（生物医学工程专业论文）分子印迹聚合物的制备及在手性识别和手性拆分上的应用.pdf

摘要 a b s t r a c t t h em o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) ，w h i c hi sb e i n g d e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s ，i sak i n do f e r o s s l i n k e dm a t e r i a lw i t hf i x e dc a v i t i e s s h a p e a n da r r a n g e df u n c t i o n a l g r o u p s b e c a u s eo f i t s p r e d e t e r m i n a t i v ea n ds p e c i f i cm o l e c u l a rr e c o g n i t i o na b i l i t y , a sw e l la st h ee a s i l yp r e p a r e da b i l i t ya n d i l i g hs t a b i l i t y , t h e m i pc a nb eu s e d w i d e l y i n b i o t e c h n o l o g y , c l i n i c a lm e d i c i n e e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g f o o di n d u s t r i e s a n ds oo n t h em 口a l s oe x h i b i t sp r o m i s i n g a p p l i c a t i o ni n r a c e m o i d r e s o l u t i o nw i t hc h r o m a t o g r a p h y , s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ，s e n s o r s ，m i m i ce n z y m e c a t a l y s t sa n d m e m b r a n e s e p a r a t i o n i nt h i sd i s s e r t a t i o n , m i p sa r es y n t h e s i z e dw i t i lc h i r a l s u b s t r a t e s s u c ha sd e r i v a t i v e so f p h e n y l a l a n i n e ，n a p r o x e na n d d e r i v a t i v e so f m a n d e l i ca c i d ，a st e m p l a t e st oi n v e s t i g a t et h ep r e p a r a t i o no f m i p sa n dt h e i rc h i r a lr e c o g n i t i o na n dc h i r a lr e s o l u t i o n 1 i n t r o d u c t i o n ：t h ee s s e n t i a lt h e o r i e s ，p r e p a r a t i o nt e c h n o l o g i e sa n da p p l i c a t i o nd e v e l o p m e n t so f m r p sa r e v i e w e d 2 m i p sa l e s y n t h e s i z e d w i t h l p h e n y l a l a n i n ee t h y le s t e r l p h e n y l a l a n i n e1 - h e x y le s t e r , 一p h e n y l a l a n i n ec y c l o h e x y le s t e ra n dl - p h e n y l a l a n i n ed o d e c a x y le s t e r t e m p l a t e sr e s p e c t i v e l y t h e n ，e f f e c t so ft h er a t i o o ff u n c t i o n a lm o n o m e r st ot e m p l a t em o l e c u l e s ，t h ep o l y m e r i z a t i o n t e m p e r a t u r ea n d s t r u c t u r e so ft e m p l a t e so nt h ec h i r a lr e s o l u t i o no fm i p sa r es t u d i e d t h es t r u c t u r e o f l p h e n y l a l a n i n ac y c l o h e x y le s t e ri ss i m u l a t e d t oe x p l a i nt h eg o o dc h i r a ls e p a r a t i o nc a p a b i l i t yo f r e l a t i v em i p _ t h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ，s u c h m o b i l ep h a s e s ，c o n c e n t r a t i o n so fs a m p l e s a n d t e m p e r a t u r e o fc o l u m n ，a r eo p t i m i z e d 3 m 1 p sw i t hc h i r a l d r u g ( s ) - n a p r o x e n a st h e t e m p l a t e a r e p r e p a r e d w i t hd i f f e r e n tf u n c t i o n a l m o n o m e r s ，c r o s s l i n k e r sa n dt h e i rc o n t e n t s ，p o l y m e r i z a t i o ns o l u t i o n t h er e s o l u t i o na b i l i t i e so f m i p s c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ea r ec o m p a r e d t h ec a v i t i e si nm i p sa n dt h em o r p h o l o g i e so fm i p sa r e c h a r a c t e r i z e du s i n g l i q u i dn i t r o g e na d s o r p t i o na n ds c a n n i n g e l e c t r o n i cm i c r o s c o p y t h eb i n d i n g c a p a c i t y o ft h e r s ) - n a p r o x e nm 碑i si n v e s t i g a t e dt h r o u 曲b i n d i n ge x p e m n a n t s s c a t c h a r da n a l y s e ss h o wt h a tt h e r ea r et w oc l a s s e so f b i n d i n gs i t e sw i t hh i 曲o rl o w a f f i n i t yi nm i p s ， t h ec o m p l e x e sf o r m e db y ( s ) - n a p r o x e na n df u n c t i o n a lm o n o e r sa c r y l a m i d ea r es i m u l a t e db y h y p e r c b e m t o i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s mo f t h e m o l e c u l a r r e c o g n i t i o n ( s ) - n a p r o x e nm i p s e h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ei sp r e p a r e dt h i o u g hi n - s i t up o l y m e r i z a t i o n ，w h i c ha v o i d s t h ec u m b e r s o m ea n dt i m e c o n s u m i n g p r o c e s so f s m a s h i n g , g r i n d i n g a n ds i e v i n g 4 as e r i e so fm i p sw i t hc h i r a ld r u gi n t e r m e d i a t ed e r i v a t i v e so fm a n d e l i ca c i da st e m p l a t e sa r e p r e p a r e d t h e s t a t e ss c h e m eo ff u n c t i o n a ln l o n o m a r s a c r y l a m i d e c o m b i n e dw i t h l - 2 c h r o l o m a n d e l i ca c i dt e m p l a t eb ys i n g l eo rm u l t ip o i n t si np o l y m e r i z a t i o ns o l u t i o ni sp r o p o s e d t od i s c u s st h ee f f e c to fr a t i oo ff u n c t i o n a lm o n o m e r st ot e m p l a t e so nm i p s i na d d i t i o n ，t h e i n f l u e n c e so fm o b i l ep h a s e s ，c o n f i g u r a t i o n sa n ds t r u c t u r e so ft e m p l a t e so ns e p a r a t i o na b i l i t i e so f m i p sc o l m n na r ei n v e s t i g a t e d i i 摘要 一 t h eb m d m gc o n s t a n t so f b i n d i n gs i t e sw i t hb d 【g ho rl o wa f f i n i t yi nl 2 - c h r o l o m a n d e l i ca c i dm i p s a r es t u d i e d t l l r o u g h b i n d i n g e x p e r i m e n t s a n d s c a t c h a r d a n a l y s e s t h ec o m p l e x e s p r e d u c e d f r o m l - 2 。c h r o l o m a n d e l i ca c i da n da c r y l a m i d ea r es i m u l a t e d t w om o d e l sw i t hd i f f e r e n t b i n d i n ge n e r g i e s a r ei na c c o r d a n tw i t ht w oc l a s s e so f b i n d i n gs i t e s t h e m i p , p r e p a r e d w i t hr a c c m a t e s l d - 2 - c h r o l o m a n d e l i ca c i da st h e t e m p l a t e a n d ( s ) a c r y l o y l 一1 一n a p h t h y l e t h y l a m m ea sf u n c t i o n a lm o n o m e r s ，s h o w sh i 【g hc h i r a lr e c o g n i t i o na b i l i t yt o 2 c 1 r o l o m a n d e l i ca c i d l - 2 一c h r o l o m a n d e l i ca c i dm i c r o s p h e r e sp r e p a r e dv i ap r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o ne x h i b i tr e g u l a r s h a p e i nn a n o s c a l er a n g e m o r e o v e r , t h es i z e sa n dt h em o r p h o l o g i e so f t h e m i r o s p h e r i cp a r t i c l e sa r e i n f l u e n c e db yc o n c e n t r a t i o no f m o n o m e r s ，p o l y m e r i z a t i o nt e m p e m t u r e ，t y p e sa n dc o n c e n t r a t i o n so f i n i t i a t o r s t h eb i n d i n g e x p e r i m e n t a lt e s t si n d i c a t et h a tt h en a n o s p h e r i c - i m p r i n t e dp o l y m e r sp o s s e s s h i g h e ra f f i n i t yt os p e c i f i ct e m p l a t e si nc o m p a r i s o n w i t ht r a d i t i o n a li m p r i n t e d p o l y m e r sp r e p a r e db y b u l kp o l y m e r i z a t i o n t h ed e p o s i t e dm i p sm i c r o s p h e r e sh a v e u n i q u e d i m e n s i o na n do r d e r l y a r r a n g e m e n t 5 t h ed e v e l o p i n gt e n d e n c yo fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n o l o g ya n dt h ef u r t h e rr e s e a r c ht o p i c sa r c e n v i s a g e d k e y w o r d s ：m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，c h i r a lr e c o g n i t i o n a n dr e s o l u t i o n i i i 东南大学学位论文独创- i ：生声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书丽使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：左叠日期：址趔 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：丛导师签名 日期：口；，矗， 第一章绪论 第一章绪论 1 1 手性及手性拆分的必要性 手性是自然界的普遍特征。构成自然界物质中的一些手性活性分子虽然从原子组成来看是 一模一样的，但其空间结构完全不同，它们构成了实物和映像的关系。由于分子中具有不对称因 素，不能互相重合，就象人有左手和右手的关系一样，因此，这类互为实物和映象关系而不能重 合的分子又称为手性分子。手性化合物由于分子中具有不对称因素而具有一种特殊的物理性 旋光性，即能将入射偏振光的偏振平面旋转一定豹角度。有旋光性的化合物又称为光活性化合物。 通常把具有实物和映像关系的一对化合物称为“对映立体异构体”，简称为“对映体”。把两个 对跌体的等物质的量的混合物叫做“外消旋体”或“混旋体”。 生物体内大分子( 如蛋白质、多糖、核苷和酶等) 几乎全是手性的，这些大分子在体内往往 具有重要的生理功能。在生命的产生和演变过程中，自然界往往对一种手性有所偏爱，如核酸只 含有d 核糖或d 脱氧核糖，蛋白质只由l 氨基酸构成，蛋白质和d n a 的螺旋构象又都是右旋的。 在由酶催化氨基酸或糖进行台成反应时，由于酶作为一种手性催化剂，能识别l 或d 单体，因而 决定了生物大分子的严格的不对称性。可以说生命现象本身就是不对称性的，或者说是手性的， 生命体系内的反应严格地建立在手性分子识剐的基础上。所阻，当手性药物、农药等化合物作用 于这个不对称的生物界时，两个对映体表现出来的生物活性往往是不同的，甚至是截然相反的。 人对药物有很高的选择性，要选择与之相匹配的药物的立体结构，通过药物与体内酶、核酸等大 分子中固有的结台位点产生诱导契合，从而抑制( 或激动) 该大分子的生理活性，达到治疗的目 的。因此，含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在着显著的 差异，往往一个对映体能很好地与手性大分子契合而发挥预期的药理作用，另一个对映体则往往 不能很好地契合，不但本身没有药效，还会部分抵消药效，有时还会产生有毒的代谢产物或引起 严重的副作用。在药理研究上，将活性最高的立体异构体叫做e u t o m e r ，而活性最低的异构体称 为d i s t o m e r 。 其中，“反应停事件”就是个突出的例子。反应停( t h a l i d o m i d e ) 曾作为镇定剂在欧洲应用。 一些妊娠妇女服用没有经过拆分的消旋体药物作为镇痛药或止咳药，生出了无头或缺腿的先天畸 形儿，有的胎儿没有胳膊，手长在肩膀上。这就是被称为“反应停”的惨剧，后来经过研究发现， 反应停的r ( + 1 异构体有镇静作用，但是s ( o 异构体对胚胎有很强的致畸作用，它在体中代谢成 1 - n - p h t a l o y l g l u t a m m e 和1 - n - p h t a l o y l l u l u t a m i ca c i d ，这两种代谢产物既有胎毒性又有致畸性。而 r _ 异构体的代谢产物d - n - p h t a l o y l g l u t a m i n e 和d - n - p h t a l o y l g l u t a m i ca i c d 既无胎毒作用，也不致 畸i l ( a ) 1 。假如人们能及早了解这种药物的立体异构体与药性的关系，就不致于产生那种灾难性的 后果了。这引起了科学家的高度重视在国外由此引发了手性药物开发的课题。而且无效或具有 毒副作用的对映体有的可以开发成为新用途的手性药物。在早几年，科学家经研究发现，反应停 具有致畸作用的s 一对映体具有抗h i v 作用。 目前，常用的化学药物约为1 8 5 0 多种1 2 1 ，其中5 0 0 多种是天然或半合成药物，除6 种非手性药 东南大学博士学位论文 物和8 种外消旋体外。都是单一对映体；另p b l 3 2 0 多种为全合成药物，其中近8 0 0 种为非手性药物； 5 0 0 多种为手性药物( 约占4 0 ) ，但作为单一对映体药物批准上市的较少，大多数仍是以外消旋体 形式投放市场。近年来，药物学家普遍认识到手性药物的发展关系国计民生，与人们的身体健康 有着直接的联系。目前世界上研制出的新药含手性中心的越来越多。为了科学、合理地使用这些 药物，减少无效体在器官上的负担，避免受d i s t o m e 或其他代谢产物的毒副作用的危害，有些药 物必须使用e u t o m e r 代替外消旋体。有些药物，两种对映体的药理作用完全不同，则应当分开使 用。有些药物的对映体拆分目前在技术上或经济可行性上还有困难，则应权衡利弊，或者淘汰， 或者在采取适当弥补措旌的基础上有限制地使用。还有一些以前因为副作用太大两被淘汰的手性 药物，若将其对映体分开进行药理研究，也可能发现对映体之一仍是有用的药物。关键是要将对 映体分开，并分别对它们以及它们的外消旋混合物进行药理的、动力学的、毒理的及代谢物性质 的研究。 1 9 9 2 年3 月，美国食品和药物管理局( f d a ) 发布了手性药物的行政指令要求所有在美国上市 的消旋体药物均要说明其中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。手性药物在工业发 达国家备受政府的关注，并且得到了较快的发展。这可以由1 9 9 3 2 0 0 3 年全世界手性药物的销售 统计和预测”1 说明。 表1 11 9 9 3 2 0 0 2 年手性药物的销售额和预测 t a b l e1 1w o r l d w i d es a l e sm a r k e to f c h i r a ld r u g s 1 9 9 7 年1 月，f d a 发布了手性药物发展的另一条行政指令，对于早期批准上市的消旋体药物 要求用相应成分手性药物替代，对于这类新上市的光学纯药物将提供5 年专卖权，并且相应消旋 体药物须撤出市场。显然，这为手性药物提供了一个极好的发展机遇。目前这个年销售额超过1 0 0 0 多亿美元的高新科技产业强烈地吸引世界各国的大制药公司及其相关的研究机构，使其相继从事 手性药物的研究与开发。进入九十年代以来，对手性药物的研究己成为医药工业界中最引人注目 的领域之一。据美国1 9 9 3 - 1 9 9 6 年的统计，手性药物的销售额每年以6 6 的速度增长，而消旋体 药物每年以2 9 5 的速度递减。开发手性药物已成为非常迫切和现实的问题。我国创制新药较少 是因为研究的周期长、耗资多、风险大。一般创制一个新药需要十年左右，耗资几千万甚至亿元 以上。相比之下，手性药物研究风险小、周期短、耗资少、成果大，是件利国利民的好事。目前 在国内，从事基础研究的人比较少，创制新的技术、开发新的药物非常困难另外研究经费的匮 乏使手性药物的研究不免捉襟见肘。但是，手性药物的研究前景令人充满信心。如果我们能够大 力开展手性药物的研究，对医学、物理科学、化学科学等学科将有很大的促进作用，也会产生巨 大的经济效益。 2 第一章绪论 为确保目前所使用的药物和新开发的药物的有效性和安全性分离并分别对两个对映体异构 体进行药理、生理、毒理学测试是十分重要的，对于测定和控制药物的主要化学组成至少三种情 况下是必须的，而且每一种情况都涉及一个特殊的技术问题：( 1 ) 在制造过程中，需要制备规 模的对映体分离： ( 2 ) 在质量控制过程( 或常规分析) 中，要求对映体纯度的测定和光学异构 体稳定性监测；( 3 ) 在手性药物的血液沉积分布、代谢和药效能的药理学研究中，则要求超痕量 的分离分析方法。因此，一个准确稳定的手性拆分和分析方法是非常必要的。 1 2 手性拆分的方法 在处理有生物活性物质，如药物产品、维生素、信息素、辅酶及一般天然存在的手性化合物 时，对映体的分离和分析都是头等重要的问题。 获得对映体的纯的化合物的途径，归纳起来主要有以下几种方法： 1 从天然存在的光纯性化合物中获得，这种天然来源就是所谓的“手性池”( c h i r a l p 0 0 1 ) 。 2 由天然存在的手性物质经化学改造合成。无需经过繁复的对映体拆分，利用其原有的手 性中心，并在分子的适当部位引进新的活性功能团，可以制成许多有用的手性化合物。 3 外消旋体的化学拆分。通过化学反应的方法，即用一种手性试剂把外消旋混合物中的两 个对映体转变成非对映异构体然后利用两种非对映体异构体的物理性质和化学性质差 别，将其分开。 4 ，外消旋体的生物拆分。即用微生物( 或酶) 选择性地将两对映体之一转变成其它化合物， 达到分离的目的。 5 ，色谱分离# 即用手性色谱柱直接分离对映依或由手性色谱柱间接分离非对映异构体。 待分离对映体与手性色谱中的手性选择器可逆地形成稳定程度不同的一对非对映分子复 合体，从而其色谱保留值不同。手性色谱中的手性选择器可以是手性固定相( c s p ) 或 液相色谱流动相中加入有手性识别能力的添加剂。手性流动相添加剂法是通过对映体与 添加到流动相中的手性分子形成一对非对映的络合物，由于非对映络合物的稳定性或与 固定相的键合等性质的差异而得到手性拆分。利用手性添加剂的种类很多，对于不同的 分离需要可选择不同的手性添加剂。然而该方法也有很多不足之处，有些手性添加荆价 格过高或需自己合成，且当用于为对映体制备时手性添加剂的除去也使得制备工作更加 复杂化，同时色谱的检测方法也限制了手性添加剂的选择范围。据此，在利用h p l c 作手 性分离时一般都选用手性固定相来进行。手性固定相法是基于样品与键合到载体表面 的手性选择剂或手性识别剂间形成暂时非对映络合物的能量差或稳定性不同而达到手性 分离。基于立体化学、现代色谱技术的进展和超分子化学的研究，新的手性固相和手性 3 东南大学博士学位论文 选择剂不断被设计和采用，迅速推动了色谱手性分离技术的发展和分离机理的研究。 用液相色谱法解决立体化学问题，由于它的快速、操作方便、成本不高等优点，已经受到广 泛重视。最新研究结果清楚表明这种方法的巨大威力和广阔前景，更刺激着各项技术。先进国家 将大量人力和物力投入到用液相色谱方法测定手性化合物对映体纯度，确定绝对构型及实际分离 有痕量的旋光异构体的研究工作。预计在今后的几年里，用液相色谱法解决立体化学问题将迅速 增加，大范围内使用高水平液相色谱装置将变成常规操作。使用高效手性固定相作填料的大型色 柱，在工业规模上劁各某些对映体药物也不是不可能的。 p a u l i n g “1 早在1 9 4 0 年曾建议将一个分子“印迹”到一种基质上，使得这种基质对该分子有 更强的保留。p a u l i n g 的这种设想启发j w u l f fg “1 等人根据酶和抗体具有形状选择性的特点， 发展了用于色谱手性拆分的分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t i n gp o l y m e r ，n i p ) 。w i p 因其 特异的识别能力，即使对难于分离的手性异构体也可进行分析分离，并在在许多领域，如亲和色 谱固定相”、固相萃取“1 、传感器”2 “、模拟抗体”、模拟酶催化“”1 、临床药物分析”“、 膜分离。83 ”等方面有美好的应用前景。下面介绍分子印迹聚合物的原理、发展和应用。 i 3 分子印迹聚合物的基本理论 1 3 1 分子印迹技术的基本原理 分子印迹技术的基本思想是源于人们对抗体一抗原或酶的专一性的认识，即一种抗体只能针 对一种抗原，一种酶只能选择性地催化一种或固定的几种底物，而分子印迹技术则通过人工的方 法合成与目标分子耦合的大分子化台物：模板分子( 待拆分的单一对映体或其它难分离、检测的 分子) 与可聚合的功能单体通过共价键或非共价键方式形成主一客体配合物，然后通过大量交联 剂聚合将其结构固定在聚合物网络中。除去模板分子后，得到的刚性聚合物中存在着记录模板分 子形状和大小的空穴，且功能基在空穴中的精确排列与模板分子互补。对模板分子表现出特效的 选择性和识别能力。 4 第一章绪论 图1 1 分子印迹过程示意图 f i g 1 1s c h e m eo f m o l e c u l a ri 婶血血g 显然，分子印迹技术不需要复杂的合成设计和精细的制备技术，制各过程简单。用这种基于 仿生方法合成的大分子聚合物即为分子印迹聚合物嘞i p ) ，具有类似于生物受体结合位点的结构 特征，它与模板分子的位置、形状、官能团互补，对模板分子具有高度的选择性。此# l 、m i p 具有 高度的稳定性，在高温、高压、酸、碱及高浓度离子等各种恶劣条件下也能保持其原有的特性。 它能反复使用达1 0 0 次之多。在室温下保藏8 个月而印迹能力不变”。近年来，分子印迹技术方面 的研究吸引了各国学者的广泛兴趣，国内外有不少综述介绍了这方面的理论和研究成果“+ “。 1 3 2 分子印迹聚合物的结合功能 m i p 的结合功能来源于模板分子和可聚台的功能性单体通过一定的的结合基团的结合作用使 印迹聚合物具有特定的印迹空穴。在分子印迹过程中，结合基团尽可能满足下列要求：一、模板 分子与单体间的结合基团的键合要尽可能的强，这样才能在聚合过程中牢固地把模板分子固定 住，在交联时才能把单体的结合基团按确定的空间位置固定排列。二、生成聚合物后，模板要尽 可能完全除去。三、重要的是结合基团要能很好地与要结合的底物，例如模板底物有良好的相互 作用，这一过程应尽可能快速和可逆性好，以使用于色谱分离或催化。 分子印迹技术是依靠合成的方法引进“识别位置”，其合成方法有两种：模扳预组装方式和 模扳自组装方式。由于预组装方法以可逆的共价键键台，可称其为共价方式；模扳自组装方式以 非共价键形式作用，所以又称非共价方式。 东南大学博士学位论文 1 3 2 1 共价结合作用 模扳预组装方法是w u f fg 4 9 1 首先提出的分子印迹技术，聚合前模板分子与可聚合的功能单 体通过可逆共价键结合( 硼酸酯、缩醛酮、酯和螯合键作用、硼酸基) 衍生化形成可聚合的模板单 体”5 。“1 ，用过量交联剂经自由基聚合得高交联高分子，水解等条件迫使模板分子与大孔聚合物 间的共价键断裂，释放出模板分子，产生共价型印迹聚合物。其结构中具有与模扳分子互补通过 共价键结合的反应基团，可选择性地结合模板底物。 糖类衍生物印迹聚合物的研究是这类聚合物的典型实例”“。如图1 2 所示，以半乳糖为模 板分子，以4 一乙烯苯硼酸为功能性单体，利用糖的两个羟基基团和硼酸基团通过酯化合成可聚合 的模板单体然后在惰性溶剂和大量交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯存在下进行自由基聚合可产生 大孔聚合物在碱性条件下用水或甲醇处理可除去模板分子便可获得具有与模板分子匹配的手性 结合位点的印迹聚合物。w u l f fg 等人对这个体系进行了优化和理论研究“，为分子印迹技术 的发展奠定了基础。 图1 2 模板预组装方法的应用实例 f i g 1 2a p p l i c a t i o ne x a m p l eo f t e m p l a t ep r e o r g a n i z e da p p r o a c h 许多二醇类化合物用作模板，和4 一乙烯苯硼酸通过酯化然后聚合生成共价印迹聚合物。以甘 油酸酯或丙二醇“”为模板分子制备的含有一个结合基团的印迹聚合锯对外消旋体呈现明显的分 离能力”o ：在空穴中含有两个硼酸基团的印迹聚合物用于拆分模板分子的外消旋体时呈现出很离 的选择性。通过对印迹聚合物的结构优化，在为拆分糖而制备的聚合物方面，现在已首次不需要 把糖衍生化就能将糖的外消旋体拆分了l 5 2 , 5 7 。 人们可能会想到，三个共价结合作用对分子印迹和后来的分子识别特别有利，但是，研究结 果表明，三个硼酸基团，三种不同的共价结合作用或三种以上的非共价结合作用“”均导致较低 的分离能力，其主要原因是这类印迹聚合物的结合位点与底物间的结合速度很低。 硼酸基团的柔性对其印迹聚合物的分离特性的影响也已进行了研究”“，结果发现，孔穴硼酸 基团的柔性增加其对光学异构体的选择性降低。 采用西佛碱的共价键作用用于分子印迹也进行了广泛研究”“。原则上，西佛碱适用于分子印 6 第一章绪论 迹和后来的底物结合，因为平衡位置有利，可是，对于要求快速的色谱来说，平衡速度太慢了。 使用适当的分子内的邻近基团活化可使平衡速度有相当大的增觚氨基酸能以氨基酰替苯胺的形 式进行外消旋体拆分。这时，可聚合的模板分子可用n - ( 一4 一乙烯苯叉基) 一卜丙氨基酰替苯胺或5 一 乙烯基水杨叉基的衍生物。通过西佛碱的结合基团成功地将西佛碱固定”6 1 ，或个西佛碱和另 种作用相结合进行固定。结合单醇时，硼酸的分子内单酯和某些环状半缩醛都可用来制备印迹 聚合物。两种情况都可较快地达到结合平衡。酯基和酰胺基非常不适用来把基团引进到印迹聚合 物上，因为这些酯和酰胺只有很低的比例( 2 0 ) 能够被解脱下来。 s h e akj 等”用缩酮引入结合基团，羰基基团之间不同距离的二酮用可聚合的二醇处理， 然后除去模板分子所得的印迹聚合物当用二酮重新处理时对其原来所用的模板有很高的选择 性。这种聚合物重新结合时键的生成速度很慢，因此太部分的结合反应是这一过程似乎是动力学 控制的。 由于共价作用一般较强，在模板预组织或识别过程中结合和离解速度慢，难于达到热力学 平衡，不适用于发展快速的识别方法，而且识别机理与生物识别差别甚远，因此发展缓慢。 1 3 2 2 非共价结合作用 使用分子印迹技术制备具有选择性的印迹聚台物的最简单的方法就是利用模板自组装方法。 即首先模板分子与可聚合的功能单体在溶液中通过离子作用、氢键、疏水作用和金属配位等非共 价键作用形成有确定关系的主客体配合物，然后这种溶液状态下的自组装配合物结构通过大量交 联剂聚合将其结构固定在聚合物网络结构中，除去模板分子后得到非共价型印迹聚合物。其结构 中含有对模板分子有选择性结合的识别位点。高交联度确保识别位点的刚性，识别位点的形状及 其功能基的精确排列与模板分子互补是印迹聚合物呈现对模板底物高亲合性和高选择性的基础。 图1 3 为模板自组装方法合成l 一苯丙氨基酰替苯胺m i p 的典型实例。首先l 一苯丙氨基酰替苯胺 模板分子使用可聚合的功能性单体甲基丙烯酸在惰性溶剂中自组装成一个主客体配合物，然后以 l - - 醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过自由基聚合合成了一个刚性聚合物。反复洗涤除去模板分 子后聚台物中留下对模板分子有高度专一性的结合位点这些结合位点通过静电作用和氢键优先 再结合模板分子，可用于此氨基酸衍生物的光学异构体的识别。i h o s b a c hk 和s h e akj 等研究 组对这个识别过程进行了色谱优化研究“”“。 东南大学博士学位论文 + h 。 圈1 3 模板自组装方法的应用实例 f i g 1 3a p p l i c a t i o ne x a m p l eo f t e m p l a t es e l f - a s s m b l ya p p r o a c h 非共价键作用比较重要的类型是静电作用。例如，以甲基丙烯酸作为功能性单体，用l 一苯丙 氨基酰替苯胺作模板分子进行分子印迹时，这种静电作用对选择性的影响已作了详细的研究 ”“，发现这种作用的强度与甲基丙烯酸和苯丙氨基酰替苯胺的p k a 、溶液的p h 值有关，有时 还与竞争性离子的存在有关。可是，只有一种静电作用会导致获得低选择性的印迹聚合物1 。因 此需要有另种作用存在，显然，一种可聚合的酸和碱同时都能通过静电作用与模板分子发生作 用，这时要求模板分子的酸度必需比甲基丙烯酸的酸度高才能使它优先与所加的碱发生反应 7 s 1 8 第二种有用的类型是生成氢键的作用。例如甲基丙烯酸的羟基和酰胺中的氧原子之间可出 现氢键，在这种情况下可得到选择性很高的结合位点。非共价作用的m i p 己可以用来分离核苷酸 和核苷。s h e akj 等”使用9 一乙基腺嘌呤为模板，甲基丙烯酸为功能单体，获得了很高选择性 的印迹聚合物。这种聚合物结合模板分子的选择性非常高，或者说类似于经过复杂合成手续制得 的低分子量受体的选择性。 第三种作用为金属配基结合作用。通过与金属的配位键在聚合反应中及其最终的聚合物中可 获得一种与配体交换色谱中使用的键相似的键。在多数情况下底物与聚合物的荐结合常常能满 足快速色谱分析的要求。f u j i iy 等“”首次使用这种方法制得了金属配位印迹聚合物。他们使用 ( 1 r 2 r ) 一1 ，2 - 二氨基环己烷和4 ( 4 一乙烯苄氧基) 水杨醛形成的西佛碱配基，通过c ? + 离子把氨基 酸结合到配基上，在光学拆分n 苄基一d ，l - 结氨酸获得了非常高的选择性。这种聚合物拆分模板 分子的外消旋体时发现，它有特高的分离系数。更详细的研究表明，主要的分离能力来自孔穴效 8 第一章绪论 应。所得到的选择性比许多酶的选择性都高。不幸的是，口+ 的配台物的传质速度在色谱分离中 非常慢，因此将其用于色谱分离非常困难。 晟近，a r n o l dfh 和d h a lpk 等”“8 ”相当详细地研究了含咪唑的化合物与c u ”的配合物 的结合作用。配位平衡实验表明此聚合物优先结合它的模板化台物分子，分离系数a 为11 7 1 3 5 之间。这些实验是为了开发出一种新方法使之能通过聚合物上一些结合基团的准确空间排列有效 地识别蛋白质。 1 3 2 3 牺牲配基法 v u l f s o nen 等”人又发展了一种称之为“牺牲空间法( s a c r i f i c i a ls p a c e rm e t h o d ) ”的 分子印迹技术。该法实际上是把分子自组装和分子预组织两种方法结合起来形成的方法，把制备 印迹聚合物的共价作用的优点和平衡时非共价作用的长处结合在超模板分子与功能单体以共 价键的形式形成模板分子的衍生物( 单体一模板分子复合物) ，这一步相当于分子预组织过程，然 后交联聚合，使功能基固定在聚合物链上，除去模板分子后，功能基留在空穴中。当模板分子重 新进入空穴中时，模扳分子与功能单体上的功能基不是以共价键结合，而是以非共价键结合，如 同分子自组装非共价作用和共价作用结合起来使用。例如，静电作用、电荷转移、氢键作用都能 够和共价键结合起来使用，所得的印迹聚合物的选择性有时要比用单个共价键作用结合模板分子 的聚合物高得多。 如图y u l f s o nen 以4 一乙烯苯基羰酸酯与胆固醇制备印迹空穴，通过共价作用同模板分子 形成复合物，然后羰酸酯在碱性条件下水解有效地完全裂解并释放出二氧化碳，打开了单体和模 板分子间的共价键，此时m i p 上便产生了一个非共价型的分子识别，结合位点苯酚基能够和醇通 过氢键发生作用。 勺a 。 b n 鹳o c 2 4 h 图1 4 牺牲配基法的应用实例 f i g 1 4a p p l i c a t i o ne x a m p l eo f s a c r i f i c i a ls p a c e rm e t h o d 9 东南大学博士学位论文 1 3 2 4 印迹方法对照 非共价分子印迹与共价分子印迹比较具有以下的优点：非共价分子印迹方法简单，无需合成 模板分子和功能单体的键合物，模板分子和功能单体间的作用较弱，可以在较温和的条件下很容 易从聚合物中除去，印迹聚合物与模板底物的可逆性结合作用也快。其分子识别过程更接近于天 然的分子识别系统，如酶和底物、抗体和抗原等。 非共价作用也有它的局限性。非共价分子印迹时，由于模板分子和功能单体间的作用较弱， 因此在聚合前，往往加入过量的功能单体以利于与模板分子形成复台物。模板分子与功能单体处 于动态平衡，导致聚合物中形成了对模板分子具有不同亲和力的作用位点。因为非共价m i p 作用 位点的非均一性与抗体的多抗性( p o l y c l o n a l i t y ) 相似，所以也称为m i p 的多抗性。“。 离子键和疏水作用等分子间可用以大范围的化台物，但它们的方向性较弱，因此其专一性较 差。利用n n 作用( 常有方向性) 和氢键作用( 常有很好的方向性) 在许多情况下可以提供一个很 好的折中方案。氢键或许有更大的利用范围，尤其是它可以通过多重相互作用提供专一性很高的 结合作用。 非共价作用的适用性较广，各种作用可进行组合以产生协同效果。因而非共价分子印迹得 以广泛应。p j i p 的蓬勃发展也正是得益于m o s b a c hk 提出了非共价分子印迹的方法”“。 共价作用的优点是聚合中单体和模板分子间的作用力强，形成的复合物稳定，能获得在空间 精确固定排布的结合基团，共价m i p 其作用位点则比较均匀，具有单抗性( m o n o c l o n a l i t y ) 。共 价键限制性强，即它只对特定的功能基有专一的结合作用，共价键一般有较强的方向性因此从 理论上说共价结合的方法能产生高选择性的印迹聚合物。 但共价印迹过程比较复杂，要求模板分子和功能单体之间的作用为可逆共价键，使得模板分 子和功能单体的选择受到限制。另一个