电子传递链与氧化磷酸化s.ppt

1,LW-1,电子传递链与氧化磷酸化,线粒体中的电子转移反应,ATP合成(氧化磷酸化偶联),氧化磷酸化的调节,ATPsynthase,2,氧化磷酸化是好氧生物产能代谢的最终步骤,所有营养物的氧化分解都汇聚到这一细胞呼吸的最后阶段：用NADH/FADH2提供的e将O2还原成H2O，并由氧化能驱动ATP的合成,线粒体是真核生物进行氧化磷酸化的细胞器,-内膜对大多数代谢物(包括H+)都不通透，需经由特殊载体转运,-呼吸链各组分和ATP合酶均分布在内膜上,氧化磷酸化机制的解释主要基于化学渗透假说,伴随e传递形成的H+跨膜梯度是所有生物氧化反应中所获能量的储库(PeterMitchell,1961),LW-2,3,ElectrontransportandATPgeneration:overview,-沿内膜结合的载体链传递e流-放能性的e流与吸能性的H+跨膜转运偶联-H+顺梯度的跨膜回流提供自由能合成ATP,P34-2,氧化磷酸化=e传递与ATP合成偶联,Matrix,(cf.p324),4,-外膜对小分子和离子通透(膜孔蛋白跨膜通道)-内膜不通透(包括H+)含有e传递链组分和ATP合酶-丙酮酸等中间代谢物可经由特殊载体进入基质继续氧化(TAC)-ATP被转运到胞液时ADP和Pi同时进入基质,19-1,氧化磷酸化组分,线粒体生化反应结构模式,膜孔蛋白通道,嵴,1.线粒体中的电子转移反应,5,电子被汇集于通用电子受体-烟酰胺核苷酸NAD(P)+(H)-黄素核苷酸FMN/FAD(12e),t19-1,(usu.asereceptorincatabolism),(usu.asedonorinanabolism),自学,6,电子载体大多是具有辅因子的整合蛋白，能够接受或给出12e：-e直接转移(eg.Fe3+Fe2+)-以H(H+e)形式转移-以H形式转移还原当量在氧-还反应中转移的单电子当量其他具有电子传递功能的分子(cf.p330)-Fe-S蛋白(iron-sulfurproteins)-泛醌(ubiquinone,Q/CoQ)-细胞色素(cytochromes,Cyt.),LW-3,电子流经一系列膜结合的载体传递,7,铁-硫蛋白的Fe-S中心,2Fe-2S型,4Fe-4S型,参与单电子转移：Fe-S簇中只有1个Fe被氧化或还原,蓝细菌Anabaena7120的铁氧还蛋白为2Fe-2S型,19-5(3rd),仅指无机S,自学,8,-完全还原需要2H，经由半醌基中间物形式以两步反应完成-质体醌(叶绿体)和甲基萘醌(细菌)也具有类似的在膜结合e传递链中携带e的功能-为脂溶性小分子，能在线粒体内膜的脂双层中自由扩散，从而在内膜上其他移动性较低的e载体间传递还原当量-既能携带e也能携带H+，在e流和H+移动的偶联中具有关键作用,泛醌(Q/CoQ),19-2,泛醌,半醌(自由基),泛醇,=带有长异戊二烯侧链的苯醌,自学,9,细胞色素类辅基(Cyt),-铁原卟啉存在于Cytb类，包括Hb和Mb,-Cyta类的血红素A具有一个连接于五元环的类异戊二烯长链,-血红素C通过硫醚键共价结合于Cytc类的两个Cys残基上,19-3,吡咯环,-由4个五元含氮吡咯环组成(卟啉)，4N均以配位键与中心的Fe(Fe2+/Fe3+)连接,自学,10,19-4,还原态细胞色素(Fe2+)都具有三条可见光吸收带，其中波长最长的带分别约为：-cyta:600nm-cytb:560nm-cytc:550nm,Cyt的可见光吸收均与其卟啉环的共轭双键系统有关,自学,11,确定电子载体顺序的一般方法,-测定各载体的Eo-测定各载体被氧化的速率-测定各载体的氧-还状态,呼吸链及其相关电子载体的标准还原电势,由Eo推断的载体顺序(non-overstep)：NADHQcytbcytc1cytccytacyta3O2,e趋向于自发从Eo较低的载体流向较高的,t19-2,12,提供O2和e供体时，不同阻断剂将导致形成特定的氧化态/还原态载体组合模式(ie.吸收光谱变化)-阻断部位之前均为还原态-阻断部位之后均为氧化态,电子转移阻断剂对各载体氧-还状态的影响,鱼藤酮,抗霉素A,19-6,13,呼吸链若干位点的自由能释放足以推动H+泵,P34-6,自学,14,毛地黄皂苷处理,渗透破碎,去垢剂溶解处理和离子交换层析,复合体&ATP合酶,19-7(3rd),Invitro,ATPsynthase=ATPase,noATP-synthesizingactivity,呼吸链功能复合体的分离提纯(cf.p333),自学,15,-两类呼吸链组成不同-泛醌是两类呼吸链的汇合点-产生ATP的数量不同,(95%),复合体(NADH-Q氧化还原酶),复合体(琥珀酸-Q还原酶),复合体(细胞色素还原酶),复合体(细胞色素氧化酶),电子传递/呼吸链的主要类型,(cf.Fig.12-6),16,e转移能量被有效保存在H+梯度中,-e经由复合体/传给Q生成QH2-作为e和H+的移动载体，QH2随即将e传递给复合体-复合体再将e转移给另一移动载体Cytc-复合体最终将e从Cytc传递给O2生成H2O-伴随e流动的同时发生从基质到膜间腔的H+净流动,总矢量反应式(NADH型)NADH+11HN+O2NAD+10HP+H2O,Eo=0.816V,Eo=1.14VGo-220kJ/mol(cf.p335),呼吸链四个复合体的e和H+流,19-15,Eo=-0.32V,(Eo=0.031V),(cf.Fig.12-1112-15),Eo=0.045V,17,电子载体以多酶复合体形式进行反应,电子从NADH、琥珀酸、脂酰-CoA和甘油-3-P到泛醌(Q)的传递途径,甘油-3-P脱氢酶,NADH型呼吸链(95%)起点为脱氢酶辅酶NAD+,酰基-CoA脱氢酶,氧化还原酶,19-8,FADH2型呼吸链起点为脱氢酶辅因子FAD,自学,18,复合体(NADH:Q氧化还原酶),-催化:H从NADH转移至FMN-FMN经由系列Fe-S中心将2e传递给基质臂上的Fe-S蛋白N-2-2e沿膜臂从N-2转移到Q后形成QH2-QH2扩散进入膜脂双层(III)，同时驱动4H+从基质中排出-阿密妥、鱼藤酮和杀粉蝶菌素A能抑制该电子流而完全阻断氧化磷酸化的进行,膜间腔,基质臂,膜臂,19-9,矢量H+流产生跨内膜的电化学势能，使e传递中释出的大部分能量得以储存，而H+的回流则可用于驱动ATP的合成,NADH+5HN+QNAD+QH2+4HP+,=NADHQ,自学,19,复合体(琥珀酸脱氢酶),-异型四亚基(五辅基),膜整合蛋白,辅基,周质心磷脂,-从琥珀酸结合位点经FAD和Fe-S中心至Q结合位点的e转移通道全长超过40，但每一段均短于快速e转移的共振距离11,19-10,=琥珀酸Q,forE.coli,自学,20,复合体(细胞色素bc1复合体),-为同型二聚体，各单体由11个不同的亚基组成-单体的功能核心为三个关键亚基：含有2heme的cytb含有heme的cytc1含有2Fe-2S中心的RieskeFe-S蛋白,19-11a,=Qcytc,其中Fe结合于His而不是Cys,自学,21,复合体的二聚体作用,-凸出在P侧的cytc1和RieskeFe-S蛋白可以和膜间腔中的游离cytc相互作用-2个独立的Q结合点QN和QP分别与能阻断氧化磷酸化的两种药物抑制作用有关-Q中间代谢物的移动发生在单体之间形成的空隙中,抗霉素A可与之结合而阻断电子从血红素bHQ,黏噻唑菌醇可与之结合而阻断电子从QH2F-S中心,19-11b,自学,22,Qcycle,1ste,2nde,19-12,=完成双/单电子载体之间的转换,可溶性蛋白，还原后即可向复合体移动,膜间腔H+净增,自学,23,G21.12,泛醌-泛醇库,半醌不解脱,自学,24,19-13,复合体(细胞色素氧化酶),=cytcO2,10个亚基中以构建复合体核心,-亚基含血红素a&a3和铜离子CuB，形成双核Fe-Cu中心,-亚基含有2个铜离子，分别与2Cys-SH连接成双核中心CuA,-双核中心CuA的2个铜离子均等共享1e：还原态为Cu1+Cu1+氧化态为Cu1.5+Cu1.5+,-亚基为复合体功能所必需，但作用不详,Met,His,Asp,Cys,自学,25,以底物方式消耗,-O2的还原需要4e+4H+(=2NADH当量)-cytcO2的e传递分两轮进行：1st轮的2e将O2还原成O22-2nd轮的2e再将O22-还原成H2O(消耗基质中的4H+)-每个e通过时还可泵出1H+,复合体的作用机制,19-14,-总反应：4cytc(还原态)+8HN+O24cytc(氧化态)+4HP+2H2O,CN,N3,CO可抑制,自学,26,只有还原态双核中心Fea32+-CuB+才能接受O2，并分别由Fea32+和CuB+各提供e将其还原为过氧化中间物,cytc提供的3rde将CuB2+再还原成CuB+,靠近CuB+的O被质子化而引起e重新分布,加上2ndH+和4the后，导致O-O键断裂并形成羟化中间物,再加上2H+后释出2H2O，双核中心返回氧化态,氧化态双核中心Fea33+-CuB2+被来自cytc的2e分步还原,P34-8,复合体还原O2的假设机制,尚未完全还原的过氧化态中间物始终与复合体紧密结合，直到完全还原成H2O才释出,O22,自学,27,19-16,线粒体内膜将两个不同的H+区室分开，形成跨膜的化学浓度差(pH)和电位差()，其净效应即是PMF,质子动势(PMF:protonmotiveforce)=e传递中释出的大部分能量的暂时储存形式,生理条件下泵出H+的G20kJ/mol,G21.22,(cf.p341),28,Easternskunkcabbage,植物线粒体氧化NADH的不同机制,-低照明时可通过类似于非光合物种的e流传递机制以合成ATP-光照下其线粒体的NADH主要来自于光呼吸产生的Gly缩合成Ser2Gly+NAD+Ser+NADH+H+CO2+NH4+,不受CN抑制,b19-1,绕过、和及其H+泵，将能量直接以热形式耗散以再生出光呼吸所需的NAD+,自学,29,19-16(3rd),-来自于NADH等可氧化底物的e通过内膜上的载体而传递-e流伴随有H+的跨膜转移而形成化学梯度和电位梯度(=PMF)-内膜对H+不通透，只能经由特异通道(Fo)返回基质-驱动H+返回的PMF为ATP的合成提供能量，该偶联反应由结合于Fo的F1复合体所催化,内碱外酸,在与e传递相偶联所形成的PMF驱动下，泵入膜间腔的H+经由特殊通道回流至基质，而由此产生的G被用于将ADP+PiATP,内负外正,ATP合酶,chemiosmotichypothesis(1961),2.ATP合成,1978NPinChem.,30,-只添加ADP和Pi时，呼吸(O2耗)和ATP合成都很小-添加e供体如琥珀酸则立即显著增加-加入氰化物后又随即被抑制,电子传递和ATP合成相偶联,19-18,-已加入琥珀酸的线粒体，其呼吸和ATP合成只有在添加ADP和Pi之后才能进行-氧化磷酸化抑制剂杀黑星霉素/寡霉素可因阻断ATP的合成而抑制呼吸的进行-解偶联剂2,4-二硝基苯酚(DNP)使呼吸继续进行但不能合成ATP,干扰ATP合酶使其合成受阻H+不能返回基质H+梯度加大导致H+泵停转e流停止,Cyt(a+a3)O2,31,G21.31,2,4-二硝基苯酚(DNP),-疏水性小分子(弱酸)-具有可解离H+-不影响e传递和H+泵-可携带H+跨越内膜而破坏其跨膜梯度，进而抑制ATP合成,使e传递和ATP合成相互分离,解偶联剂(uncoupler),Dinitrophenol,电子离域作用使负电荷相应分散，导致该阴离子表现为弱脂溶性的,双(羟)香豆素,32,通过提供H+重返基质的另一条途径，褐色脂肪组织线粒体的解偶联蛋白/产热素蛋白使质子泵保存的能量以热量形式发散出来,解偶联线粒体的产热反应,19-30,自学,33,-将线粒体悬浮于0.1MKCl的pH9缓冲液，经由渗透作用最终使基质与环境达到平衡-将线粒体移至pH7缓冲液，后者含有K+载体缬氨霉素但不含KCl-缓冲液的改变使线粒体内膜两侧形成2pH单位差(内碱外酸)-K+在缬氨霉素载运下顺其梯度外泄导致跨膜电荷不平衡(内负外正)-两者形成的电化学势即为质子动势PMF，足以在缺乏可氧化底物提供e流的条件下使ATP的合成进行,ATP合成中质子梯度作用的证实人工模拟的电化学梯度能够在缺乏可氧化底物作为电子供体的条件下驱动ATP的合成,19-20,自学,34,F1=33(膜周蛋白)Fo=ab2c1012(膜整合蛋白),转轴,ATP合酶结构(=FoF1复合体),-Fo是跨内膜疏水蛋白组成的H+孔道，2b2亚基与F1的及亚基紧密结合而使之相对固定在内膜上-嵌合在膜内的c亚基柱状体环绕由F1的及亚基所组成的主茎-H+经由Fo从P侧跨膜流向N侧时，柱状体和主茎即发生相对旋转，使F1的亚基依次与亚基接触而改变其构象,19-23f,自学,(cf.Fig.12-17),35,松散构象,开放构象,紧密构象,每个亚基在与其相邻的亚基交界处都有一个对催化活性极为关键的腺苷酸结合位点，但在任一给定时刻均分别处于不同构象-紧密构象结合有已合成的ATP-松散构象与ADP&Pi结合-开放构象为空载,F1的晶体结构顶视图(膜N侧),转轴亚基,19-23c,自学,36,-F1复合体具有3个不同的腺苷酸结合位点，分别对应于一对亚基，但在任一给定时刻分别呈现紧密、松散和空载构象-PMF使主茎带动亚基转动(120跳跃式)，依次与各对亚基接触，导致相互协调的构象变化：-ATP位点转化成空载构象而释出ATP(需要3H+进入基质)-ADP位点变为紧密构象，促进松散结合的ADP和Pi缩合成ATP-empty位点转变成松散构象，使进入的ADP和Pi松散结合-3个催化位点中至少有2个交替处于活性状态(=只有当某个位点结合了ADP和Pi时，另一位点才能释出ATP),ATP合酶作用的结合-变换机制-旋转催化(1979),NPinChem.1997,19-24,1918,(cf.Fig.12-19),37,-腺苷酸移位酶是逆向转运载体，而外正内负的跨膜电位差有利于该逆向主动转运的进行(ADP3取代ATP4意味着负电荷的净流出)-磷酸移位酶是同向转运载体，仅对H2PO4专一，后者与H+的同向内流不会造成净电荷移动，但基质内的低H+有助于同向转运,质子动势亦可驱动主动转运,(腺苷酸及磷酸移位酶),19-26,PMF既可为ATP合成提供能量，也能促进将底物ADP+Pi和产物ATP分别转入和转出基质的主动转运,(cf.Fig.12-5),38,19-27,胞液NADH的再氧化：穿梭机制,苹果酸-天冬氨酸穿梭(肝、肾及心肌细胞),(=将胞液中产生的NADH当量转入线粒体基质),胞液NADH将2个还原当量转给草酰乙酸生成苹果酸,苹果酸在苹果酸-酮戊二酸转运蛋白作用下跨越内膜,苹果酸在基质中将还原当量转移给NAD+、生成NADH并经由呼吸链继续氧化,苹果酸脱氢生成的草酰乙酸不能直接返回胞液，需经由转氨反应生成Asp,Asp经由Glu-Asp转运蛋白返回胞液,Asp再通过转氨反应再生草酰乙酸,(cf.Fig.12-3),39,-在胞液甘油-3-P脱氢酶(辅酶NADH)作用下，二羟丙酮磷酸接受2个还原当量生成甘油-3-P-结合在线粒体内膜外表面的甘油-3-P脱氢酶(辅因子为FAD的线粒体同工酶)随即将这2个还原当量转移给泛醌并继续经由呼吸链传递-该穿梭使胞液NADH还原当量的传递因绕过呼吸链的复合体而少泵出4H+,甘油-3-P穿梭(骨骼肌及脑细胞),19-28,(cf.Fig.12-4),40,t19-5,-复合体、和在传递2e时分别从基质泵出4/4/2H+即NADH型链和FADH2型链总共可分别泵出10/6H+-每合成1ATP需要回流4H+：3个用于合成，1个用于与ATP等转运有关的反应-NADH型和FADH2型链每传递2e给O2可以分别合成2.5/1.5ATP,细胞条件下ATP水解的Go-50kJ/mol，合成32个ATP将保存Glc完全氧化释放总能量的54%,