（生物物理学专业论文）重组工程菌合成5氨基酮戊酸的限制因子的初步研究.pdf

摘要 5 氨基酮戊酸( 5 - a m i n o l e v u l i n i ca c i d ，a l a ) 在农业生产中具有广泛的应用， 不仅可作为除草剂、杀虫剂，还可提高植物的抗盐、抗冷冻能力，这对于缓解生态环 境恶化，提高农业生产水平具有重要的现实意义。此外，5 一氨基酮戊酸也被广泛用于 肿瘤的诊断及癌症的治疗方面。目前，a l a 的工业化生产主要是利用光合细菌突变株 和大肠杆菌的重组菌表达5 一氨基酮戊酸合酶，该酶在细胞内催化琥珀酰辅酶a 和甘 氨酸缩合成a l a 。a l a 的生物合成受终产物血红素的反馈抑制。本研究中，采用大肠 杆菌重组技术，表达了有活性的酿酒酵母( s a c c h a r o m y e e sc e r e v y s i a e ) 的5 一氨基 酮戊酸合酶，研究重组菌株合成a l a 的能力，并测定胞内和胞外a l a 的产量。初步 分析了影响细胞合成a l a 的一些限制因子，摸索了a l a 的快速纯化方法。结果表明： 1 根据已公布的h e m l 基因的全序列，以酿酒酵母基因组为模板，去除n 端导肽序 列的核苷酸序列，以编码a s h 6 3 为第一个氨基酸残基，上游引物编码的起始氨基 酸为m e t ，设计并合成引物，采用p c r 扩增出个大小约为1 4 1 5k b 的特异 d n a 片段，采用载体p m a l 一2 x ，构建重组a l a s 表达载体p m a l a l a s ，通过酶切验 证初步证明外源基因片段已正确插入载体p m a l 一2 x ，进步测序表明插入的外源 片段同已公布的酿酒酵母h e m l 基因片段的序列完全相同。 2 重组载体和对照分别转化大肠杆菌表达菌株，生长2 4h 的菌落在紫外光下显示 强烈红色荧光，表明有下游的中间物的氧化形式卧啉的积累。携带重组载体的菌 株生长速度落后于对照菌株，可能是积累的卟啉会产生自由基，对细胞膜产生破 坏作用，抑制了细胞的生长。诱导后的大肠杆菌重组菌显示重组蛋白表达为可溶 - 性，s d s p a g e 分析表明a l a s 蛋白亚基分子量约为4 9 k d a 。诱导物i p t g 浓度为0 1 0 m m o l l 时a l a s 酶活达最大。 3 分析了影响a l a 生物合成的一些限制因子。不同的p h 值对重组菌a l a 的合成影 响很大，p h7 0 时酶活最高，而在p h6 5 时a l a 的产量与菌液浓度的比值最大。 添加外源前底物琥珀酸对a l a 产量产生影响且在2 0 m m o l l 时影响最大。添加2 0 m m o l l 的甘氨酸刺激细胞a l a 的合成且产量最高，而浓度高于8 0n n o l l l 的甘氨 酸会抑制菌体生长。 一 4 国产的大孔径树脂纯化a l a 结果表明大孔径树脂i 对a l a 以外的杂物质有吸附作 用，大孔径树脂i i 对a l a 有专一性吸附作用，经过二步层析后得到的a l a 溶液， 冷冻干燥，毛细管电泳分析确定a l a 纯度很高。 综上所述，本文已成功地从酿酒酵母( 国c c h a r o m y c e sc e r e v l s y a e ) 基因组克隆 出编码成熟5 一氨基酮戊酸合酶的基因片段，并构建了高效原核表达载体p m a l a l a s ， 研究了影响细胞a l a 合成的部分限制因子，初步探讨了快速廉价的a l a 纯化方法，这 些结果为重组工程菌合成重要的生物活性物质a l a 奠定了良好的前期基础。 关键词： 5 一氨基酮戊酸，生物合成，影响因予，a l a 纯化 i i a b s t r a c t 5 - a m i n o l e v u l i n i ca c i d ( a l a ) ，a l li n t e r m e d i a t ei nt h eb i o s y n t h e s i so fh e m e s c h l o r o p h y l l sa n dv i t a m i nb 1 2 ，h a sb e e nu s e de x t e n s i v e l ya sas e l e c t i v ea n db i o d e g r a d a b l e h e r b i c i d ea n di n s e c t i c i d ei na g r i c u l t u r e i tc a l li m p r o v et h ec r o p st or e s i s tc o l dt e m p e r a t u r e a n dt o l e r a n ts a l t i na d d i t i o n a l ac a r lb eu s e di nt h ed i a g n o s i so ft u m o ra n dc a n c e r t r e a t m e n t s of a r , t h ea l a p r o d u c t i o nh a sb e e na p p l i e df r o me i t h e rt h em u t a n t so f t h es o m e p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i as p e c i e so rt h ee s c h e r c h i ac o l io v e r e x p r e s s i n g5 - a m i n o l e v u l i n i c a c i ds y n t h a s e ( a l a s ) w h i c hc a t a l y z e st h es u c c i n y l c o aa n dg l y c i n et oc o n d e n s ea l a i n t h eo r g a n i s m s ，t h eb i o s y n t h e s i so fa l aw a si n h i b i t e db yh e m ef e e d b a c k i nt h i ss t u d y , t h e a c t i v ea l a sf r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew a so v e r e x p r e s s e da n dh a dt h ea b i l i t yt o c a t a l y z et h ef o r m a t i o no fa l a t h ec o n t e n t so f a l ai nv i v oa n di n v i t r ow e r ed e t e r m i n e d t h el i m i t i n gf a c t o r so nt h ea l ac o n t e n tc a t a l y z e db yt h er e c o m b i n a n ta l a sw e r e i n v e s t i g a t e dp r e l i m i n a r i l y t h er a p i da l ap u r i f i c a t i o np r o c e d u r ew e r ee s t a b i l i s h e da l l r e s u l t si nt h i sw o r kw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w e d ： 1 t h ep r i m e ra n da n t i s e n s ep r i m e rw e r ed e s i g n e dd e l i b e r a t e l yb a s e do nt h ep u b l i s h e d s e q u e n c eo fh e m lg e n ef r o my e a s t ，w h i c he n c o d e st h ea s s u m e dm a t u r ea l a sf r o m t h ef i r s ta m i n oa c i dr e s i d u ea s n 6 3 t 1 1 cp c rr e a c t i o nw a sp e r f o r m e di n c l u d i n gt h e d e s i g n e dp r i m e r s ，a n dy e a s tg e n o m ea st h et e m p l a t e am a i nb a n da b o u t15 0 0 b pw a s s h o w nb ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h ea m p l i f i e dp c rp r o d u c tw a si n s e r t e di nt h e v e c t o rp m a l 一2 x ，t oy i e l dt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r , n a m e dp m a l - a l a s t h ef r a g m e n ta n di t sc o r r e c ti n s e r t i o nw a sd e t e r m i n e db ys e q u e n c i n g 2 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i da n dt h ec o n t r o lv e c t o ra r et r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i ac o l i e x p r e s s i o n s t r a i n sr e s p e c t i v e l y t h ec o l o n i e sc a r r y i n gt h ec o n s t r u c t e dp l a s m i d d i s p l a y e ds t r o n gr e df l u o r e s c e n tu p o nu vl i g h tr a d i a t i o n d e n o t i n gt h ed o w n s t r e a m o x i d a t i v ei n t e r m e d i a t e sp o r p h y r i n sw e r ea c c u m u l a t e d t h er e t a r d a t i o no fg r o w t hf o r t h es t r a i n se x p r e s s i n gy e a s ta l a sw a so b s e r v e d ，r e s u l t i n gf r o mt h ea c c u m u l a t i n g p o r p h y r i n sw h i c hd e s t r o y e dt h ec e l l sm e m b r a n e sa n dt h u sc a u s e dt h ec e l l sg r o w t h s l o w l y t h em o l e c u l a rw e i g h to fs u b u n i to fs o l u b l ye x p r e s s e dr e c o m b i n a n ta l a sw a s e s t i m a t e da b o u t4 9 k d a a ss h o w nb ys d s - p a g e 1 1 1 eo p t i m u mo fi n d u c e ri p t gf o r m a x i m u ma l a sa c t i v i t yw a s0 1r e t o o l l 3 s e v e r a lf a c t o r sf o rl i m i t i n ga l ab i o s y n t h e s i sf r o mt h er e c o m b i n a n ts t r a i n sw e r e e x a m i n e d t h ep hv a l u ew a sm o s tc o n s i d e r i n gf a c t o rt h a ta f f e c t i n gt h ea l a p r o d u c t i o n a tp h7 0 ，t h ea l a sa c t i v i t yw a s i d e n t i f i e dt om a x i m u m ，a n da tp h6 5 ， i i i t h er a t eo f t h ea l a p r o d u c t i o n - t h eg r o w t ho f r e c o m b i n a n ti ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) w a s u pt om a x i m u m e x o g e n o u sp r e s u b s t r a t es u c c i n a t ei n f l u e n c e dt h ea l a p r o d u c t i o n a n da tt h ec o n c e n t r a t i o no f2 0 m m o l lu pt om a x i m u m t h ea d d i t i o n a lg l y c i n ea tt h e c o n c e t r a t i o no f2 0 m m 0 1 ls t i m u l a t e dt h eb i o s y n t h e s i so fa l a w h e r e a st h a ta t 8 0 m m o l li n h i b i t e dt h ec e l l sg r o w t h 4 t h en a t i o n a l m a d e l a r g e - d i m e n s i o n sr e s i n1w a se f f e c t i v ef o r a b s o r p t i o n f o r p o r p h y r i n se x c e p ta l a ，a n dr e s i n1 1w a ss p e c i f i ca b s o r b e df o ra l a t h ec a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s m e a s u r e m e n t sc o n f i r m e dt h a tt h e h i g hp u r i t y o fa l aa f t e r c o o l i n g d r y i n gw a so b t a i n e dt h r o u g ht h et w o s t e pp u r i f i c a t i o n t os u m m a r i z e ，t h ep a p e rr e p o r t e dt h er e s e a r c ho nt h ec l o n eo fh e m lg e n ef r o m s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ee n c o d i n g5 - a m i n o l e v u l i n i ca c i ds y n t h a s e ，t h ec o n s t r u c t i o no f e x p r e s s i o nv e c t o ra n do p t i m i z e ds o m el i m i t i n gf a c t o r sf o ra l ap r o d u c t i o n ，a n dt h e e s t a b l i s h m e n tf o rr a p i da n dc h e a pa l a p u r i f i c a t i o n a l lr e s u l t sp r o v i d e dt h eb a s i sf o rt h e f u r t h e ri n d u s t r i a la l a p r o d u c t i o n k e y w o r d s ：5 - a m i n o l e v u l i n a t es y n t h a s e ，b i o s y n t h e s i s ，l i m i t i n gf a c t o r s ，a l ap u r i f i c a t i o n i v 。 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：乌僻熊l 一 时间：州年月眵日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可咀用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 鸹啦物 时间：p 年f 月1 8 日 导师签名 时间：俨年6 月l g 日 文献综述 1a l a 的生物合成及其调控 5 - 氨基酮戊酸( 5 - a m i n o l e v u l i n i ca c i d ，a l a ) 是一种含氧和氮的碳氢化合 物，分子式为c 5 0 3 n h 6 ( 图1 ) ，广泛存在于细菌、真菌、动物及植物的活细胞中。 绿色植物中a l a 的生物合成在质体中”，并在此转化成叶绿素和亚铁血红索；细 菌、真菌及动物a l a 的生物合成在线粒体内膜上【1 1 ，也在此转化成卟啉化合物。 e 0 2 c 卜嚣c 舶 a c 酿y i - c , o a 硼 g h $ 韩 g l w , | t i e 图15 一氪基酮戊酸的生物台成和转化 f i g tb i o s y n t h e s isa n dt r a n s f o r m a t j o no f5 一a m i n o i o v u ih a t e a l a 是四吡咯类化合物( 血红素、叶绿素和维生素b 1 2 等) 生物合成的第一 个共有前体，它的生物合成是个限速步骤，受最终产物的反馈调节1 1 。不同的 生物中，a l a 的生物合成存在两条途径：一种途径称之s h e m i n 途径，又为c 4 途径，由琥珀酰c o a 和甘氨酸在5 - 氨基酮戊酸合酶( 5 一a m i n o l e v u l i n i ca c i ds y n t h a s e ， a l a s ) 催化下缩合成一分子a l a l 3 1 。c 4 途径在旺家族细菌、真菌和哺乳动物 中发现。另一条途径是c 5 途径，a l a 来源于谷氨酸完整的碳骨架，经由三步酶 促反应合成，首先，在a t p 和m 9 2 + 存在条件下，由谷氨酸t r n a 合成酶( g l u r s ) 催化，将谷氨酸和t r n a e “连接起来，形成谷氨酸- t r n a 然后，以n a d p h 为氢 蔷 h 茁 惭鼢蝣 一 | 星晰 i l l+一一 黼 一 护 一 一 供体，由谷氨酸t r n a 还原酶( g i u t r ) 催化，将激活的谷氨酸还原成谷氨酸1 半醛( g s a ) ，同时释放出t r n a “：最后，在谷氨酸1 半醛一2 ，1 一氨基转移酶 ( g s a a m ) 作用下，将谷氨酸c 2 氨基异构成c 1 一氨基便生成5 氨基酮戊酸【4 ，5 1 ， 该途径主要存在于植物和绝大部分细菌中。( 图1 ) 细胞的a l a 合成量受所合成的a l a 的反馈调节，该反应是四吡咯合成的限 速步骤。添加外源a l a 打破此“瓶颈”限制，从而提高细胞的四吡咯合成【6 1 ，并可 通过提高细胞色素含量而促进异生素的降解f 7 】。酮戊酸( l a ) 是5 氨基酮戊酸脱 水酶( a l a d ) 的专一性抑制剂，可提高藻类和兼性厌氧细菌a l a 的产量【8 1 ，因 为它降低了a l a d 的活性，从而抑制了细胞色素。血红素的合成。藻类能够合成 大量的叶绿素和血红素，早期利用l a 抑制a l a 的转化的原理，用于a l a 的生 产刚0 1 ，然而，l a 浓度过高完全抑制血红素的生物合成，从而破坏了细胞活性。 因此，这种a l a 生产方法存在一定的技术缺陷。 2a l a 的生物活性 2 1a l a 在农业上的应用 2 1 1 可生物降解的光动力除草剂 a l a 是一种它感生物物质，具有光活化除草活性i l ，是近来国际上研究开发 的一种新型光活化农药，它可选择性地杀除农田杂草，被认为是在农药研究方面 的一项重大突破。其作用机制如下：植物吸收a l a 后，黑暗中将其转化为光毒 性前体原卟啉i x ( p p i x ) 1 2 l ，这些前体具有光敏化特性，在阳光激活下，激发态的 敏化剂分子与分子氧作用，产生光敏化氧化过程( 图2 ) 。氧化细胞膜磷脂，从而 使细胞质漏出体外，植物枯死。a l a 仅对双子叶杂草有良好的杀除效果，对单子 叶植物几乎无效【1 3 】。不同植物生长合成叶绿素途径不同，在其生物合成途径中生 成化学中间体有酸式的、完全酯化物、或丁二烯、单乙烯等【h 】。由于植物种类不 同，可分为在黑暗中优先进行的途径和光照下进行的多种途径，所以a l a 对于 单、双子叶植物表现出不同的效果，是一种具有高选择性的除草剂。 a l a l 咖( 被植物吸收) 一 a l a 单线态或三线态 0 2 1 0 2 ( 单氧态) ( 敏化剂)f l 底物( 组织分子) 氧化产物 图25 - 氨基酮戊酸在体内的毒性机理 f i g u r a2t h ef o x i cr t l e c h a n is mo f5 一a m i n o l e v u ii n a t ei nv iv o 2 1 2 植物生长促进荆 a l a 对植物的许多生理过程有较显著的调节作用：较低浓度的a l a 可促进叶绿 素的合成和作物的生长i l ”。已有报道显示，a l a 处理能促进螺旋藻( s p i r u l i n ap l a t e n s i s ) 藻青蛋白与叶绿素合成，导致光系统i ( p s i ) 与光系统i i ( p s i i ) 活性与细胞放氧活性 的提高，促进细胞生长【1 6 。由于越a 是叶绿素生物合成的关键前体【1 7 1 ，故外源a l a 处 理会促进植物叶绿素合成。h o t t a 等【l q 提出，a l a 还具有调节叶绿素合成的作用。 t a n a k a 等【j9 】提出，a l a 处理可诱导产生充足的叶绿素a ，因而有利于转化成叶绿素b ， 后者与光系统捕光叶绿素a b 蛋白质复合体( l h c i i ) 脱辅基蛋白结合，可以避开水解 酶的影响而起到稳定蛋白结构的作用。全光照条件下，f 氐浓度a l a 处理可以明显提高 萝h 、菜豆、大麦、马铃薯和大蒜等作物产量，其中萝h 产量提高可能与a l a 促进光 合作用、降低暗呼吸有关 2 0 , 2 1 1 。 2 1 3 抗盐，抗冷冻能力 全世界，由于土壤中盐的积累，大量的农田沙漠化。人们发现a l a 能增加棉花 的抗盐能力2 2 1 。用3 0 1 0 0 m e j la l a 处理棉花种子，能在含有1 5 ( w w ) 氯化钠的土 壤中生长，a l a 抑制植株吸收钠离子。有研究表明，低温胁迫抑制玉米和松树叶片内源 a l a 生物合成 2 3 , 2 4 1 ，而外源a l a 处理可以提高水稻幼苗抗冷性【2 5 2 6 1 。另外，0 1 1 0 m g 1 a l a 能使水稻植株在5 c 的存活率达4 0 5 0 。细胞里积累的类似多聚糖复合物通过 提高光和作用保护植物【2 l 】 2 1 4 a l a 在农业上其它的应用 目前还发现a l a 能促进苹果果实着龟，降低硝酸盐含量提高蔬菜的质量，使草 坪保持绿色等口“。 2 2a l a 在医药上的应用 2 2 1 诊断重金属离子中毒 在许多病理情况下，检测尿中a 【a 和胆色素原( p b g ) 的含量是非常重要的。 a l a d 的活性受到重金属离子如c d 2 + 、c u 2 + 、p b 2 + 、h 9 2 + 、a g + 口0 】等的抑制，导 致血液和尿中a l a 含量增加；而患有急性卟啉症的病人尿中a l a 和p b g 的含量都 增加。那么同时检测尿中a l a 和p b g 的含量就能区分重金属离子中毒和急性卟啉症 2 7 】 2 2 2 光动力疗法治疗癌症 k e n r l e d y 等 2 8 2 9 1 提出a l a 通过光动力疗法( p d t ) 治疗癌症。他用含有a l a 的 护肤霜涂抹皮肤癌患处，然后用激光照射数小时，3 4 小时后p p i x 产生的单线态氧 杀死癌细胞。产生单线态氧的机理与作用于植物相似【2 l 】。用这种方法能够治疗8 6 的皮肤癌( 皮肤原位癌) 。人们知道血卟啉衍生物( h p d ) 【3 0 j 经常用作光动力治疗， 血卟啉是血红素合成过程中间产物，研究发现，外源性血卟啉能在肿瘤组织中明显滞 留和富集，而正常组织中则不会出现这种情况。单独使用血卟啉对癌细胞没有致死 作用，而超声激活血卟啉则能杀伤多种癌细胞。然而癌细胞积累血卟啉的量有所不同。 血卟啉在癌细胞上积累需要一定的时间，而p p i x 积累很快，因此，血卟啉的副作用， 如光损伤，成为光动力疗法的一个严重问题，通过应用a l a 能够避免上述问题。光 动力疗法不仅应用于皮肤癌，还应用于口腔癌，食道癌，结肠癌，十二指肠癌，胰腺 癌，膀胱癌【1 4 j 2 2 3 光动力诊断 在外科手术上，k a n e k o k 等应用a l a 光动力诊断神经胶质瘤( 脑瘤) 。p p i x 主要积累在肿瘤细胞上，正常的细胞并不积累p p i x 。在3 9 5 4 1 5 n m 紫蓝光的照射下， 通过p p i x 发出的红色荧光探测神经胶质瘤，因此应用于外科手术。 2 2 4 医药上的其它应用 a l a 也用于恢复头发生长阻止头发脱落【3 2 】，霉菌病的治疗，肽酶的抑制，风湿性 关节炎的治疗，护肤( 阻止紫外线穿透皮肤) 掣3 3 。 3a l a 的工业化生产 由于a l a 化学合成过程很复杂，产量低，费用高，从而限制了它的广泛应用 口4 ，3 ”，生物合成毫无疑问是更佳的途径。自然界中，许多生物可以合成a l a 。 然而，尽管动物和植物可以产生a l a ，但产量甚微3 6 1 。相对来说微生物可以合 成相对大量的a l a t 3 7 】( 见表1 ) ，但产量仍然较低，不适于工业生产。 表1 微生物生产5 一氪基酮戊酸 t a b i e15 一a m i n o i e v u li n a t ea e i d ( a l k ) p r o d u c t i o nb vs 伽em l c r o o r g a n is m s 目前，a l a 的工业化生产主要是利用光合细菌突变株和大肠杆菌的重组菌。 然而，利用光合细菌生产a l a 需要光照，不仅光照费用高而且需要特殊的光照 反应系统冈。国外研究者已将代谢途径工程和基因工程技术应用于址a 生产的 研究。c h e n 瑚等通过a l a 合酶基因h e m l 在大肠杆菌上表达，获得高浓度a l a ； m a r i e t 和z e i k u s 将编码a l a 合酶基因通过p u c l 8 1 9 载体转化ec o l i 获得重组 菌株4 0 1 ，实验发现其胞外a l a 浓度高达3 0m m o l l 。由此可见，应用基因工程 方法，获得高产菌株将是今后的研究方向。 引言 随着人们的环保意识逐渐加强，对农产品的安全要求越来越高，而农产品中农药 及除草剂的残留量过高，是制约我国发展高效优质农业的一个瓶颈。大量使用农药和 除草剂，不仅污染粮食，而且也污染环境，危害人们的健康和生命。 近几年来，科学家们试图从天然的植物中提取易于分解的无公害农药，但是，它 们的生产是以牺牲其它植物为基础的，因而限制了生产规模。这些农药产品是天然有 机小分子，在植物中的含量很低，提取它们须消耗大量植物原料。而市场化的天然除 草剂极少，目前普遍使用的除草剂依然是人工合成的，这不免会造成环境污染。 在所有生物中，含有一种非蛋白氨基酸，即5 一氨基酮戊酸，它是血红素、叶绿素、 维生素b 】2 生物合成的前体【3 6 ，最近人们发现a l a 不但可以作为无公害的天然杀虫 剂、除草剂和植物生长促进荆 4 0 l ，而且能提高植物对盐害和冻害的抵抗力，此外，它 还是抗微生物药物和治疗癌症的药物【3 9 舯】对它的深入研究正日益受到重视。目前， 生产a l a 的工程菌都是重组表达不同物种的地s ，然后再用其后的酶的代谢突变 株，或者用l a 抑制a l a s 的下一个酶a l a d 的活性，促进a l a 积累。已经有利用 微生物如光合细菌、藻类、厌氧菌和需氧菌作为工程菌生产a l a 的报道，但产量目 前报道仍然不高，目前报道最高产量达到每升菌液中可产出5 - 2 克a l a l 6 5 ，己基本 达到工业生产要求的最低产量。然而，生物上应用的a l a 都是化学上合成的，合成 a l a 的成本远高于利用工程菌生产，而且a l a 的工程菌生产和使用都是环保的【3 9 1 ， 它在农业上的应用具有巨大的经济和社会效益，因此，对a l a 工业化生产的研究具 有重要的理论和实践意义。 本实验研究目的与意义： 5 。氨基酮戊酸作为一种新发现的生物活性小分子，参与某些基因的表达调控，在 农业和医药方面具有广泛的应用1 3 9 】，在农作物的生长、发育和抗逆性方面都有作用， 是一个多效型功能化合物，由于它是血红索生物合成的前体，易于被其它微生物降解， 对环境无任何污染。目前，仅有日本实现a l a 的工业化生产，本研究试图利用重组 菌研究细胞a l a 合成的限制因子，并建立a l a 快速纯化的方法，这些研究为a l a 的工业化生产奠定了前期基础。 本实验研究内容： 一 1 1 构建5 - 氨基酮戊酸合酶( a l a s ) 基因的大肠杆菌表达载体，转化到大肠杆菌表 达菌株中。 2 1 通过s d s p a g e 电泳分析a l a s 的表达情况，并分析其酶活。 3 ) 研究影响a l a 产量的部分因素。 4 ) 摸索a l a 纯化的方法。 5 ) 毛细管电泳分析a l a 的纯度。 技术路线： a l a s ( h e m l ) 基因的p c r 扩增 p c r 产物的酶切与纯化载体质粒d n a 的酶切 ii 丁一 d n a 片段的连接 0 连接产物转化大肠杆菌 上 厂 含重组质粒的阳性菌落检测、酶切验证转化菌株的筛选 0 测序、比对诱导表达 s d s p a g e 分析酶活测定 l 研究影响a l a 气量的部分因素 大孔径树脂纯化a l a 毛细管电泳分析a l a 的纯度 7 材料和方法 1 材料 1 1 菌株来源：质粒转化受体菌株ec o l id h5 a ，表达菌株ec o l ib l 2 1 ( o e 3 ) 购自 t a k a r a 大连宝生物有限公司。 1 2 质粒来源：表达载体p e t - 2 8 a ，美国n o v a g e n 公司，p m a l - 2 x 购自n e we n g l a n d 公司。 1 3 基因来源：酿酒酵母m 7 菌株( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 由本实验室保存。 2 仪器设备和试剂 2 1 主要仪器设备 s c s 一2 4 稳控摇床( 国产) 、h e m a t g l 1 6 h 小型高速离心机( 国产) 、日立l c j 一6 4 0 1 高速冷冻离心机( 日本) 、w h a t m a n b i o m e t r a 9 6 p c r 扩增仪( 德国) 、k o d a r k 凝胶成 像系统( 日本) ，g r a n t 恒温水浴锅( 国产) ，制冰机( s a n y o ) ，常温冰箱，一2 04 c 低温 冰箱( s a n y o ) ，一7 04 c 超低温冰箱( s a n y o ) ，琼脂糖凝胶电泳仪，琼脂糖凝胶电泳槽， 手提式紫外检测仪( 北京六一厂) ，蛋白质电泳装置( b i o r a d 公司产品) ，高压灭菌锅 ( h i r a y a m a ) 、超净工作台，i - l i t e c h2 0 0 1 紫外可见分光光度计( 日本) ，新芝j y 9 2 i i 型超声波细胞粉碎机 国产) ，微量进样器( o 5 0 ul ，国产) ，b 1 蠕动泵( 国产) ， f d 1 冷冻干燥机( 国产) ，b e c k m a np a c e r m m d qc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s s y s t e m ( 美国) 。 2 2 主要试剂 限制性内切酶n d ei 、b a m hi 和t 4 d n a 连接酶购自t a k a r a 公司，d n a 胶回收试 剂盒为华舜公司产品，所用引物和标准分子量蛋白是上海生工公司产品，基因序列的 测定由南京生兴技术公司完成，蛋白裂解液为p i e r c e 公司产品，蛋白纯化试剂盒购自 q i a g e n 公司，琥珀酰一c o a 购自s i g m a 公司，异丙基硫代一b d 一半乳糖苷( i p t g ) 购 自p r o m e g a 公司，大孔径树脂i 和i i 为国产，5 氨基酮戊酸购自f l u k a 公司，其它试 剂为国产分析纯。 3 方法 3 1 酿酒酵母( s a a a h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 基因组d n a 的提取 酿酒酵母基因组d n a 的小量制各，参见精编分子生物学实验指南 4 3 略做修 改，具体步骤如下： 1 1 培养5m l 的酵母培养物至饱和状态，u 取1 5m l 的培养物1 2 ，0 0 0r p m 离心2m i n 。 沉淀物加入5 6 7l a l 的t e 缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。 2 ) 加入3 0 “l1 0 的s d s 和3 肛l2 0m g m l 的蛋白酶k ，混匀，于3 7 水浴1h 。加 入1 0 0 i x l5 m o l 1 n a c l ，充分混匀，再加入8 0u l c t a b n a c i 溶液，混匀，于6 5 水浴1 0 m i n 。 3 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( v 2 4 ：1 ) ，混匀，离心4 5m i n 。将上清液转入一 个新1 5m le p p e n d o r f 管中，如果难离心移出上清，先用牙签除去界面物质。 4 ) 加入等体积的酚氯仿异戊醇( v 、，2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀，1 2 ，0 0 0r p m 离心5r a i n ， 将上清液转入一只新的1 5m le p p e n d o r f 管中。 5 ) 加入0 6 体积异丙醇，轻轻混合或稍加离心直到d n a 沉淀下来，移去上清，用 1 m l 的7 0 乙醇( v ，v ) 中洗涤。 6 ) 1 2 ，0 0 0r p m 离心5m i n ，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于1 0 0 肛l 的t e 缓冲液， 每次酶切反应用1 0 1 5u l 。 3 ，2h e m l 基因的p o r 扩增 3 2 1 引物设计 以酿酒酵母的基因组d n a 为模板，p c r 扩增编码成熟a l a s 基因片段，根据已 发表的h e m l 基因的全序列m 】，去除n 端导肽序列的核苷酸序列，以编码a s n 6 3 为第 一个氨基酸的基因序列，设计并合成引物，上游引物编码的起始氨基酸为m e t ，上游 引物5 - c t gc a g 丝三丛鱼a a cc a t t c ca c c c a gg a g - 3 ( 下划线为n d ei 酶切 位点) 和下游引物5 - g c a 堡鱼! r r a c t g c t t g a t a c c a c t a g 3 ( 下划线为 b a m h i 酶切位点) 3 2 2 h e m l 基因的p c r 扩增的反应体系、反应条件及凝胶电泳分析 p c r 扩增反应体系如表所示。扩增后产物在1 2 琼脂糖凝胶上电泳，上样量为5 1 ，电泳结果由k o d a r k 凝胶成像系统拍照记录分析。 袭2p o r 扩增反应体系( 5 0ui ) t a b i e2p c ra m d i i f i e a t i o nr e a o t i o ns y s t e m ( 5 0pi ) d d h 2 0 1 0 p y r o b e s t b u f f e r d n t p s ( 2 5 m m ) 5 p r i m e r 3 p r i m e r d n a t e m p l a t e p y r o b e s td n a p o l y m e r a s e 4 16p l 5 i t l 0 4 p l 0 8u i o 8 g l 1 p 1 0 4m p c r 扩增参数为9 4 1 0 m i n ；9 4 lm i l l ，5 5 1m i n , 7 2 2m i n ，循环3 0 次，7 2 保温1 0m i n 3 2 3 p c r 扩增片段的纯化 p c r 扩增片段的纯化步骤如下： 1 1 将待分离的d n a 样品( p c r 扩增产物) 上样完全，1 2 琼脂糖凝胶电泳，在手提 式紫外检测仪下，用手术刀切下含所需d n a 片段的琼脂糖块，使其尽可能小， 放入干净的1 5m le p p e n d o r f 管中。 2 ) 按每1 0 0 m g 琼脂糖加入3 0 0 ms 1 溶液的比例加入s l 溶液，置于5 0 水浴1 0 m i n ， 每2r a i n 颠倒混匀一次，使琼脂糖块完全溶化。 3 ) 将溶化的a g r o s e 液移入吸附柱，1 2 ，0 0 0r p m 离心3 0s ，倒掉收集管中液体再将 吸附柱装入收集管。 4 ) 在吸附柱中加入5 0 0p lw 1 溶液，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 5s 。倒掉收集管液体，将吸附 柱放入收集管。( 如果室温低于2 0 ，离心前先静置1m i n ) 5 ) 在吸附柱中加入5 0 0i t lw 1 溶液，静置1m i n ，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 5s 。倒掉收集管 液体，将吸附柱放入收集管。 6 ) 离心1m i n 。 7 ) 将吸附柱放入干净的1 5n l l 的离心管中，在吸附膜中央加入3 0 “lt l 溶液，静置1 m i n ，离心、lm i n 。将离心管置于2 0 保存备用 3 3 表达载体p e t 2 8 a a l a s 的构建 3 3 1p c r 纯化产物与p e t 2 8 a 质粒的酶切。 将p c r 纯化产物和p e t 2 8 a 分别用n d ei 和b a m hi 双酶切，酶切反应体系为3 0 斗1 ，如表2 所示。3 7 水浴反应2 4h ，在1 2 琼脂糖凝胶上电泳分离酶切片段， 使用胶回收试剂盒回收酶切片段。 表3p c r 纯化产物( 帅，) 与p e t 2 8 a 质粒双酶切( n d e l b a , d - i i ) 反应体系 t a b i e3h e m la n dp e t 2 8 ad i g e s t e db yn d o a n db a , _ h 1 r e s p e c t iv e l y 3 3 一h e a l ( n d ef b a m h i ) 与p e t 2 8 a ( n d ef b a m hi ) 的酶切片段的连接 将纯化的h e m l ( n d ei b a m hi ) 与p e t 2 8 a ( n d eu b a m hi ) 的大片段连接，构建 编码成熟a l a s 基因的表达质粒，命名为p e t 2 8 a - a l a s 。连接液在4 反应过夜， 连接反应体系如表3 1 0 表4p e t 2 8 a ( n d ei b a hi ) 与h e m l ( n d ei b a e