（分析化学专业论文）基于金电极的电化学及电化学spr生物传感器.pdf

摘要 生物传感器是- - f - 由生物、化学、物理、医学、电子技术等 多种学科相互渗透成长起来的新学科。近年来关于生物传感器的 研制一直是人们研究的一个热门课题。本论文在前人研究工作的 基础上，主要做了以下几方面的工作： 1 利用巯基丙酸单分子层修饰金电极，获得了铁蛋白的直接电化 学，用s p r 表征了电极组装过程，循环伏安法研究了这一电子 转移过程。比较了静电吸附与键合固定两种修饰方法的不同， 发现利用键合固定的方法并不能象细胞色素c 那样得到稳定的 电化学信号，这可能是由于经过多圈扫描以后，铁蛋白中活性 中心的释放引起的。一个电位调制的关于铁的释放与获取机理 被进一步证实。 2 利用分子之间的静电相互作用和生物分子之间特异的相互作 用成功的实现了两种重要的酶在金电极上的固定。并用表面等 离子体共振技术实时检测了膜的形成过程，用循环伏案法和微 分脉冲伏安法检测了膜的组装过程，同时用电化学阻抗法表征 了这种膜，结果表明这种方法形成的多层膜是稳定的、均一的、 电化学活性的，可以用来作为构建生物传感器的基底。 3 将上述构建的多层膜用于葡萄糖的测定，并用原位的电化学 s p r 技术作为检测手段，成功的制备了一种新型的电化学s p r 葡萄糖传感器。结果表明这种传感器测定葡萄糖浓度是可行 的，s p r 技术可以作为电化学的辅助手段来测定传感器，并且 由于同时获得了多种信号，以有助于我们获得更多的有关电化 学酶反应的动力学参数。另外，此种固定方法也可以用于其他 酶的固定，用来测定不同的基质，为生物传感器的发展提供了 新的思路。 关键词：生物传感器金电极电化学s p r 层层组装铁蛋白 a b s t r a c t b i o s e n s o ri san e w s u b j e c tb a s e d o n b i o l o g y 、c h e m i s t r y 、p h y s i c s ， m e d i c i n ea n de l e c t r o n i c s 。t 娩m a n u f a c t u r eo fb i o s e n s o ri saf o c u s p r o j e c t i n m a n yr e s e a r c h f i e l d r e c e n t l y b a s e d o nt h e f o r e g o i n g r e s e a r c h t h er e s e a r c hc o n t e n to f 凌i st h e s i sa sf o l l o w s ： l 。t h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro ff e r r i t i nc o v a l e n t l yo nm o d i f i e d g o l d e l e c t r o d ei s i n v e s t i g a t e d c y c l i cv o l t a m m e t r yw a st h ep r i n c i p a l m e t h o du s e dt oi n v e s t i g a t et h er e a e t i v i t yo ft h ea d s o r b e dl a y e r m o r e o v e r , t h ep r o c e s so f m o d i f i e de l e c t r o d ew a sc h a r a c t e r i z e db v s 豫o n 氇i sm o d i f i e d e l e c t r o d e , f e r r i t i ne x h i b i t s r e s o n a b l y w e l l d e f i n e dc u r r e n t - p o t e n t i a lc u r v e s 融a d d i t i o n t h em e c h a n i s m o f e l e c t r o c h e m i c a l l yr e g u l a t e di r o nu p t a k ea n dr e l e a s ef o rf e r r i t i n w a so b t a i n e d 。 2 ，t w oi m p o r t a n te n z y m e sw e r ei m o b i l i z e du s i n gt h ee l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o no fm o l e c u l a ra n dt h e b i o l o g i c a ls p e c i f i c i n t e r a c t i o n t h es u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) t e c h n i q u e 、c y c l i c v o l t a m m e t r ym e t h o da n de l e c t r o c h e m i s t r yi m p e d a n c es p e c t r u m ( e i s ) w e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h i su l t r a t h i nf i l m i ts h o w st h a t t h i sk i n do ff i l mw a s u n i f o r m 、s t e a d y a n de l e c t r o a c t i v e i tm a y b e u s e dt oc o n s t r u c tt h eb i o s e n s o r sa n d b i o f u e e e l l s 3 。t h et h i nf i l mc o n s t r u c t e di nc h a p t e r2w e r eu s e d 协c o n s t r u c tt h e g l u c o s e b i o s e n s o r i n s i t u e l e c t r o c h e m i s t r y s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e ( e s p r ) w a s u s e dt od e t e c tt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n i t s h o w si ti s p o s s i b l et od e t e c tt h eb i o e l e c t r o 。e n z y m a t i cr e a c t i o n u s i n g t h ee s p r t e c h n i q t i e s p rt e c h n i q u em a y b ec o m p l e m e n t e d t ot h e e l e c t r o c h e m i s t r y m e a s u r e m e n t 。m o r e o v e r , q u a n t i t a t i v e i n f o r m a t i o no f 付l er e d o x e n z y m er e a c t i o nt h r o u g ht h et w o p a r a m e t e r sm a y b eo b t m n e d t h i sa p p r o a c hc a na l s ob ee x t e n d e d l l b yu s i n g o t h e ro x i d o r e d u c t a s e sa n d a p p l i e d t ot h em e a s u r e m e n to f d i f f e r e n ts u b s t r a t e s k e y w o r d s ：b i o s e n s o r g o l d e l e c t r o d ee s p r l a y e r - b y * l a y e r f e r r i t i n l i i 湘潭大学碗点煦墼茎主垒璺蹩堕鱼堡堂墨璺圭璺璺! p r 喜! ! 堡受鼹一一一 引言 生物传感器是- - f 由生物、亿学、物遴、医学、电子技术等 多种学科相互渗透成长起来的新学科。由于其选择性高，分析速 度快，操作简单和仪器价格低廉等特点， 嚣且可以进行在线甚至 活体分辑，医此弓l 怒世界各孱静极大关注。 、 生物传感器的发展到目前总共经历了三代：1 9 6 2 年c l a r k 1 】 在氧电极的基础上提坦了研制麓萄糖传感器的设计原理，1 9 6 7 年 唧莲i 沁【2 】磷簇壅鬣券土第一支麓莓耱簧感器，这霹称必第一代传 感器，其后，逐步发展出组织、微生物、免疫和细胞器等传感器， 成为第二代生物传感器，第三代生物传感器是将生物技术和集成 电路技零结会起来，研裁残场效应生物传感器，还纛入将生物楱 感技术翱流动注射分析与电脑技术相结合，预计将发挥更大的佟 用。 是前，生物传感器主要包攒魍纯学生物传感和光学生物传感， 还有基于热学襄压瞧晶体的生物传感，近来，关于毫化学表面等 离子共搬传感也受到了人们的关注。无论是基于电化学、光学、 热学或压电晶体等不同类型的生物传感器，其探头均祷两个主要 部努组成，一是感蔽爨，它是凌对被溺定憋物覆( 瘾戆) 具袁裹 选择性分子识别功能的膜构成；二是转换器，它能把膜上进行的 生物反成中消耗或生成的化学物质或产生的光、热等转变为电信 呻匝四一 生物传感器示意图 l 湘潭大学硕士论文： 基于金电极的电化学及电化学s p r 生物传感器 号，最后把所得到的电信号经过电子技术的处理后在仪器上显示 或记录下来。生物传感器成功的关键是选择一个非常匹配的测量 参数，一种良好的、容易为批量制各开发的固定化方法，以及测 量参数与所选应用的相关性。 一电化学生物传感 1 电化学生物传感器的发展历史 最早将酶作为与电极结合试剂的概念是1 9 6 2 年由c l a r k 和 l y o n s 1 建立的，他们提出，可以通过检测其酶催化反应所消耗的 氧来测定葡萄糖的含量。 葡萄糖+ 0 2 当葡萄酸内酯+ h 2 0 2 u p d i k e 和h i c k 2 】报道了在极谱氧电极表面采用聚丙烯酰氨 凝胶膜固定葡萄糖氧化酶的第一支酶电极，也可以通过检测酶反 应的产物h 2 0 2 来测定葡萄糖。继这些开创性的工作之后，在酶电 极和生物传感器方面每年均有大量的工作发表，涉及到反应池的 设计和几何学、固定化方法、膜的组成、电极的构象等、根据酶 与电极间电子转移的机理大致可将电化学生物传感器分为三代： 上述采用酶的天然介体氧的催化原理设计制作的酶传感器称 为第一代生物传感器；第二代生物传感器将人工合成的酶介体掺 入酶层中，改进了分析参数并简化了处理步骤，能进行无试剂的 测量：第三代生物传感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极 间的直接电子转移制作的酶传感器，也有人认为第三代生物传感 器包括传感体中的电子信号处理、微型化与多功能传感。 2 电化学生物传感器中酶的固定化方法 制备生物传感器的最通常生物组分是酶，因此，对于酶的固 定化是研制生物传感器的一个非常重要的方面。要使酶作为生物 敏感膜使用，必须研究如何将酶固定在各种载体上，这称为酶的 固定化技术。通常规方法相比，使用限制在电极表面的固定化酶 湘潭大学硕士论文：基于金电极的电化学及电化学s p r 生物传感器 具有很多优点：1 ) 当酶被固定化时，可得以很快的从反应混合物 中分离，并能重复使用；2 ) 通过合适地控制固定化酶的微环境( 即 通过化学修饰电极表面) ，可获得很多需求的性质，如：增加稳定 性、高灵敏度、快速的响应、高取样速率等；3 ) 在选择电极尺寸 和形状方面具有较大的灵活性，易微型化或采用复杂的表面，如 网状玻碳；4 ) 可防止溶液中其他物质的干扰和对电极表面的玷污 等。 在电极上固定酶有多种途径，通常包括吸附法、共价键合法、 层层组装法、包埋法、交联法等，选择固定化技术时需考虑如下 要求： ( 1 ) 对不同电极表面方法的可用性 ( 2 ) 处于固定化状态的酶应呈现最大的生物活性 ( 3 ) 固定化的酶应可在比溶液中较宽的p h 范围或不同的p h 下 操作 ( 4 ) 具有较高的稳定性 ( 5 ) 具有同时固定多种酶的能力 ( 6 ) 必须尽量避免或很少有酶的泄漏 2 1 物理吸附法 酶在电极表面的物理吸附是一种较为简单的固定化技术。酶 在电极上的吸附通过挥发含酶的缓冲溶液来进行，由于温度较低， 因此，酶不会发生热变性，吸附后，还可以通过交联法来增加稳 定性。 物理吸附具有无需化学试剂、极少的活化和清洗步骤，同其 它化学法柱l 比，很少发生酶降解，对酶分子活性影响较小等优点， 但对溶液的p h 变化、温度、离子强度和电极基底较为敏感，需 要对实验条件进行相当程度的优化，该方法还由于生物组分易从 电极表面脱落，而不被广泛采用，同其它固定化技术相比，生物 h 日潭大学硕士论文： 基于金电极的电化学及电化学s p r 生物传感器 组分的寿命较短。 a a 物理吸附法 2 2 共价键合法 b b 键合固定法 c c 层层组装法 将酶分子通过共价键合与电极表面结合而固定的方法称共价 键合法，通常要求在低温( 0 ) 、低离子强度和生理p h 条件下 进行，并常加入酶的底物以防止酶的活性部位与电极表面发生键 合。 电极表面的共价键合较吸附困难，但提供了较稳定的固定化 酶，因此，被较多地采用。当向电极表面共价键合生物组分时， 需考虑很多因素，附着过程通常包括三个步骤：基底电极表面的 活化，酶的偶联及除去键合疏松的酶，这些步骤中每一步合适的 实验条件则取决于生物组分及偶联试剂的特性。 2 3 层层组装法 将酶或其它生物分子与另外一种分子，通过静电作用或生物 分子问特异的相互作用，连续组装多层这两种生物分子的方法， 称为层层组装法。自从d e c h e r 3 在1 9 9 1 年第一次报道这种技术 以后，它成了构筑蛋白质多层膜的一种重要方法。目前关于生物 分子的层层组装主要基于两种原理：一种是基于静电作用，另一 湘潭大学硕士论文；基于金电极的电化学及电化学s p r 生物传感器 种是基于生物分子之间的特异的相互作用。从某种程度上来讲， 这是一种简单而有效的生物分子的固定方法，因为这一组装方法 在很大程度上不受基底的性质、尺寸和形貌的影响。但是此中方 法必须首先对电极表面进行处理使其代电荷，或者是能与生物分 子发生特异的相互作用。目前这种技术的应用比较广泛，在生物 传感器的制造方面更是表现出了其独特的优越性。 2 4 交联法 通过采用双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与凝胶，聚合 物之间交联形成网状结构而使酶固定化的方法称为交联法。最常 用的交联试剂为戊二醛，能在温和的条件下与蛋白质的自由氨基 反应，如下式所示： c h o 世h 2 ) 3 e h o n h 酶 n h b s a 0 h d h n h - 酶 一 c c h 2 ) ， c ! h - n h - b s a 6 h 物理吸附和凝胶聚合物包埋法中也常辅以交联法来防止酶的泄 漏。 采用这种方法的局限是膜的形成条件不易确定，须仔细地控 制p h 、离子强度、温度及反应时间。w i n g r a d 等 4 】表明，由于扩 散受到阻碍，致使响应信号下降，响应时间延长；戊二醛的浓度 较低时，蛋白质溶液不会被固定化，而戊二醛的浓度较高又会使 酶失活；同时，双功能团试剂也可能不是选择性的，即可能发生 分子间键合又可能发生分子内键合。 辩潭丈学颈士论文；基于金电辍的电诧学爰毫篷警s p r 生塑堡壁爨 d d 交联法 e e 包埋法 2 5 聚合物凝胶包埋法 迄今必止，应用簸普遍的溺定纯鼓拳跫采曩凝胶，聚合耪包 埋，它熊将酶分子或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网 状结构中，最常用的聚合物有聚丙稀酰氨。该技术的特点是：1 ) 可采用温葶珏的实验条件及多种凝胶聚合物；2 ) 大多数酶可提容 易邈掺入浆台耱膜串，一般苓产垒纯学修饰；3 ) 对酶活牲影响较 小；4 ) 膜的孔径和几何形状可任意控制；5 ) 包埋的酶不易泄漏， 并司采用其它固定化技术，如熬价键合和交联进一步改进包埋的 稳定矬；6 ) 可固定藤浓度盼潘燃生耪组分等。这孛固建纯技术在 某些方两也具有一定的局限性，如必须控制很多实验因素；聚合 物形成过程中产生的自由基对擞物组分可能产生去活化作用；聚 合物的空间结构使之局限于测定较小足寸的物质；丽且，由于大 的扩散撵阻使响应辩阀增加。聚鬻这释霾定纯技术时，通常采震 物理的方法将凝胶，聚合物限制在电极表面，这使得传感器难以微 型化。 对予上述的薅鹩豳定铯方法缀多也使爝予英袍生物分子的露 定，如：蛋白质，d n a 等。 二光学焱功传感 湘潭大学硕士论文： 基于金电极的电化学及电化学s p r 生物传感器 光学生物传感在最近几年也得到了很大的发展，最典型的是 研究生物分子相互作用的b i a c o r e 仪器。这种仪器是基于表面等 离子体共振技术建立起来的一种光学生物传感方法。 表面等离子体共振技术( s u r f a c 龟p l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 是 利用金属薄膜的光学耦合产生的一种物理光学现象。自从1 9 8 2 年 n y l a n d e r 和l i e b e r g 等人【5 ，6 首次将s p r 技术用于免疫传感器领 域以来，表面等离子体光学生物传感器得到了广泛的应用和研究， 已经成为研究生物分子相互作用的主要手段。仅在近3 4 年间， 有关这方面的文章多达几千篇，其研究内容涉及蛋白质一蛋白质 7 - 9 】、蛋白质一d n a 1 0 ，1 l 】、d n a - - d n a 1 2 ，1 3 】、抗原一抗体 1 4 ，1 5 】、受体一配体 1 6 ，1 7 等的相互作用。商品化的光学生物传 感器可在无标记的情况下实时地进行生物分子间相互作用的研 究，大大推动了分子识别这一学科的发展，已经成为生命科学和 医药研究中的一种手段 1 8 1 。 1s p r 技术的基本原理 1 9 】 当光线自光密介质进入光疏介质发生全反射时，光波的电场 强度在界面处并不立即减小，而是渗入光疏介质中，形成一个随 渗入深度变化且其电场强度呈指数衰减的光波，这就是所谓的消 失波。 如果光疏介质很纯净，不存在对消失波的吸收、散射的物质， 则全反射强度不会被衰减，只是消失波沿光疏介质表面在x 方向 传播一个位移，再返回光密介质。当存在吸收性介质( 比如说金 属) 时，反射光的强度将会降低，这种由于吸收物质对能量的吸 收而导致的能量降低成为衰减全反射( a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n a t r ) 。当消失波与金属薄膜中的自由电子产生的光波发生共振 时，此时，反射光的强度最低，此时入射光线的角度就是我们通 常所说的s p r 角，这就是我们用s p r 技术来进行分析研究的基础 原理。 湘潭大学硕士论文：基于金电极的电化学及鱼些堂璺! 垦生塑堕壁璺 b i a c o r e l o o o 仪器原理示意图 当发生s p r 现象时，光线提供的能量导致金属膜表面电子发 生共振电子吸收该能量使被反射光的能量最小，这种最小化发生 时的入射角度称为s p r 角如上图所示。s p r 角与入射角、金属膜 的厚度、玻璃与金的介电常数、金表面及邻近介质的折射率有关， 金属表面结合生物分子将导致其折射率发生变化，从而引起s p r 角的变化，这一变化又和金属表面结合的生物分子质量成正比， 因此可通过测量s p r 角的变化监测生物分子间相互作用。 从s p r 曲线中，我们可以获得如下信息：哪些分子发生了相 互作用；相互作用的强度；结合和解离的速度；样品中分析物的 浓度；是否存在异构效应；结合位点分析；复合物中不同成分对 结合的影响等。 2s p r 光谱分析技术的特点及应用 1 ) s p r 是一种灵敏的光谱分析技术。由于它响应于两相邻界面膜 的n 、k 和d 值的变化，因此s p r 能够用于检测与膜的性质及其 厚度变化有关的反应过程。 2 ) 在研究生物分子相互作用方面具有其独特的优点：一是可以通 过分子识别反应灵敏的鉴别和测量相应分子的浓度和质量：二是 可以实时、原位的用于反应的动态过程研究，并很方便的求出相 关反应的动力学常数；三是不需要对样品进行标记，可直接测定 样品的浓度。由于s p r 技术具有以上其它技术所无可比拟的优点， 镕潭大学颈土论文；基手金电擞躺电化学爰亳纯举s p r 生超蓬壁爨 s p r 技术在研究生物分子相互作用方面已经成为一种主要的研究 工具，仅在近三年，关手这方嚣熬文献已经凄一子多籀 2 0 - 2 2 。 3 ) s p r 技术很容易和其它技术涟用。自从1 9 8 0 1 2 3 年酋次用于电 化学界筒的表征以来，与电化学技术的连用已经日渐成熟起来， 基蓠已经成为研究嗽化学爨蘑反应的一穆奎要的工具。与质谱技 术的连用在蛋白质豹鉴定、表诬方嚣显示了极大翡优越性，因诧 在蛋白质组的研究中发挥了越来越重要的的作用 2 4 2 6 。 4 ) s p r 可以用来作为流动注射分析，赢效液相色谱的检测器 【2 7 3 锤，簸：近，还有入正在将s p r 技术徽必毛细管电泳的篮测嚣 3 1 】，预计将会发挥其独到的作用。 5 ) s p r 中使用的a u 膜或a g 膜一般为5 0 r i m 左右，本身是一个 良姆麓纳涞界覆。瓣翦，关手s e r s 的裁毽解释，毒入诀荛是纳 米金属界面的一种表面等离予体共振现象 3 2 3 4 ，将s p r 技术与 s e r s 结合起来研究纳米粒子的界面性质和正确的解释表面增强 拉曼现象都具有重要熬意义。 三电化学s p r 技术的研究进展 s p r 是两相界面的一种表两电荷密度波，它致敏予鼹相界面性 矮兹变化。覆电位学反应是一个匿舂的嚣捆赛嚣过程，耀于产生 s p r 的金属a u 膜怒电化学研究中一种常劂的工作电极，因此s p r 技术能够很方便的嗣电化学技术结合起来，用于电化学界面有关 过程的研究。s p r 技术与电化学技术的联耀产生了一种薪的s p r 技寒一憩傀学s p r 技术( 嚣s p 袋) ，s p r 技本与循环饺安法、毫纯 学阻抗法等从不同的角度分析发生在电极表面的及其附近的化学 和物理过程，它在袭征表面的氧化还原过程、单层及双层膜的形 残、物矮沉积帮吸隧、离子的捻测等表露过程方耍懿应用广泛， 这一技术一般是将糟子s p r 分析的传感片上的金膜僚为电化学测 定的工作电极。 塞1 9 8 0 年g o r d o n 等人【2 3 】誊次将s p r 技术应黯予蒜规；薄膜性 湘潭大学硕士论文：基于金电极的电化学及咝兰塑垦皇塑堡壁璺 质的研究以来，s p r 技术在电化学领域的研究得到了较大的发展。 特别是近戴，有关电化学s p r 技术的论文迅速增加，使其成为目 前人们倍受关注的一个热点研究方向。其研究领域主要涉及以下 几个方面： 1 无机、有机薄膜性质的电化学s p r 研究 w e b e r 研究小组【3 5 】近期利用光导纤维s p r 技术表征了电沉积 的普鲁士蓝膜的性质。他们证实，当普鲁士蓝( p b ) 电化学还原 为普鲁士白( p w ) 时，s p r 波长扫描曲线由于膜氧化还原前后介 体性质的改变会发生很大的变化。美国w i s c o n s i n 大学的c o m 等 人 3 6 】将电化学与s p r 技术结合起来，基于交变电场作用下的光 电效应测定了磷酸锆多层膜中的电场分布。g e o r g i a d i s 等人 3 7 1 表明s p r 响应于聚吡咯单层膜的氧化还原转化，并且这种效应还 能够用于监测超薄导电膜的导电性变化。 2 电化学控制生物分子释放的s p r 研究 美国c h i c a g a 大学m r k s i c h 等人 3 8 通过醌丙酸酯将抗生物素 键合在烷基硫醇修饰的a u 电极上，抗生物素与生物素发生特异 性免疫反应。施加0 7v 的电位后，醌发生电化学还原生成氢醌， 并迅速发生内酯化反应，导致生物素分子的释放，通过s p r 现场检 测生物分子的电化学释放过程。 3 电化学s p r 技术用于测定金属离子 双硫腙在络合滴定分析中是一种常用的络合剂，能够用于一 些金属离子的络合滴定分析中。英国l i v e r p o o l 大学的s c h i f f r i n 研 究小组 3 9 】通过化学键合或聚合物包埋等方法将双硫腙或者它的 二羧酸衍生物固定在金电极表面，采用s p r 检测过渡金属离子存 在下双硫腙膜的光学性质变化，进而测定过渡金属离子，研究了 电极电位对测定金属离子时s p r 响应的影响。美国w a s h i n g t o n 大 学c h i n o w s k y 等人 4 0 l 将s p r 与阳极溶出伏安法结合起来，可灵 敏地检测到5 0 0n mp b 2 + 和c 0 2 + 。 湘潭大学硕士论文：基于金电极的电化学盈皇垡聋s p r 生塑堡壁爨 4 电化学过程的s p r 研究 s p r 麓够磅究莱垡电纯学避程翔吸秘脱臻、电极裘嚣的修饰 以及氧化还原等过糨。日本n t t 公司的1 w a s a k i 和n i w a 研究小 组将s p r 与循环伏蜜法结合起来，研究了烷基硫醇单层膜的电化 学脱附【4 l 】、甲基兰的吸射【4 1 】、f e ( c n ) 6 川4 酶氧化还原 竭等 过程。德函s c h l e r e t h 研究小组【4 3 】还采用电化学s p r 技术比较研 究了细胞色素c 、细胞色素c 氧化酶在烷基硫醇修饰的a u 电极 上氧化还原过程。二者具有不闽的a 0 a t e 曲线，表明电化学 s p r 麓够耀手研究酶分子在曦毅表瑟懿吸附麓鬻戳及梅象交纯 等。美国t a o 等人 4 4 1 也证实s p r 光谱技术能够用于氧化还原蛋 白质在电极表面的构象变化及其氧化还原电子传递过程的研究。 此终，s p r 技术在磷究电极表露靛修镣等方覆氇有摄滋 4 5 ，4 6 。 5 电仡举s p r 生物传感器 日本1 w a s a k i 和n i w a 等人 4 7 】将h r p ，o s 川”聚乙烯毗啶的氧 纯还原聚合耪霉定凌a u 电极表菰，基予s p r 对o s 2 + o s 3 + 氧纯还 原导致的膜折射率变化的响应，建立了种新的电化学s p r 生物 传感器。并且通过h r p 和葡萄糖氧化酶的多酶层修饰可提高其灵 敏度 4 8 】。另外，威化所董绍俊研究组 4 9 1 ；e 这方面也佟了大量的 工佟，德稍使焉p a n 膜诈受一辩贪体貘，将h r p 释p a n 阖的纯 学反应信息传导，放大并转化为s p r 光学信号，构筑了一种新的 电化学s p r 传感器。这种方法对发展s p r 生物传感器汗辟了一种 囊熬路线。壶子其它豹氧睨遥驻酶都霹激用终固定纯酶去转缘 p a n 膜，因此这种方法具有一定的通用性。 6 对于电化学掺杂、去掺杂过程的研究 应铯艨董绥俊磅究缀【5 0 穗乎聚苯胺膜在绝缘态秘导电态之 间的氧化短：原转化，伴随着阴离子的迁入和迁出而导致的膜光学 介电性质的变化，这中掺杂去掺杂阴离子的动力学过程能够使用 电化学s p r 技术进行现场原位豹检测。他能第一次将魄化学s p r 湘潭大学硕士论文： 基于金电极的电化学及电化学s p r 生物传感器 技术用于掺杂去掺杂的研究中并且提出这种掺杂去掺杂性质能 够用于发展新的电化学s p r 检测器，用于阴离子的流动注射分析 中。 四本研究的工作背景和研究内容 二十一世纪是生命科学的世纪，生命现象的基础体现于生物 分子之间的相互作用及识别。如何在分子水平上阐明生命活动规 律和生命现象的本质对现存分析方法和技术提出了挑战。而运用 先进的科学技术发展新的分析原理并研究建立有效而实用的原 位、在体、实时、在线和高灵敏度、高选择性的新型动态法检测 将是解决这一问题的关键之一，因而建立在近代电子技术和生物 工程基础上的生物传感器技术取得了快速发展。 本论文在生物传感器发展的基础上，研究了非血红素蛋白一 铁蛋白的直接电化学行为，成功的利用键合固定的方法在金电极 上获得了铁蛋白的电化学信号，并且利用s p r 技术检测了电极过 程，研究了铁的释放和获取机理；提出了一种新的在电极上固定 双酶的方法，并将其成功的用于葡萄糖的检测；制备了个新的 电化学s p r 传感器，为生物传感器的进一步发展，多手段进行表 征，获得更多的动力学和热力学参数奠定了基础。 湘潭太学碛士论文；基于金电撩的电证学爰奄纯攀s p r 生籀转蕊嚣 第一章铁蛋囱在修饰金电极上的赢接电化学研究 1 手l 言 生命伴中约有三分之一的鬣白属于金属蛋白，铁殛自在生物 体中铁代谢超重要作用，它主要是吸收溶液中的二价铁离子，使 之氧佬，京空腔凑以三价铁的形式存在。逛入体缺铁瞻眩蒺，它 则以二价铁的形式重新释放。铁蛋白的分子量约为4 5 0 ，0 0 0 g t o o l 一，点径约为1 2n l n ，其分子内含有2 4 个亚基，玛脾铁蛋白 太部分是蠹。亚基缀成，含有八个亲东遁邋昶六令筑求逶道，铁 离子主要是通过亲承通道送入鬣白腔内酶。由于二徐铁与三价铁 之间的转换是通过电子转移来宪成的，因此，研究铁凝白的电子 转移过稷对于了解铁的代谢以及铁在生物体内的氧化还原机理都 具有重大的意义。 蛋臼质的直接电化学的研究一直是人们广泛关波的热门课 题，它可以在无介体的情况下研究生命物质的电子转移过程，并 先构筑繁三鼗生物传感器提供理论依摇。爨叁凄的准霹逆壹搂电 化学出现于1 9 7 7 年，y e h ；f ek u w a n a 5 1 得到了细胞色索c 在二氧 化锡掺杂的氧化铟电极上良好的循环伏安响应，同时e d d o w e s 和 h i l l 5 2 将4 ，4 - 联毗啶加入细聪色素e 的溶液中，在金电极上也 褥爨了准霹逆酶疆环铰安匿。爨诧鞋后二卡多年懿辩阊里，关予 血红素类蛋白质的童接电化学的研究取得了很大的进展。 r u s l i n g 5 3 等广泛地利用类脂膜的催化作用研究肌红骚臼的电子 转移过稷，其缝麴强究者对辣裰过氧纯物薅1 5 4 ，夔纽蛋鑫【5 5 】 的直接嗽化学行为进行了研究。铁蛋白是一种非血红素类的含铁 蛋白，由丁其分子量大，在电极上很容易变性，使得它的直接电 化学的研究受到了缀大的限制。目兹，有关铁蛋白电他学行为的 研究涟不多见，z a p i e n 等在裸的金电辍【5 6 】和金属氧纯耪电极 【5 7 ，5 8 上均获得了良好的电化学信号。m a r k e n 5 9 等在i t o 电极 上比较了含水三价铁的氧化物纳米粒子的盥接电化学与铁蛋白的 壹接电他学熬异固，t o m i n a g a 等【6 翅裁用d d a b 类嚣鬟膜魏摧纯佟 湘潭大学硕士论文：基于金电极的电化学及电化学s p r 生物传感器 用在热解石墨电极上研究了铁蛋白的电化学行为。本文成功地利 用键合固定的方法在金电极上获得了铁蛋白的电化学信号，并且 利用s p r 技术检测了电极过程，研究了电位调制的铁的释放和获 取机理。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 c m 8 0 0 电化学工作站( 美国c h i 公司) ，荷兰e c oc h e m i eb v 公司的a u | o l a b 电化学表面等离子体共振仪( e s p r ) ，金电极( 直 径为1m m ) ，铂电极及a g a g c l 参比电极为实验室自制。 马脾铁蛋白，n h s 从s i g m a 公司购得，e d c 从p i e r c e 公司购得， 其它试剂均为分析纯，实验所用水为二次蒸馏水，经美国m i l l i p o r e 公司超纯水处理系统得到的超纯水( 1 8 2m q ) 。 2 2 溶液配置 铁蛋白的纯化及保存：将从s i g m a 公司购得马脾铁蛋白溶液用 p h 为7 0 的p b s 缓冲溶液稀释以后，再用n a n o s e p 超滤膜口a l l 公司，可滤掉分子量为1 0 00 0 0 ) 离心过滤纯化，以除去自由的铁离 子和非电活性的生物大分子，放在4 冰箱储存。 磷酸缓冲的配置：p h = 7 0 ，n a 2 h p 0 41 2 h 2 0 ：5 1 6g ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 ：0 8 8g n a c lo 5 8 5g 其它试剂的浓度和溶荆：f e s 0 4 溶液：1 0 “m ，水；巯基丙酸： 5m m ，无水乙醇；n h s ：0 0 0 5m ，水；e d c ：0 2m ，水。 2 3 实验方法 2 3 1s p r 的测定： 将金片依次用无水乙醇，0 1m 硫酸，水清洗，用氮气吹于。 将巯基丙酸组装在处理好的金片上约1 2h ，然后用乙醇，水，缓 冲溶液依次清洗，再注入铁蛋白溶液实时观察其静电吸附过程， 或者是用n h s e d c 活化约1 0m i n ，再注入铁蛋白溶液观察其作 濒潭太学鞭士论文：基于金电轻豹彀纯学建离臻蓑墅罄髦塑壁壁矍 用。 2 3 2 电化学测定： 将直径为1m m 的多晶金电极在使用前依次用1 0 ，o 3 ，0 0 5 转m 熬毽a 1 2 0 3 抛蹩，寅到在1m 硫酸孛褥到稳定豹电优学信号。 将处理好的电极猩巯基丙酸溶液中组装约1 2h ，在2 5m 鲋【x l l 的铁 器宣溶滚中静电吸附约1 2h ，绒者燕赁n h s 餍d c 活纯约1 0m i n 潋 后，再键合固定铁蛋白，将组装好的电极在除氧的空白缓冲溶液 中扫电纯学信号。所使篇的淹常规三电极电化学系统，对电极为 铂片墩极，以下所报导的电位均以a # a g c l 电极作为参比。 2 3 3 铁的释放与获取实验： 在p b 3 缓冲液中，将固定有鬣白的电极在0 4 v 电位下还原 3 0 0s ，然后月缓冲溶液充分瀵洗电极，控制0v 电位在硫酸亚铁溶 液中让其充分氧化3 0m i n ，潜在除氧的缓冲溶液中测其电化学信 号。 3 结果与讨论 3 1 电化学过程研究 3 1 1 铁蛋自在修饰金电极上的直接电纯学 循环扶蜜已经被广泛耀予电极表瑟自组装过程憋表缓图l a 是巯基丙酸单分子层在空白缓冲溶液中的循环伏安圈，从图中可 看出，这种单分子层掺婚静电极不具有电活懿量具有较低的充宅 电流。铁蛋白静电吸附到这种单分子层上以后获得了较好的电化 学响威( 图l c ) ，峰峰电位差约为1 5 0m k 说明这种单分子层可 以缀好的促进铁瑕自在电极上的蛊接电子转移。式电位e ；控必 0 1 9 5v 与文献报道的在i t o 电极上的，0 4 1v 不同 5 7 ，5 8 1 ，这可 戆是滋予褒不羁的电极上，蛋酝的构象不阉所弓| 起的。当建 n h s e d c 淆化这种单分子屡，键含固定铁蛋臼同样得到了较好的 湘潭太学硕士论文：基于金电撒的电让学聂电诧举s p r 生物传撼赫 图la ) 组装巯基丙酸的金电极的循环伏安黼，b ) 用n h s e d c 键 合固定铁蛋白在巯基丙酸单分子层的循环伏安图，c ) 静电吸附铁 蛋基在巯基嚣酸擎分予层鲢循嚣茯安图。溅试条件：p h 先7 0 的 磷酸缓 巾，离子强度为0 1 ，掴速为1 0 0m v s 。 循环伏安信号( 图l b ) ，相比静电吸附，峰峰电位差减小了约3 0 m v , 这说明活化以后能更好促进铁蛋白的直接电子转移，嚣峰电流 降低了约酉分之4 0 ，这与文献报道的纲藏色素c 糯类似泌l 】。 3 1 2 键台固定铁蛋由的电极反成动力学研究 在不同的扫速下得到了如躐2 所示的结果，用氧化峰电流与 扫描速度作图褥鬟了邀好的线佼关系( 图3 ) ，f 值力0 9 9 7 5 ，这说 明此电极反应过程是受表面控制的。 # l 潭太学硬士论文：基于金毫擞的电纯学盈电能掌s p r 生糖健感瓣 图2 键合固定铁蛋囱以后的电极崔不同扫逮下的循环伏安图，从 a - e 依次装：5 0m v , 1 0 0m v , 1 5 0m v , 2 0 0m v , 2 5 0 璎v 测试条谗： p h 为7 0 的磷酸缓冲，离子强度为0 1 图3 扫速与阳极峰电流的关系 根撂l a v i r o n 6 2 理论，黧反痉秘矮豢电极土吸随著符会 l a n g m u i r 吸附等温式时，峰电流与扫描速度有线性关系。郎： i 产n 2 f 2 越1 v 4 r t = n f q v 4 r t( 1 ) 式密q = 罐辩正势峰蘑积( 电鬃) 。式1 ) 说甓，无需懿遂嗽掇表面吸 附量和漱极面积的绝对值，只要测得循环伏安图的峰蕊积即可求 得n 据此求得该反廒体系的电子反应数n 为o 9 6 ，为单电子转移 恳群，当a e 。 2 0 0 m v n 时，根据l a v i r o n 【1 2 】理论，表观魄子传递速 率常数k 。霹由下式诗算： l o g k s _ c t l o g ( 1 - 叻+ ( 1 一a ) l o g a - l o g ( r t n f v ) - e ( 1 一a ) n f e p 2 3 r t ( 2 ) 当v = 5 0m v s 时，麟。哟。1 5 v ( 此对我粕也霹以近似熬躐l a v i r o n 理论来靛计) ，假设伐秀0 5 ，赉戴求得k 为q 。0 1 4 7s 另外从图中还可以看出氧化峰电流远远大于还原峰电流，这 与文献褥到的结果类似 5 6 】，这可能是由予铁蛋白的述原形式的 取彝与氯亿形式的淑翔不同蔼零l 起静 3 2s p r 表征电极过程 表颡等离子傣共振技术( s p r ) 是一种表蘧灵敏的技本，它 l 滟潭犬学硕士论文：罄于盘电擞的电化学强电化学s p r 生物传感器 致敏于两相界面性质的交化。s p r 髓够研究菜些电化学过程翔吸 附脱附、电极表面的修饰戳及氧化t 还原等过程。本文中我们利用 s p r 技术字时表镊了铁蛋自在电极表瑟静吸附过程。圈4 a 楚巯基 雨酸组装禚金片表面戳衙，蛋白质静电吸附剩金片表面酶s p r 实 时检测圈，获圈中可戮羲出，刚翻入簧自溶液时有个比较大熬 信号变纯，这主要是由于溶液折鸯聿率鼢突然变能弓| 起的，螽半段 过稷交纯比较缓慢且随蓑嚣重闻不叛上舞熬，这谈明蛋包正在慢慢 酶吸附到金片表鬣，在佟耀了1 0 0 0 秒以感仍然呈上舞趋势，这可 能是蛋自分子在表西的一个重毅定惫过程。在整个吸附过稷中 s p r 鲍响应信号总共改变? 大约1 5 0 0m d e g ；趣线b 是在巯基嚣酸 单分子层表西用n h s e d c 活化以后，键会固定铁蛋白的s p r 实 对检测图，从图中可以惹出键合固定的爱应速率比较快，反应在 2 0 0 秒内几乎就达到了平衡，从面s p r 信号也越于平德，整个过 程中s p r 的响应信号总共改变了大约9 0 0m d e g ，明显的低于静电 吸附的量，约为静电吸附的6 0 铁蛋自的折射率为1 4 5 1 6 3 ，在我 们的a u t o l a b 仪器中，变化1 3 2m d e g ，相当于表面为1n g m m 2 的组 装密度【6 4 ，由此，可以算出静电吸附的铁蛋白的量为2 5 2 4 p m o l c m 2 ，而键合固定的铁蛋白的虐为1 5 1 p m o l c m 2 根据文献报 道，铁蛋白的分子直径为1 2n l 1 ，如果假设铁蛋白的四级结构为理 想的球形，那么每个铁蛋白分子的理论面积为1 1 x 1 0 - 1 2c m 2 ，描此 可以推算漪铁蛋白分子的理论组装密度为1 5p m o l c m 2 58 】，由此 可以看出，对予键合嘲定的单分子层，接近理论组装密度，我们可以 认为这种固定方法在电极表面很好的形成了一种单分子朦，而静 电吸附的蓬明显眈理论的革分子耀的量多，这可能是由于j 乍特异 性瞬附写l 起的南此，我们可以看磁键合爵定不傻在固定效果上优 子静电吸辅，而且更有剩予进行萃分子层的研究 湘潭大学磺士论定：基于金电撮豹电纯学聂电纯学s p r 生物惜惑器 图4s p r 实时硷溺辫：a 铁蛋爨静电啜醚至l 巯基嚣酸攀分子层 b 铁蛋白键合固定到巯基丙酸单分子层 3 。3 稳定饿的考察 当甏上述键会闲定有铁蛋鑫翡电裰遘褥多匿扫描黻后，峰电流 会逐渐减小，为了考察其原因，我们做了稳定性考察实验 当把静电吸附有铁蛋白的电极插入饱和k c i 溶液中约十分钟 数磊，在空鑫酶缓湾溶滚中羟电位学痿号，死乎蕊察不舞峰电流 的出现，褥插入f e s 0 4 溶液中，也没有峰电流的出现，这是由于在大 的离子强度的溶液中，静电吸附的铁蛋白解吸附的结果当把键合 固定有铁蛋白戆电极援入饱和k c l 溶液孛终分铀欧愆，在空是 的缓冲溶液中扫电俄学信号，也发现不再霄峰电流出现，这与先 前所报道的细胞色素c 的有所不同【6 l 】，为了进一步考察是其原 因，我们将这只电极在- 0 。4v 下让其还原5r a i n ，然后在0v 下， 在硫酸妥镶溶渡孛襞纯终3 0r a i n ，再在缓冲溶液中舞曦纯学信号， 重新获得了良好的循环伏安行为，这说明在电极表面键合固定的 铁蛋白并没有解离掉，电化学行为的失活w 能是由于在高的离子 强度下，缀臼质的构象发生变化，以导致活链中心铁的释放两引起 一墅雾量日4p 湘潭大学硕士埝文： 基于金壤援静电纯学爰瓠纯学s p r 生物转爨嚣 的 另终，当把键台遴