（遗传学专业论文）用于endsout技术靶向突变果蝇neuroligin基因工具果蝇的制备.pdf

中文摘要 中文摘要 论文题目：用于e n d s o u t 技术靶向突变果蝇n e u r o l i g i n 基冈工具果蝇的制备 研究生姓名：陈发定 导师姓名：谢维( 教授) 学校名称：东南人学 突触是利一高度特异化的、非对称性的粘附性细胞间连接。通过大量突触将 单独的神经元连接在一起，组成功能性神经网络，从而进行信息的整理、储存及 提取。神经细胞粘附分子n e u r o l i g i n 可以通过与n e u r e x i n 介导突触的形成、维持 和调节。n e u r o l i g i n 的突变还会导致多种神经发育异常疾病的发生。 为了进一步在体研究n e u r o l i g i n 基因的功能，了解其在果蝇神经发育中的作 用，我们尝试运用e n d s o u t 方法制各果蝇n e u r o l i g i n 基因突变体。n e u r o l i g i n 基 因的5 同源臂和3 同源臂经p c r 从果蝇基因组中扩增出，并同向插入p w 2 5 质粒w h i t e 基因的两侧得到重组质粒p w 2 5 一p i p 2 。经过限制性内切酶及d n a 测 序鉴定表明载体构建成功。利用这一重组质粒，通过果蝇胚胎显微注射制各并得 到了3 个转基因果蝇品系，并经杂交平衡鉴定后均定位于第三号染色体，为进一 步进行定点敲除n e u r o l i g i n 基因奠定了基础。 关键词：n e u r o l i g i n ；突触发育；基因打靶；e n d s - o u t 英文摘要 a b s t r a c t t h e s i st i t l e ：e s t a b l i s h m e n to ft r a n s g e n i cf l i e sf o rg e n et a r g e t i n go fn e u r o l i g i n i nd r o s o p h i l a g r a d u a t es t u d e n tn a m e ：c h e nf a d i n g s u p e r v i s o rn a m e ：x i ew e i ( p r o f e s s o r ) s c h o o ln a m e ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y s y n a p s e s a r es p e c i a l i z e ds i t e so fc e l l c e l lc o n t a c tt h a tm e d i a t et h e t r a n s m i s s i o no fi n f o r m a t i o nb e t w e e nn e u r o n s n e u r o l i g i n sw i t hi t sp a a n e rn e u r e x i n s p l a yv e r yi m p o r t a n tr o l e si nt h ef o r m a t i o n ，m a t u r a t i o na n dr e m o d e l i n go fs y n a p s e w i t ht h e i rs y n a p t i cb i n d i n gp a r t n e r sn e u r o l i g i n sm o d u l a t et h ed e v e l o p m e n to fb o t h e x c i t a t o r ya n di n h i b i t o r ys y n a p s e sa n dc o n t r o lt h eb a l a n c eb e t w e e ne x c i t a t i o na n d i n h i b i t i o n n e u r o l i g i na b n o r m a l i t i e sh a v eb e e ni m p l i c a t e di nt h en e u r o d e v e l o p m e n t a l s y n d r o m e s n u l lm u t a n to f n e u r o l i g i ni nd r o s o p h i l ai si m p e r a t i v et oe l u c i d a t et h ef u n c t i o no f n e u r o l i g i ni nt h ed e v e l o p m e n to fn e u r a ls y s t e m t w oh o m o l o g o u sa r m so fn e u r o l i g i n w e r em a d ew i t hp c ra n dc l o n e di n t op w 2 5t og e tt h ep l a s m i dp w 2 5 一p 1 p 2 ，w h i c h w a si d e n t i f i e dc o r r e c t l yb yd i g e s t i o na n ds e q u e n c i n g b ym i c r o i n j e c t i o nw i t ht h i s p l a s m i d ，t h r e es t o c k so ft r a n s g e n i cf l i e sw e r es e tu p ，a l lo fw h i c hl o c a t ei n t h et h i r d c h r o m o s o m e t h o s et r a n s g e n i cf l i e sw i l lf a c i l i t a t et h ef u t u r ew o r kt om u t a t e n e u r o l i g i ni nd r o s o p h i l a k e yw o r d s ：n e u r o l i g i n ；s y n a p t o g e n e s i s ；g e n et a r g r t i n g ；e n d s o u t 东南大学学位论文独创性声明 本人卢明所卫交的学位论义足我个人在导师指导下进行的研究_ 作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标沣和致谢的地方外。论文中小包含具他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学似或证书而使州过的材料。与我 一同j 二作的同，占对本研究所做的任十f 贡献均已往论文中作了明确的、龅驯并表乐了谢意。 研究生签名： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所，国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：i 壅丝丝量师签名： 绪言 绪 - _ j l - - 目 突触是神经系统中一种非对称的特化的细胞间连接，用于传递具有时空特异 性的信号冲动，主要由囊泡聚集的突触前结构和含有递质受体的突触后结构组 成。在人脑的发育过程中，约1 0 “个神经元生成多至1 0 5 个突触连接在一起构成 一个复杂而精确的神经网络。突触的形成和维持不但足神经系统发育所必需，而 目与高级神经活动，如学习记忆、情绪与行为等密切相关。许多与神经发育有关 的疾病也与突触调制和保持有关。突触的形成并非随意的，其数量和种类都是受 剑精确的调节。突触的发育及其调控一直都是神经生物学研究的重点和热点。近 年来，一些参与此过程的重要蛋白相继得以签定，其中大部分属于称为神经粘附 分子蛋白。这些神经粘附分子不仅是突触稳定的结构组分，同时还参与突触功能 的动态调节。 n e u r o ! i g i n 最初是由l c h t c h e n k ok 等人于1 9 9 5 年发现的，其可以特异性的 与n e u r e x i n s 结合。n e u r o l i g i n 家族蛋白相似性比较高，其结构都含有一个可切 除的出膜信号肽，一个乙酰胆碱酯酶类似结构，一个单跨膜结构及一个较短的 胞内端。n e u r o l i g i n 在生物界中广泛存在，在人和牛，鸡，果蝇及线虫都有表达。 到目前为止已鉴定出人类的n e u r o l i g i n 基因五个，鼠类中则有四个。n e u r o l i g i n 家族蛋白在神经系统都有表达。n e u r o l i g i n 通过其脂酶类似结构域与突触前分子 n e u r e x i n 结合，且这种结合受到了选择性剪切、钙离子、糖基化及寡聚化等因 素的调节。除此之外n e u r o l i g i n 还可以通过胞内p d z 结合结构域与p s d 9 5 结 合，起到募集及组装突触后一些递质受体、信号分子及肌动蛋白骨架的作用。 n e u r o l i g i n 不仅与p s d 9 5 的p d z 相互作用，还能与其它一些分子的p d z 结构 域相互作用。在非神经元细胞中表达n e u r o l i g i n 1 和2 时，可以引起与其接触的 轴突在接触部位产生突触囊泡的聚集，而这些接触位点还具有一些神经元间突 触形态和功能上的一些特点。另外，n e u r o l i g i n 同时直接参与兴奋性和抑制性突 触的发育。n e u r o l i g i n 与不同骨架蛋白的结合调节兴奋性和抑制性突触之间的平 衡。最后，越来越多的证据表明n e u r o l i g i n 基因的突变会引起神经发育异常疾 病，如x 脆性智力发育迟缓症，a s p e r g e r 综合症及孤独症等。 文献综述 文献综述 n e u r o l i g i n 研究进展 大脑的发育和功能行使依赖于神经细胞之间细胞连接的正确形成、维持和调 节。在神经系统发育过程中轴突依据小i 列的信号，吸引的或排斥的，向目标树突 定向性生长。在轴突和树突之问形成的稳定连接构成了功能性突触，一种高度分 化的不对称的神经细胞问特化连接。该连接的突出前结构包括：神经递质释放发 生的活动区，称为活动区细胞基质的细胞骨架蛋白网络以及含有神经递质的突触 小泡群。突触后组分包括：正对活动区的各种神经递质受体集合和骨架蛋白。突 触功能的正常行使需要所有的成分准确的募集和定位。目前，关于突触组装和维 持一个令人信服的模型认为，突触前后膜的嗜异性跨膜蛋白可以在细胞外相互结 合并通过其胞内的结构域募集其他突触相关蛋白。突触的发育及其调控一直都是 神经生物学研究的重点和热点，一些参与此过程的重要蛋白相继得以鉴定，其中 大部分属于称为神经粘附分子蛋白，包括i n t e g r i n 家族、免疫球蛋白超级家族、 c a d h e r i n 超级家族分子以及n e u r e x i n 和n e u r o l i g i n 家族分子等。这些神经粘附分 子不仅是突触稳定的结构组分，同时还参与突触功能的动态调节。 n e u r o l i g i n 及与其相互作用的n e u r e x i n 在突触发育及功能中起着重要作用， 因而这对分子自从被发现以来一直是神经发育生物学研究的热点。n e u r o l i g i n s 最先是作为一n e u r e x i n 的配体而被发现的，他们能介导细胞与细胞之间的粘附。 后续的报道证明n e u r o l i g i n 在体外能诱导突触前的分化并形成新的功能性的突 触。同时n e u r o l i g i n 还能控制兴奋性突触与抑制性突触间比例，并与孤独症等神 经发育性疾病有一定关系。至此，n e u r o l i g i n 及n e u r e x i n 引起了人们的极大兴趣 并在过去的十多年间取得了令人瞩目的成就。这里主要就近年来有关n e u r o l i g i n 的研究结果加以综述。 n e u r o l i g i n 家族蛋白的结构和定位 n e u r o l i g i n 最初是由i c h t c h e n k ok 等人于1 9 9 5 年发现的。他们描述了一种聚 集在突触质膜的神经细胞表面蛋1 1 1 n e u r o l i g i n 1 ，其可以特异性的与1 3 - n e u r e x i n s 结 合，且只与缺少g 结构域中的一段可剪切序列的b u 阳x i n s 相互作用i ij 。该小组 随后用同样的方法鉴定除了另外两个n e u r o l i g i n 家族蛋白：n e u r o l i g i n - 2 和 n e u r o l i g i n 3 【2 】。 ， n e u r o l i g i n 家族蛋白相似性比较高，其结构都含有一个可切除的出膜信号肽， 一个乙酰胆碱酯酶类似结构，一个单跨膜结构及一个较短的胞内端( 图1 ) 。 东南大学硕士学位论文 图1 n e u r o l i g i n 的结构示意图( d e a ne t a l ，2 0 0 6 3 1 ) n e u r o l i g i n 家族蛋白序列相对保守，经序列分析发现其具有5 2 的氨基酸保 守性【2 】。两两比较时同源性基本相同，n e u r o l i g i n - 1 和一2 为5 9 ，n e u r o l i g i n - 1 和 _ 3 为6 6 ，n e u r o l i g i n - 2 和- 3 为5 9 。胞内端相对保守性程度比较低，只有3 l ， 丽跨膜区及胞外端分别是9 1 及5 5 。三者最保守的序列位于脂酶类似结构域， 而最不保守的序列则是脂酶类似结构域与跨膜区之间的连接序列以及胞内端的 些部分。n e u r o l i g i n 蛋白的c 端不保守性可能暗示不同1 鬟2 n e u r o i g i n 分子具有不同 的定位或不同的功能。n e u r o l i g i n 胞外端主要含有一个没有酯酶活性的乙酰胆碱 酯酶类似结构域，该结构域主要参与配体，受体间的相互作用。n e u r o l i g i n 的胞外 端富含半胱氨酸，其在乙酰胆碱酯酶类似结构域内可形成三个通过二硫键形成的 a b 亲水折叠稳定下来的环形结构。所有的n e u r o l i g i n 蛋白在其n 端含有两个保守 的选择性剪切位点，分别成为a 位点和b 位点。这两个剪切位点主要用来调控 n e u r o l i g i n 与n e u r e x i n 的结合和产生不同的n e u r o l i g i n 同源蛋白。 n e u r o l i g i n 在生物界中广泛存在，在人和牛，鸡，果蝇及线虫都有表达。到 目前为止已鉴定出人类的n e u r o l i g i n 基因五个，鼠类中则有四个l l ”】。在新生小 鼠的大脑里，n e u r o l i g i n - l 3 的表达量中等，而n e u m l i g 衲一4 则检测不到。在成年 小鼠中，n e u r o l i g i n 的表达主要以n e u r o l i g i l l 1 3 为主，其表达量是新生小鼠的两 到三倍，而n e u r o l i g i n - - 4 只占大脑n e u r o l i g i n 总量的3 。因此一般的研究主要集中 于n e u r o l i g i n - 1 - - 3 蛋白。n e t t r o l i g i n - 1 3 在新生大鼠脑中低表达，随着发育的进行 其表达量也会平行的增加2 3 倍。原位杂交结果显示，n e u r o l i g i n - l 3 在新生和 成年大鼠脑中共表达在几乎所有的神经丛。随后的研究表明n e u r o l i g i n - 1 只在中枢 神经系统兴奋性突触的突触后膜特异性表达，而n e u r o l i g i n - 2 则主要集中在中枢神 经系统抑制性突触。除此之外，小鼠和人的n e u r o l i g i n - 2 还在胰腺，肺等非神经系 统组织有表达。n e u r o l i g i n - 3 的表达同样也不局限于神经系统。人类的n e u r o l i g i n - 4 表达比较广泛，在心脏，肝脏，骨骼肌，胰腺都有表达，在脑中也有低水平的表 达。n e u r o l i g i n 5 是人类的有一个m l m 甄酊 家族基因，因为它定为于y 染色体通常 被称奠j n e u r o l i g i n _ 4 y l ”。 n e u r o l i g i n 相互作用的分子 n e u r o l i g i n 与n e u r e x i n 的相互作用 过去人们一直认为突触后的n e u r o l i g i n 蛋白只能与突触前的p - n e u r e x i n s 形成 跨突触复合物，而不会与c t - n e u r e x i n s 结合。后续的研究发j j f l a a e u r o l i g i n 同样可以与 2 文献综述 a - n o u r e x i i s 相互作用，而且这种结合是受到n e u r o l i g i n 剪切位点b 和n e u r e x i n 剪切位 点4 的选择性剪切调控的【2 】。b 位点的存在与否是影响n e u r o l i g i n 能否结合 a - n e u r e x i n s 的关键因素，即只有缺少b 位点的n e u r o l i g i n 才能与a - n e u r e x i n s 结合， 而对与p - n e u r e x i n s 的结合基本没有影响。这种特异性的结合对突触的形成有着不 同的影响：只与争n e u r e x i n s 结合的n e u r o l i g i n 主要刺激突触的形成，而同时可以与 旺和8 n e u r e x i n 结合的n e u r o l i g i n 贝u 影响突触的扩张。 图2 n e u r e x i n 及n e u r o l i g i n 相互作用分子示意图( d e a ne ta 1 ，2 0 0 6 1 3 1 ) n e u r o l i g i n 与n e u r e x i n 的相互作用( 图2 ) 除了受选择性剪切影响外，还与钙 离子、糖基化及寡聚化等因素有关。i c h t c h e n k ok 等人1 9 9 5 年发现1 3 - n e u r e x i n 与 n e u r o l i g i n 问的相互作用是钙离子依赖型的，只有在钙离子存在的情况下 n e u r o l i g i n 才与i - n e u r e x i n 结合。进一步的实验证明与钙离子结合的是n e u r o l i g i n j 面 不是b i m u 鳓【i i l 【9 】。这在后来的生物信息学分析中得到了验证，通过蛋白序列对比 和三维结构的比较发现n e u r o l i g i n 蛋白的脂酶类似结构域中存在两个结合钙离子 e f 手形结构域1 1 0 1 。 糖基化是另一个影响n e u r o l i g i n 与n e t t r e x i n 相互作用的因素。n e u r o l i g i n - 1 在胞 外结构域内一共含有5 个可能的n 型糖基化位点，而在跨膜区附近富含丝氨酸和 东卣大学硕士学位论文 苏氨酸的模序内则有o 型糖基化位点1 。实验证明n e u m 垤i n 1 的去糖基化会增 强其与配体n e u r e x i n 的结合能力，而进一步的分析表明第3 0 3 位氨基酸a s n 的n 型 糖基化是影响这种结合能力的主要因素。 蛋白多聚体化也是控$ i j n e u r o l i g i n s 与n e u r e x i n s 结合的因素。乙酰胆碱酯酶的研 究表明脂酶结构类似结构域与蛋白聚体化有关i 1 0 1 。在n e u r o l i g i n 1 ，蛋白多聚体 化有重要作用的脂酶结构类似结构域突变导致n e u r o l i g i n 与n e u r e x i n 结合的丢失。 n e u r o l i g i n 与突触后膜其他蛋白的相互作用 n e u r o l i g i n ，与n e u r e x i n 的相瓦作用是通过其胞外端的脂酶类似结构域完成的， 在细胞内n e u r o l i g i n 贝l j 主要通过其p d z 结合结构域与p s d - 9 5 结合。p s d 一9 5 是突触 后致密物的一个组分，土要包含三个p d z 结构域。l r i em 等人于1 9 9 7 年用完美的 实验证明t n e u r o l i g i n 与p s d 9 5 相互作用1 1 ”。他们首先用酵母双杂交实验证明了 所有的三个n e u r o l i g i n 蛋白都可以与三个p s d - 9 5 家族蛋白结合且只与p d s 一9 5 蛋白 的第三个p d z 结构域结合，并发现t n e u r o l i g i n 蛋白c 末端的最后三个氨基酸对这 种结合形式的重要性。该小组进一步通过亲和层析实验、细胞共转实验和亚细胞 分离实验等说明了这两者的相可= 作用。p s d 一9 5 除了以第三个p d z 结构域与 n e u r o l i g i n 结合外，还通过第一和第二个p d z 结构域分别与n m d a 2 受体和钾离子 通道结合。这样p s d 一9 5 可以作为一种支架分子把一些受体及离子通道募集到突 触后位置。在神经元细胞中过量表达p s d 9 5 能够诱导其他一些支架分子如鸟苷 酸激酶结构域相似分子( g k a p ) 及一些粘附分子如n e u r o l 硒n 的聚集【1 2 ，”，“j 。另 外，过量表达p s d 9 5 会增加a m p a 型谷氨酰氨受体的聚集及活性，同时促进突触 前的成熟【1 5 1 。同样地，在培养的海马神经元里用r n a i 的方法降低p s d 9 5 的表达 量会使a m p a 受体、g k a p 及钾离子通道等在一些兴奋性突触内聚集减少。然而， 当在小鼠中敲除p s d 9 5 后，兴奋性突触的功能及结构形态都是完整的。这种体 外与体内实验的差异可能是由于体内其他含有p d z 的分子的补偿效应引起的。 酵母双杂交实验证明n e u m l i g i n 不仅与p s d 9 5 的p d z 相互作用，还能与其它一 些分子的p d z 结构域相互作用，如s a p l 0 2 、p s d 9 3 、s s c a m 、s h a n k 等，但是 否这些分子都会影响n e u r o l i g i n 在突触上的功能却不是很清楚。n e u r o l i g i n 1 与 s - s c a m 的第一个p d z 结构域相互作用及关系研究得相对比较清楚。最近发现， 是s s c a m 而不是p s d 9 5 能诱导n e u r o l i g i n 1 的突触聚集。但这些结果与其它一些 研究报道是冲突的，以前有人报道同时表达p s d 一9 5 能够增强n e u r o l i g i n 的聚集并 能增进兴奋性突触突触前的末端大小。这需要进一步去研究n e u r o l i g i n 的一些结合 分子在体内的真实作用。 n e u r o l i g i n 的功能研究 神经系统突触的发育是一个非常复杂的过程，轴突的生长锥依据周围环境中 存在的信号沿着一定的路径向靶位点延伸并最终到达正确位置，此后生长锥识别 4 文献综述 正确区域并开始形成突触。到目前为止，人们已经相继鉴定出了一些参与此过程 的分子，其中l a m i n i n1 3 2 ( 一种主要的纤维原细胞生长因子) 和a g r i n 在体外可以 寅接诱导单个神经元的突触前分化，垒r 丁哪种蛋白是主要的诱导者目前还没有相 关研究。与此相反的是，人们没有找到介导中枢神经系统突触发育起始步骤的蛋 白，直到n e u r o l i g i n 功能的初步确定。2 0 0 0 年p e t e rs c h e i f f e l e 等人发现，在非神经 元细胞中表达n e u r o l i g i n i 和一2 时，可以引起与其接触的轴突在接触部位产生突触 囊泡的聚集，而这些接触位点还具有。些神经元问突触形态和功能上的，些特 点，比如在神经细胞与非神经细胞的接触处产牛突触小泡的标记物s y n a p s i n ，而 且这些小泡能以去极化的方式进行胞吞“。这与s y n c a m 体外诱导突触前分化的 现象一致。 以往的研究显示，阳离子物质如合成的由多聚赖氨酸包裹的珠子可以诱导中 枢神经系统轴突突触前结构的发育 1 ”。这种现象可能是因为这些物质通过非特异 的静电相互作用结合并募集带负电荷的分子。一些证据说明，n e u r o l i g i n 在的活性 是特异性相互作用的结果。其细胞外结构带负电，因此没有多价阳离子那样的作 用。更重要的是，我们可以依据乙酰胆碱脂酶和n e u r o l i g i n 间的同源性来解释这种 特异性问题。建模研究提示，这两种蛋白具有非常类似的表面电势 1 8 】。这两者的 相似性还体现在体外支持p c i 2 细胞神经突的向外生长的功能的重复性【1 9 i 。然而， 用小鼠乙酰胆碱脂酶序列替换n e u r o l i g i n 的脂酶结构域会完全废除其诱导突触前 分化的能力。另外，n e u r o l i g i n i g g 可以特异性阻断n e u r o l i g i n 弓l 起的突触小泡聚集 的效应。所有这些数据都说日y j n e u r o l i g i n 诱导突触前发育的能力是分子间特异性作 用的结果而不是非特异的静电的相互作用。进一步研究发现n e u r o l i g i n 蛋白脂酶结 构域中特异的序列对这种活性非常关键，同时这种诱导活性可以被可溶性的 p - n e u r e x i n 所抑制，这种抑制作用同样影响与神经元接触轴突的囊泡聚集“。 n e u r o l i g i n 与n e u r e x i n 的结合可以引起突触前一系列蛋白之间的作用，进而募集突 触囊泡：n e u r e x i n 通过其胞内端直接与突触囊泡蛋1 ；1 s y n a p t o t a g m i n 或c a s k l i n 2 结合。这与c a s k e i n 2 定位在诱导的突触前结果相一致。 最近v a r o q u e a u xf 等的体内实验结果表明，n e u r o l i g i n 影响突触的成熟和大脑 功能的正常行使，而与突触连接的起始形成没有关系i 2 0 。以往的体外实验表明， 表达n e u r o l i g i n 的非神经原细胞可以诱导与之接触的神经细胞轴突的突触形成和 发育。在神经元内提高n e u r o l i g i n l 拘表达会增加突触形成的数目 2 1 , 2 2 , 2 3 ，通过r n a i 降低其表达则会导致突触密度的减少l 驯。在n e u r o l i g i n l 3 三重基因敲除的小鼠 中，总的突触数日没有受到影响，g l u t a m a t e 能突触和g a b a 能突触的数目和比例 变化不大。这种基因敲除小鼠在出生后2 4 小时因为呼吸障碍而死亡。其主要原因 在于，n e u r o l i g i n 功能的丧失在突触前会导致突触小泡装配和释放的异常，在突触 后可能无法正确募集相关的神经递质受体。这样，在小鼠呼吸中枢内，虽然兴奋 东南人学硕士学位论文 性和抑制性神经突触可以萨常的形成，但其功能受到了影响，从而导致小鼠无法 呼吸而死亡。 n e u r o l i g i n 控制兴奋性和突触性突触的比例 中枢神经系统中兴奋和抑制主要南神经递质g l u t a m a t e 和g a b a 分别介导 拉”“。人部分兴奋件突触都足由释放g l u t a m a t e 的轴突末端和含有g l u t a m a t e 受体的 突触后树突生长锥之间形成的。相应地，抑制性突触是正对g a b a 合成酶的 g a b a 受体所在的树突轴+ 卜形成的。一个神经元所接收的兴奋性突触与抑制性突 触的数目比例决定着此神经元的兴奋性以及功能【2 7 1 。然而，触发接触起始位点向 兴奋性或抑制性突触转变以及最终平衡这两种突触的关键冈素才刚刚被发现。第 一个可以解释兴奋性突触如何形成的线索来自于一些鉴定出细胞秸附分子和骨 架蛋白可作为突触形成和神经递质受体聚集调节者的研究。到目前为止一个重要 的发现足证明了细胞黏附分子直接参与了突触分化：n e u r o l i g i n 1 或者s y n c a m i 足以引导突触前成分向连接位点的募集【”娜】。此外，对诸如p s d 9 5 ，s h a n k ，h o m e r 以及其他骨架蛋白表达的研究阐明t g l u t a m a t e 受体聚集和树突生长锥形成的一 些机制堋。 过去的实验表明细胞枯附分子和他们的靶分子参与神经接触的形成。例如， n e u r o l i g i n - 1 是通过诱导其突触前靶分子n e u r e x i n 1 t 3 聚集从而募集神经递质释放 装置的f 2 ”。p r a n g e 等发现在海马神经元过表达n e u r o l i g i n 1 不仅会诱导产生兴奋性 突触同时也会增加抑制性突触的数目和活性，n e u r o l i g i n 同时直接参与兴奋性和抑 制性突触的发育【1 ”。n e u r o l i g i n 家族的其他成员n e u r o l i g i n 2 ，3 ，- 4 对这两种类型的 突触有同样的作用b 4 , 3 0 。b r o s e 和他的同事们发现n e u r o l i g i n 1 表达在兴奋性突触 r h i n e u r o l i g i n 2 则定位于抑制性突触”】。c r a i g 与同事的研究结果显示，突触后膜 的特异性是n e u r o l i g i n 1 和- 2 通过募集不同的受体蛋白来调控的，而这些受体蛋白 可以引起神经递质受体的聚集阎。神经元i 内n e u r o l i g i n 2 的聚集会引起p s d 9 5 和 另外一种仅表达在抑制性突触的骨架蛋i ；l g e p h y r i n 的集合，而n e u r o l i g i n 1 ，3 、 - 4 的聚集只能引起p s d 9 5 的集合。c h i h 等人在神经元中过表达n e u r o l i g i n i 会引起 一些兴奋性突触的突触后蛋白的聚集，比如p s d 9 5 ，h o m e r ，和n m d a 受体m 】。 其他一些实验表a ) n e u r o l i g i n 诱导产生的突触含有n m d a 受体亚单位，而缺乏活 性的a m p a 受体，因此n e u r o l i g i n 只能诱导产生沉默型突触1 2 2 , 2 ”。然而，过表达 n e u r o l i g i n 不会明显改变任何突触后蛋白聚集，包括p s d - 9 5 ，以a m p a 和n m d a 受体亚单位 1 3 捌。这些试验结果的差异可能是检测的发育时期或n e u r o l i g i n 表达的 不同。尽管存在这些异议，报道的研究显示t n e u r o l i g i n 以 & 其配体在完整功能突 触发育中的关键作用。 既然n e u r o l i g i n 同时影响兴奋性和抑制性突触，下面的问题是这些蛋白是如 何控制突触的特异性的。大量的数据显示6 n e u r e x i n 作为突触前信号可以引导接 6 文献综述 触的树突内相关蛋白的聚集。这一过程是通过1 3 n e u r e x i n 诱导- n e u r o l i g i n 聚集完成 的。接着特异蛋白的募集调节连接位点不同递质受体的集合。例如，n e u r o l i g i n 与p s d ，9 5 结合会引起含有符氨酸盐受体的核心复合物进而产生兴奋性突触，而 与其他蛋白结合则会募集抑制性神经递质受体。n e u r o l i g i n 与不同骨架蛋白的结 合调节兴奋性和抑制性突触之间的平横。当p s d 9 5 与n e u r o l i g i n 1 在海马神经元共 表达时，n e u r o l i g i n 1 对抑制性突触的效益消失，而在兴台性连接中聚集增加。另 个有趣的现象是，增j j l l p s d 9 5 的表达水平会引起内源一e i n e u r o l i g i n 2 从抑制性突 触向兴奋性突触转移 。与此敛的是转染p s d 9 5 后细胞的兴奋性突触与抑制 性突触电流比值是增加的1 3 0 1 。而用r n a 干涉方法减少p s d 9 5 的水平则会降低兴 奋性突触与抑制性突触电流比例。c h i h 等人进一步证明了e l 平横是n e u r o l i g i n 控制的。在这一系列的实验中，n e u r o l i g i n 1 3 的内源性表达为r n a 干涉降低， 由此可导致兴奋性和抑制性突触数目的显著减少。当进一步检测电位变化时发 现，n e u r o l i g i n 水平的降低主要减少抑制性突触传递，进而改变兴奋和抑制之间的 平衡。这些实验中，有一点无法解释，为何减少一个n e u r o l i g i n 的表达对突触数日 的影响与同时降低三个蛋白表达时的效果一致。可能的解释是存在补偿机制来抵 消n e u r o l i g i n 的影响。 以上的实验研究为突触发育的调控以及兴奋性和抑制性突触之间的平衡提 供了新的视角( 图3 ) 。正常情况下，n e u r o l i g i n 1 集中于兴奋性突触，而n e u r o l i g i n 2 集中于抑制性突触。n e u r o l i g i n 1 能与p s d 9 5 相互作用，而p s d 9 5 主要位于兴奋 性突触后膜上。n e u r o l i g i n 1 与p s d 9 5 相互作用，能加强n e u r o l i g i n 1 在兴奋性突 触上的聚集，其它一些未知分子能把n e u r o l i g i n 2 募集在抑制性突触上。这些分子 的相对水平控制了一个神经元细胞兴奋性与抑制性突触电流( e i ) 的比例。当 n e u r o l i g i n 的功能缺失时，会同时阻碍兴奋性和抑制性突触的成熟。由于兴奋性突 触上存在其他一些粘附分子可以弥 b n e u r o l i g i n 的功能缺失，因此n e u r o l i g i n 缺失 导致的兴奋性突触的改变远比抑制性突触的改变要少得多。同时，n e u r o l i g i n 的功 能缺失会导致突触前p n e u r e x i n 在突触前的聚集发生改变。以上因素将导致e i 增 强。当增自t l p s d 9 5 的表达量时，兴奋性突触的n e u r o l i g i n 1 的聚集会增加，同时 n e u r o l i g i n 2 也会向兴奋性突触重新分布。这样的结果是兴奋性突触数目增加而抑 制性数目减少，e i 比例向兴奋性方向增加。当p s d 一9 5 的表达量下降时则会出现 相反的情况。 东南大学硕士学位论文 图3 ：n e u r o l i g i n 与n e m e a n 粘附分子控制兴奋性突触与抑制性突触问 比例的机制示意图 ( l e v i n s o na n d e l - h u s s e i n i2 0 0 5 t 3 s 1 ) n e u m l i g i n 家族分子与疾病的关系 孤独症是一种大脑发育性疾病，主要症状包括与社会接触能力缺陷，语言和 非语言交流的严重损伤以及行为动作的程序性反复。目前，孤独症在儿童中的发 病率据估计为千分之一。家族中从新发生疾病的概率是普通人群发病的1 0 0 倍， 男女发病比例为4 ：l ，同卵双生同时发病的概率大约为7 0 到9 0 而在异卵双生 中则接近零，由此可见孤独症是一种遗传性比较强的疾病【3 3 , 3 4 1 。孤独症的神经系 统发育异常是从出生后神经环路行为依赖性的塑造和重建期开始发生的1 3 5 翔l 。相 关实验表明兴奋性突触与抑制性突触间比例的改变与孤独症以及其他神经系统 疾病有一定关系 3 7 1 。这种神经发育的异常符合n e u r o l i g i n 在突触形成和稳定中的 功能。n e u r o l i g i n 家族成员分子及p s d 0 5 对调控兴奋性突触与抑制性突触间比例 的作用为分析大脑中兴奋性突触与抑制性突触间比例的分子机制打下基础【圳。在 脑发育过程中兴奋性突触与抑制性突触问比例变化能导致突触连接和突触功能 & 文献综述 上的异常，会引起严重的神经性损伤。相关研究表明x 染色体上的n e u r o l i g i n - 3 和 - 4 以及y 染色体上的n e u r o l i g i n - 4 y 发生突变时都会引起孤独症，其他一些基因也 与该疾病相关p 9 , 4 0 。此外，p s d 9 5 的异常也与包括孤独症在内的神经系统疾病 3 8 1 。这些研究为阐明神经系统疾病的分予机制提过了新的思路。一般情况卜| ，人 们认为孤独症是由兴奋性与抑制性突触比例增加引起的。正常水平的抑制对大脑 皮层的发育非常关键，而抑制不足则会导致认知活动和运动控制的缺陷以及癫痫 症易感性的增j i 1 3 6 , 4 1 1 。g a b a 介导的递质释放降低与癫痫症相关 4 2 l ，而在孤独症 病人中合成g a b a 的酶g a d 水平也是降低的m i 。事实上，3 0 孤独疗患者都会出 现痉挛的症状1 。孤独症患者同时会表现山树突分支的减少【4 5 1 和树突生k 锥的 异常【3 ”。到目前为止，发现的与孤独症相关的n e u r o l i g i n 的突变形式概括如表。 g 咐埘槲一l 幽h _ h “- # ”d雠n 妇o fi b “i 糟 n 叭船# x p 2 拍d 舷呻la x p 嚣0 如b 佃n 州帅悔 3 m 咖d e l e t t o no f n ” 1 9 3 删 翳舭i r o o f d 饼l n g s i 拄m o w i t h 酬帅钟 印蕾一r 斜f 加n 2 打o t h e m s t o p b e a m t m m m 1 3 铂_ c a n l r = l 对 2 b 擅h e r =r 4 6 l c l n 妇女m 蛔 m e m 竹4 咻t r 韵c k l n g h l 酗箱f 目n i l i 。# i n c l u d m 9 1 3 6 m a l e s w i t h x l i i n l c e d m e t a l 晰幽蝻n 2 s t o p h e r e i m m m 孽 n o ta m d m 7 n i l i t a u n 5 m $ 纽m i i 伯x + l i n k e d f t 吣lr 触t i o n a 哺d 巷p p 嘲x p 矗3 3 呻 z c o n t r o l 曲 n 1 9 3 珊帅 钟 她m 即曲瓣矗抖。脯 帕 r 均o 惜 “i 口桷岍h h d 档呻r o 埘错昭，砷啪e d o r a = h e 囊日e m m m v 哟捌t t w 姆e d o m 日n 拜7 蛳，# 巾幽们t d o r a = 函 n 1 9 3 e 枷8 。嘲一8 4 “帅，3 细咿r 帅嘲博 岫 e 船n 5 树啪，4钟 1 2 w 蚰h i m y 甜删拥j 晰_ 咐 孤独症患者身上所发现的n e u r o l 讶n 相关突变( d e a nc ta 1 ，2 0 0 6 t 3 1 ) 研究表明，n e u r o l 西n - 3 和4 的突变都会引起孤独症1 4 6 。当n e u r o l i g i n 3 中的 a r 9 4 5 l 被替换为c y s ( r 4 5 l c ) 或n e u r o l i g i n - 4 在其3 9 6 ( d 3 9 6 x ) 位氨基酸处有插入突 变导致随后的氨基酸发生移码突变及翻译提前终止时，突变的蛋白会滞留在胞内 而无法跨膜 4 7 , 4 8 , 4 9 , 剐。关于n c u r o l i g i n 4 在孤独症中的作用，另外一个对法国一个 家系遗传分析研究发现，在表现的非x 染色体连锁的智力发育缺陷症状中有的家 族成员表现为孤独症，而有些却不表现孤独症症状【5 1 1 。另外，在四个没有发生孤 独症的病人身上也发现t n e u r o l i g i n - 4 发生了错义突变9 卅。 体外实验表明，n e u r o l i g i n 突变会引起突触在分子水平及细胞水平的功能异 常。在异源细胞中表达这些突变的n e u r o l i g i n 时，其无法正确运输到细胞的表面上， 可能的原因是突变n e u r o l i g i n 分子的折叠发生了改变，从而滞留在胞内1 47 ，5 3 ，5 4 l 。在 海马神经元细胞里表达突变的n e u r o l i g i n 形式，它们既不