率。指纹 图谱相似度计算是将一张指纹图谱作为一个n 维向量x ( x l ，x 2 ，x 3 ，x n ) ，这个向量可 以是指纹图谱的原始数据点，也可以是指纹图谱的色谱判峰结果信息，两张指纹图谱之间的 相似度系对两指纹图谱向量进行一定的运算所得p 1 1 。常用的计算方法有相关系数法和相合 法。对于两个中药色谱指纹图谱矢量，记为) ( i ，x j x i = x i l ，配，x 蛔1 ：x j = x j l ，x j 2 ，x j n 】； 相关系数法( 式1 1 ) 阎 一慨) 鲰一朋j ) j 。1 乎i - 1 产一 式1 1 荟吣啊) 2x 荟o j t - - m i ) 2 式中m i 和皿1 分别表示矢量确和冯的均值，即一( z ) 加，k = l ，2 ，n 相关 系数可在 - 1 ，1 1 的区间内变化，当相关系数为1 时，则表示两个图谱完全一致，当两个图谱 的变化趋势完全相反时，相关系数为 相合系数，( 式1 2 ) 1 3 3 1 既- c o s ( ) t 式1 - 2 式咿a h 表示矢量x i 和玛之间的夹角。对照相关系数的数学定义式，我们可以发现，相 合系数与相关系数的计算十分相近，不同的地方只在于相关系数计算时在分子分母中均减去 了均值，而相合系数没有。当比较指纹图谱时，相合系数在f o ，1 】的区间内变化，当相合系数 为1 时，则表示两个图谱完全一致；当两个图谱矢量正交时，即l 个指纹图谱中出现色谱峰 的位置在另一个图谱中没有出现色谱峰，用化学的语言来说，就是这两个样本没有一个相同 8 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 第一章 的化学组分，此时这两个对应的色谱指纹图谱的相合系数为o 。 在进行指纹图谱相似性计算前，首先要建立能表征样品化学组成特征的标准指纹图谱， 才能通过计算待测样品指纹图谱与标准指纹图谱间的相似度，对产品质量波动情况作出整体 分析和评价。标准指纹图谱有两种模式，一种是从实验样本中选择具有代表性的样品。另一 种是使用实验样本图谱的平均值或中位数建立对照指纹图谱。对于进行实验的n 批次的指纹 图谱向量( x l ，x 2 ，x 3 ，x ) ， 其平均值对照指纹图谱为：x 平均a = m e a n ( x l ，x 2 ，x 3 ，t * , t pk ) 其中位数对照指纹图谱为：x 中位蠡= m e d i a n ( x i ，x 2 ，x 3 ，x ) 从上述两式可知，平均值的计算实际上就是将这一批色谱指纹图谱的每一个元素的均值 求出即得。中位数的计算可以通过找到这一批色谱指纹图谱的每一个元素的中位数得到。如 果在这批样品中不存在离群样本时。一般应推荐使用平均值来建立对照指纹图谱，但如果在 这批样品中存在有离群样本时，则应推荐使用具有稳健性质的中位数来建立对照指纹图谱。 如果不存在离群样本时。两种方法所得结果应该基本一致。 1 2 3 指纹图谱的应用 1 2 3 1 指纹图谱在中草药中的应用 目前指纹图谱多用于中草药的质量控制方面。以指纹图谱作为中成药和中草药提取物质 量控制方法，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。日本汉方药主要生 产企业2 0 世纪踟年代就已经在企业内部采用高效液相色谱指纹图谱控制质量。欧洲对草药 的质量控制也采用了指纹图谱方法。指纹图谱己列入f d a 植物药产品工业指南( 2 0 0 0 年草 案稿) 、w h o 草药评价指南( 1 9 9 6 年) 、英国草药典( 1 9 8 6 ) 、印度草药典( 1 9 9 8 ) 以及加 拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也都把指纹图谱作为质量控截标准的内容之一 1 3 , - 3 7 。在我国的台湾，9 0 年代初期就中药质量评价进行了专门的指纹性研究论文发表1 3 母3 9 j 我国国家药品监督管理局已于2 0 0 0 年8 月颁布了 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求， 率先在中药注射剂领域推行指纹图谱作为重要质量控制标准刚。 1 2 3 2 指纹图谱在其他方面的应用 刘晔玮【4 1 j 等人应用g i 哺l s 联用技术对沙枣花挥发油的化学成分进行分离、鉴定，。并应 用h p l c - - d a d 技术建立了沙枣花挥发油指纹图谱。吴继红等【4 2 】将指纹图谱技术应用于果汁 质量控制中，并对建立科学合理的控制和评价果汁质量、果汁防伪方法等方面的研究工作进 行了初步探讨。廖垫【4 3 j 以乙酰基吡嗪为内标，采用反相c 1 8 柱建立了烟用香精的h p l c 指纹 图谱，并通过计算指纹图谱间的相似度考察了烟用香精的质量稳定性。钟科军m l 采用正己 烷溶剂萃取法提取咖啡香精中的挥发性和半挥发性成分，并通过气相色谱一质谱法建立了咖 9 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 第一章 啡香精的色谱指纹图谱，可用作咖啡香精的质量控制。 另外，指纹图谱还用于各种食品和植物提取物的质控与分类、石油的特性及其演化、挥 发油的成分分析中等【4 5 j 。 1 2 4 指纹图谱技术的未来展望 作为一种崭新的化学模式提取技术，指纹图谱分析展示了许多与众不同的优势和独具潜 质的发展方向，其中一些包括： 基于大范围样本的统计分析，使得指纹图谱首次将主观经验( 例如草药、酒类或香水的 内在质量) 转化为量化的阐述和分类。 遵循模糊数学的研究原则，指纹图谱着重于研究对象的整体性统计结果( 类似量子物 理) 。 着眼于研究存在于同一研究对象内部的不同类别成分的协同作用，这意味着此类组合可 能会带来新的、非线性的活性( 例如中药复方) 。 作为目前含量测定技术的有益补充，指纹图谱分析能够帮助研究和质控工作全面地掌握 和理解目标对象的完整内涵。 更重要的是，通过指纹图谱数据库资料的不断充实，更有价值的研究对象能够不断获得， 其更精确的共有模式和质量分布情况能够不断得以修正i 被称之为指纹图谱的可持续发展策 略。 色谱指纹图谱技术将被大量的应用在中草药与天然产物学、农业和生物科学、食品工业、 化妆品工业、法医学、烟草工业、临床药学和药理学等学术领域和产业。 1 3 白酒指纹图谱概述 白酒的指纹图谱基本反映了该白酒的化学成分及其含量分布情况 其作用是反映复杂成 分的白酒内在质量的均一性和稳定性。具有特征明显。专属性强、重现性好的特点j 且操作 方便、快速，是一种实现对白酒多组分多指标分析的理想方法嗣。白酒指纹特征必须既具 有”共性”又具有“个性 。所谓搿共性一，应能体现出不同厂家、不同品牌的白酒所具有的 某些共同特征。所谓。个性”，必须反映出本类白酒与其它类别白酒的区别；并能反映出不 同厂家、不同品牌的白酒之间的差异。 1 3 1 白酒指纹图谱研究意义 白酒的香味成分多达数百种，其量比关系的不同，决定了白酒的香型风格【6 l 。进行白酒 评优，首先要将参评白酒划归某一香型，然后在各类香型内部进行纵向比较，在各香型间加 1 0 2 0 0 8 贵州大学硕士研究生论文 第一章 以横向综合比较，最终评出名优白酒。白酒指纹图谱技术可以为厂家提供准确的信息，以免 因为误报香型造成遗憾。 通过建立和保存原酒、产品酒标准图谱，利用指纹图谱分析方法和条件，对不同批次的 原酒、产品酒进行质量鉴别和评价具有很大的意义。尤其是对于原酒，首先建立不同季节、 不同工艺条件下所产原酒的标准指纹图谱，然后再将各批原酒与之对比，尤其是通过对含量 很低的成分进行对比，观察其差别规律，可以科学判断原酒是否符合标准，掌握原酒的个性 特征，在使用时扬长避短合理利用。同时还可以发现原酒质量的变化，从而在生产工艺中寻 找致变因素，以对工艺作出合理的监控与指导m 。 白酒的勾兑调味技术过去一直是由具有多年经验的勾兑师凭借敏锐的感官品尝和丰富 的勾兑调味经验进行操作。人们对勾兑过程的规律性和某些反应机理认识不足，难以准确地 描述和传授。经验丰富的老专家因视觉、嗅觉或味觉的衰退对勾兑调味工作有时感到力不从 心；感官敏锐的年轻勾兑员一般要经过几年甚至十几年的艰苦学习和生产实践，才能熟练掌 握这项技术，这对于继承和发展传统的勾兑调味技术十分不利。另一方面，每次勾兑或调味， 勾兑员都要品尝大量样酒和记忆酒样的感官特点，劳动强度大，工作效率低，而且容易使感 官和大脑疲劳，引起品尝和操作的失误，造成很大浪费i 镭l 。指纹图谱应用在白酒勾兑中可避 免人为误差，提高勾兑合格率，节省人力、时间等 目前白酒的质量标准对白酒质量的表述主要包括三部分：感官指标、理化指标及卫生指 标。感官指标虽然有检测方法，但要靠入的感觉器官 4 9 1 。这样，检测的结果就会存在个体 差异；且同一个人也会受时间、环境、情绪等条件的影响而使检测结果产生很大误差。对于 理化、卫生指标基本相同的两个酒样，其感官品评的结果会大相径庭。建立一个标准图谱， 以规范、提高白酒业的行业标准是非常必要的，这样对防止假冒伪劣有很大作用刚 1 3 2 国内外对白酒指纹图谱的研究进展 目前，国外对白酒指纹图谱的研究还未见报道。而国内对白酒指纹图谱的研究也处于初 步探索阶段。劲牌公司于2 0 0 3 年6 月与北京大学中医药现代研究中心屠鹏飞教授合作启动 了。中国劲酒指纹图谱的研究”项目，并于2 0 0 4 年9 月逐步在中国劲酒生产过程中推广应 用，经过_ 年的研究，指纹图谱技术已经成功应用于中国劲酒的原料采购、生产到市场流通 的全过程【5 。秦志荣【5 2 l 于2 0 0 3 年采用高效液相色谱法建立了五加皮保健酒的石油醚一乙醚 提取物的特征指纹图谱，比较了同一厂家不同批次和不同厂家同类产品的差异，结果表明该 法简便可靠，能满足五加皮保健酒的质量控制要求。魏新军嘲l 也建立了保健酒的石油醚一 乙醚提取物的高效液相色谱指纹图谱，再次肯定了指纹图谱技术在保健酒的质量控制上的作 用。李长文酬利用宏观红外指纹三级鉴定法对金士力酱香型白酒进行了分级鉴定，直观展 2 0 0 8 贵州大学硕上研究生论文 第一章 现白酒指纹特征。酿酒生物技术及应用i 四 1 1 省重点实验室已将“白酒酒体指纹图谱与身份证 参数体系研究”申报2 0 0 7 年省重点实验室项目【5 卯。 1 4 论文主要研究内容 本论文主要研究白酒气相色谱指纹图谱。优化了白酒气相色谱的分离条件，并进行方法 学考察，通过指纹图谱技术参数的比较研究及相似性分析来研究同种香型不同品牌白酒之间 及不同香型白酒之间的异同点。 l 、优化白酒气相色谱的分离条件( 载气流速、程序升温、分流比) 并进行方法学考察 ( 系统适应性试验、3 0 分钟成分流出图、仪器精密度试验、样品稳定性试验) 2 、浓香型白酒指纹图谱研究 3 、酱香型白酒指纹图谱研究 4 、董酒指纹图谱研究 5 、米香型白酒指纹图谱研究 6 、清香型白酒指纹图谱研究 7 、不同香型白酒指纹图谱比较 本论文的目标即是希望通过建立白酒气相色谱指纹图谱分析方法及评价标准，为白酒指 纹图谱的研究作一些基础工作。此项目具有一定的理论意义和实践价值j 2 0 0 8 贵州大学硕上研究生论文第二章 2 1 引言 第二章实验条件的确定及方法学考察 气相色谱法的分离原理是使混合物中的各组分在固定相( 固定液) 与流动相( 载气) 间 进行交换，由于各组分在性质和结构上的不同，当它们被流动相推动经过固定相时与固定相 发生的相互作用的大小、强弱会有差异，以致各组分在固定相中滞留的时间有长有短，而按 顺序流出，达到分离的目的。气相色谱法本是作为一种分离手段，但自从气相色谱配备各种 检测器( 如f i d 、t c d 、f p d 等) 以后，能使分离分析一次完成，具有分离效果好、灵敏度 高、选择性强、分析速度快、用途广泛等优点，使气相色谱成为一种极重要的现代分析工具 雕4 】。目前通常采用填充色谱分析和毛细管色谱分析，进行填充色谱分析时可采用邻苯二甲 酸二壬酯( d n p ) 和吐温( t w e e n - - 6 0 ) 2 0 ：7 的混合柱( 简称d n p 混合柱) 和p e g2 0 m ( 聚乙二醇，平均相对分子质量2 0 0 0 0 ) 柱两种；进行毛细管色谱分析时通常采用f f a p 柱 ( f f a p 是p e g2 0 m 与撕肖基对苯二酸的反应产物) 5 6 1 。采用气相色谱法分析白酒香味组 分的工作始于1 9 6 8 年，轻工业部食品发酵工业研究所( 现改名为中国食品发酵工业研究院) 与中科院大连化物所合作，对茅台酒香味组分进行了剖析研究，采用了包括填充柱、毛细管 柱和制备色谱柱在内的系列分离方法以及红外、质谱等鉴定技术，从茅台酒中定性鉴定了5 0 种组分网，从而奠定了在我国采用现代色谱技术分析白酒的基础。此后的3 0 余年间，在国 内科研单位和一些白酒生产企业的共同努力下，气相色谱在白酒分析中得到了极其广泛的应 用【5 8 l 。 2 2 材料与方法 2 2 1 仪器与材料 h p 6 8 9 0 气相色谱( 美国惠普公司) ；色谱柱为h i i n n o w a x1 9 0 9 1 n - 1 1 3 ( 3 0 m x 0 3 2 r a m 0 2 5 比m ) 弹性石英毛细管柱 贵州茅台酒( 5 3 v o i ) ：贵州茅台酒股份有限公司； 乙酸正戊酯、乙醇( 色谱纯) ；均购于