（食品科学专业论文）榛仁肽的制备及特性研究.pdf

榛仁肽的制备及特性研究 摘要 制油后的榛仁蛋白中蛋白质含量较高，然而，榛仁蛋白资源并未得到充分利 j p i j 。现代营养学研究发现，人类摄食的蛋白质经消化酶作用后，大多数是以多肽 而不是氨基酸形式吸收的。这些多肽除了具有易消化吸收性质外，还具有许多优 良的功能特性和生理活性，可以被广泛地应用到食品领域中去。因此，通过酶解 可以大大提高其营养价值和利用价值，是榛子深加工的一个重要方面。 榛仁肽是榛仁蛋白质经酶水解、精制后所得到的短肽混合物。本试验以脱脂 后的榛仁蛋白为原料，分别用2 7 0 9 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶对其 进行水解，以水解度为指标，确定2 7 0 9 碱性蛋白酶为最佳酶制剂。通过对榛仁 蛋白进行不同粒度的粉碎处理，确定过1 0 0 目筛为最佳预处理方法。 通过单因素试验和正交试验确定了2 7 0 9 碱性蛋白酶的最佳水解条件，即： 温度为5 0 ，p h 为9 5 ，底物浓度为3 ，酶浓度为4 ，水解3 小时，可以得 到水解度为8 3 2 4 9 的榛仁肽。 通过添加5 活性碳脱臭、脱色及脱苦，可获得满意的效果。通过阴阳离子 交换树脂可除去9 1 2 0 的盐分，可获得精制的榛仁肽。 对榛仁肽的理化性质和生理活性进行了研究，表明：榛仁肽具有溶解性不随 p h 值变化而改变和高浓度低粘度的特点；此外，榛仁肽还具有降血脂和抗疲劳 的活性功能。其作为功能性保健品具有深远意义。 关键词：榛仁蛋白，水解，榛仁肽 t h ep r e p a r a t i o no fh a z e l n u tp e p t i d ea n dt h es t u d yo ni t s s p e c i a l i t y a b s t r a c t t h ec o n t e n to ft h eh a z e l n u tp r o t e i nt h a ti sd e f a t t e di sh i g h ，b u tt h e s o u r c eo ft h eh a z e l n u tp r o t e i ni ss c a r e l yu s e df u l l y t h em o d e r nn u t r i t i o n r e s e a r c hd i s c o v e r st h a tt h ep r o t e i no fh u m a nt a k i n gi sd i g e s t e da n d a b s o r p t e da f t e re n z y m e sf u n c t i o nm a j o r l yi nl o wp e p t i d e sb u tn o ti na m i n o a c i d s i na d d i t i o nt oh a v i n gt h ee a s i l ya b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c ，t h e s e 1 0 wp e p t i d e ss t i l lh a v em a n yg o o df u n c t i o n sc h a r a c t e r i s t i ca n dt h e p h y s i o l o g i c a la c t i v i t y t h e yc a nb eu s e db r o a d l yi nt h ef o o df i e l d t h e m e t h o do fe n z y m a t i ch y d r o l y s i si sd e v e l o p e dt o i m p r o v et h e i rn u t r i t i o n a n du t i li z a t i o nv a l u e a n di ti sa ni m p o r t a n ta s p e c to fu s i n gt h en e wa n d h i g ht e c h n i q u e st od e a lw i t ht h eh a z e l n u tp r o t e i n h a z e i n u tp e p t i d ei st h em i x t u r eo fs h o r tp e p t i d e st h a tt h eh a z e l n u t p r o t e i ni sh y d r o l y z e db ye n z y m e sa n da g a i nh a n d l e ds p e c i a ll y t h e s u b s t r a t eo fe x p e r i m e n tw a sd e f a t t e dh a z e l n u tm e a lt h a tw a si n d i v i d u a l l y h y d r o l y z e db y 2 7 0 9a l k a l i n ep r o t e a s e ，p a p a i na n db r o m e l a i n i t w a s d e t e r m in e db yt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i st h a tt h e2 7 0 9a l k a l i n ep r o t e a s e w a st h eb e s to n e t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o t a lt e s t ，t h eo p t i m u m h y d r o y z i n g c o n d i t i o nh a s b e e n d e t e r m i n e d ：t e m p e r a t u r e 5 0 ，p h 9 5 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n3 ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n4 ，t h et i m e3 h o u r s ，a n di tc a ng e tt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i s8 3 2 4 9 w ec a ng e ts a t i s f a c t o r yr e s u l t sb yu s i n g5 a c t i v ec a r b o nt h a tc a nt a k e a w a ys m e li ，c o l o ra n db i t t e r a tt h es g m et i m e ，i tc a nb et a k e na w a y9 1 2 0 s a l t ，g e t t i n gt h er e f i n e dh a z e l n u tp e p t i d e s t h ep h y s i c a ta n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f h a z e n u tp e p t i d ea r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w ：t h es o l u b i l i t yi nw a t e ri s i m p r o v e da n da r en o tc h a n g e a b l ew i t ht h ec h a n g i n go fp u i th a s 1 0 w v i s c o s i t yi nh i g hc o n c e n t r a t i o n f u r t h e r m o r et h eh a z e l n u tp e p t i d e sh a v e f u n c t i o ni nl o w e rt h et r i g l y c e r i d ei ns e r u ma n da n t i f a t i g u e i th a st h e p r o f o u n dm e a n i n gi nt h ef u n c t i o n i i k e yw o r d s ：h a z e l n u tp r o t e i n ，h y d r o l y s i s ，h a z e l n u tp e p t i d e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： _ 王热签字日期：加p 占年石月哗日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名：壬晶 签字目期： 砌占年g 月俘日 导师签名：牟凡华 签字日期：印f 年月7 目 f 吉林农业大学硕士学位论文 榛f 肽的制备及特性研究 1 1 植物蛋白的开发利用 第一章前言 蛋白质是构成人体生命的基础物质，在体内具有许多重要的生理功能。它不仅构 成人体细胞组织，而且参与体内物质代谢调节、供给热能、具有防御功能等。所以， 蛋白质的有效摄入量是决定人们健康状况的重要因素之一。目前，虽然我国国民的温 饱问题基本得到解决，但是蛋白质的人均摄入量还比较低，而对于蛋白质的质量，就 更加无法保障。评定一种蛋白质的营养价值，不仅要看它的含量，而且要看它的质量， 即八种必需氨基酸的含量是否充足，比例是否均衡。由于人体蛋白质中各种必需氨基 酸的比例是固定的，这就要求许多蛋白质中各种氨基酸比例符合人体的需要。而我们 知道，现在许多食品中氨基酸含量不符合这种比例，存在限制性氨基酸，所以食品的 营养价值较低。为了提高食物蛋白质的营养价值，就必须及时补充食物中的限制性氨 基酸，并使其比例符合人体的需要。 由于西方发达国家膳食以动物性食物为主，动物蛋白食用过多，导致文明病泛滥 ( 如肥胖、高血压、高血脂、心脑血管病、糖尿病等) ，这一倾向在我国发达地区也有 明显表现。为此，近年国内外开始重视低脂肪、无胆固醇的植物蛋白资源的开发，为 了提高中华民族健康素质，中国食品工业协会提出了植物蛋白与动物蛋白并举的方 针，植物蛋白由于资源丰富、廉价易得以及其独特的生理功能己成为食品研究开发的 热点。根据以上所述，水解植物蛋白具有广阔的开发前景，从我国目前发展战略目标 来说，水解植物蛋白具有非常重要的意义： f 1 ) 植物蛋白资源丰富。从世界能提供蛋白资源的食品来看，植物蛋白占总蛋白量的 7 0 以上，尤其是油料种子中包含的蛋白质所占比例最大，约为1 3 左右【l j 。 ( 2 1 植物性蛋白质，尤其是油料植物蛋白是一种具有较好机能特性的食品原料，种子 中蛋白质含量很高，具有保水性、乳化性、弹性和粘结性等功能特性，加热调理后不 再产生收缩变化，制品品质均匀，利于长期保存拉j 。 f 3 1 植物蛋白具有较高的营养价值，其氨基酸组成基本平衡，人体必需的氨基酸含量 较高，且易消化吸收，是良好的营养食品资源【3 1 。 f 4 1 种类丰富，不仅可以单独制成食品，也可以与其它蔬菜或肉类等配制成多种多样 的食品。不仅营养效果在互相补充中得到提高，而且改善了色、香、味，提高了市场 价值。 f 5 1 植物蛋白对人体健康发挥着动物蛋白不可比拟的作用：降低胆固醇水平、减少癌症 的发生、改善心血管疾病的症状等1 4 j 。 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制各及特性研究 ( 6 ) 开发水解植物蛋白适应社会饮食潮流。随着人民生活水平的提高，“富贵病”的增k ， 人们对动物性食物避之不及，而对植物蛋白趋之若骜。故开发植物蛋白正是人心所向、 大势所趋，符合人们的饮食观念。 ( 7 ) 蛋白水解产物主要含有氨基酸和多肽，其中含量最多的是多肽，多肽具有蛋白质 无法比拟的生理功能和营养价值。 ( 8 ) 植物蛋白相比较动物蛋白来说，价格低廉。 无沦是从人类对食物的需求，还是从膳食营养平衡的角度出发，发展植物蛋白都 是一项具有战略意义的大事，因此，引起世界各国的高度重视，也为食品学家和营养 学家提供了新的机遇和挑战。植物蛋白的降解产物生物活性多肽，由于其对人体 具有多方面有益的生理功能，正成为植物蛋白进一步深入研究的延伸领域。蛋白水解 物是一种复杂的混合物，随水解度不同，功能性有较大差异，因此有必要进一步在这 方面进行深入的研究。蛋白水解物具有很好的营养保健性和功能性，应用非常广泛。 而我国在此方面的研究和开发起步较晚，与国外存在较大的差距，应用主要局限于方 便面、膨化食品、酱油等少数产品，市场空缺较大，开发其在食品工业中应用研究， 将具有良好的经济和社会效益。 1 2 生物活性肽的概述 1 2 1 概念 我国蛋白质的加工具有悠久的历史，其制品也已经成为人们日常生活中的必需 品。所有生物的蛋白质都是由2 0 种氨基酸组成，氨基酸彼此之间以肽键相互连接成为 “肽”，它们与氨基酸一起构成了千姿百态的蛋白质世界。一般少于1 0 个氨基酸的肽被 称为寡肽，超过1 0 个氨基酸的称为多肽，但两者术语的界定并不严格。氨基酸为5 0 多个以上的多肽称为蛋白质。多肽和蛋白质只有肽链长短之别，二者间没有严格区分。 生物活性肽是一种具有一定氨基酸顺序的多肽，通过体内消化释放，并在动物的肠道 消化过程中，充当新陈代谢的潜在生理效应物，是一类具有特殊的生理活性的肽类p j 。 122 生理功能6 1 l2 , 21 高吸收速度和高吸收率 现代生物学研究表明，人体摄入的蛋白质经消化酶作用后，更多的是在胃及小肠 中水解生成肽，并以肽的形式由肠管吸收。在合成肽实验中证明，二肽和三肽吸收速 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制备及特性研究 度比同一组成的氨基酸快。有人通过对白鼠强制喂食蛋白质i ”，可以看出大豆肽吸收 速度和吸收率与其它蛋白和氨基酸混合物相比都是最高的，而氨基酸混合物却格外 低，这表明肽类比氨基酸能更容易、更快被机体所吸收利用。因此，多肽可作为肠道 营养剂用于对蛋白质消化吸收不良或体内缺乏酶系统而不能分解和吸收蛋白质的人 群。 1222 保健作用 多肽具有降低血清胆固醇的功能。多肽通过刺激体内甲状腺激素分泌量增加，促 进胆固醇胆汁酸化，从而阻碍肠道胆固醇再吸收并促使其排出体外。多肽降低血清胆 固醇具有其独特特点：对于胆固醇量正常者无降低作用；但对高胆固醇者有明显降低 作用，并能使对人体有害的低密度脂蛋白胆固醇降低，而对人体有益的高密度脂蛋白 胆固醇并不降低。对胆固醇量正常者，在食用高胆固醇含量食物时，多肽也有防止血 清胆固醇升高的作用。 此外，多肽还具有降血压的作用。血管紧张转化酶( a c e ) 在人体血压调节过程中 至关重要，血浆中血管紧张素原被肾素水解成血管紧张素i ，在a c e 酶作用下，继续 水解产生血管紧张素i i ，血管紧张素i i 致使血管强烈收缩，血压上升。蛋白质经特殊 酶水解后得到的多肽可抑制阻碍a c e 酶催化水解血管紧张素i 成为血管紧张素i i ，从 而防止血管强烈收缩，降低血压【8 】。因此，多肽可作为保健食品的功能性成分，对老 年人高血压、高胆固醇、心脑血管疾病等具有很好的防治作用。 另外，多肽能迅速使人恢复疲劳并提高耐力。有关报道【9 】表明，要使运动员体能 增加就要使运动员肌肉量增加，这样必须有适当的运动刺激以及补充蛋白质。通常， 刺激蛋白质合成的成长激素的分泌在运动后1 5 3 0 m i n 之间及睡眠后6 0 m i n 时达到顶 峰，若能在这段时间内适时提供易消化吸收的多肽作为肌肉蛋白质原料将是非常有效 的。小分子肽类比蛋白质和氨基酸更容易吸收，因此，多肽可添加到运动员食品或饮 料中促进脂肪代谢，较快地将脂肪转化为能量，以及时补充机体所需的能量，同时还 可以在运动时迅速为肌肉提供充足蛋白质，使体力得到及时恢复和增强。 张智等【”】报道大豆肽可用于补钙产品以促进钙的吸收利用。大豆肽具有与钙及其 它微量元素有效结合的活性基团，能形成有机钙多肽络合物，大大促进钙吸收。大豆 肽也可添加到普通食品中，使在日常膳食中即可达到补钙目的。此外，大豆肽还能与 铁、硒、锌等多种微量元素结合，形成有机金属络合肽，是吸收和输送微量元素很好 的载体。 再有，多肽还能够促进脂肪代谢，具有减肥作用，日本专家以小白鼠为试验对象 得出这个结论f 1 ”。正是由于多肽具有促进脂肪、能量代谢作用，并能抑制体内脂肪贮 存，再加上多肽的降糖效果，因此长期食用多肽能具有很好的预防肥胖以及减肥作用。 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制各及特性研究 12 3 ；b n - v 特性1 6 i 蛋白质经酶解后具有许多优良的加工特性，例如高溶解性、高稳定性、高保湿性、 乳化性、抗凝胶性等。据f e n g 等i ”】报道，目前多肽在食品中应用主要在于它的加工特 性，而不是它的营养特性。 1 2 3 1 高溶解性 多肽具有良好溶解性，一般蛋白质处于等电点附近便会形成沉淀而分离，而多肽 不论p h 条件如何都能显示出良好的溶解性。这既不会减弱食品中蛋白质的营养价值， 还能获得良好的功能性质，从而大大拓宽它在食品和饮料中的应用范围。另外，蛋白 质加热易形成凝胶，高温下易变性，影响制品感官品质，而多肽的溶解性不受加热影 响。因此，将多肽应用于饮料工业尤其是在酸性或需要加热条件下作为蛋白质补充剂 比蛋白质的稳定性更强，应用范围更广泛，并且不易产生沉淀。另外，多肽还具有抑 制蛋白质凝胶形成的性质【l ”，可调整蛋白食品硬度和改善食感。例如，将大豆多肽添 加到肉制品如火腿中，可保持其鲜嫩可口性，防止肉中肌蛋白硬化。 1 2 3 2 吸水性 蛋白质被水解后，分子结构被破坏，大量亲水基团外露，导致多肽吸水性明显高 于蛋白质。有人研究大豆分离蛋白和大豆多肽的吸水性- 与p i - i 值及温度的关系【l ，研 究表明大豆分离蛋白吸水性随p h 值增大而增大，而大豆多肽吸水性受p h 影响改变不 大。当温度升高到3 0 后，大豆分离蛋白吸水性随温度升高而下降，而大豆多肽吸水 性在3 0 。c 9 0 。c 范围内却随温度升高而增大，且不同种类的多肽在不同温度、p h 值时 吸水性基本相同。由于多肽的这种强吸水性和保湿性能，将它添加到面包或糕点等食 品中，可防止食品失水老化，以保持食品松软性。 12 33 低渗透压 多肽溶液渗透压处于蛋白质与同一组成氨基酸之间。当一种营养液渗透压比体液 高时就会发生人体周边组织细胞中水分向肠胃移动，这样易引起营养素吸收恶化，由 高渗透压引起腹泻就是这个原因。通常氨基酸会发生这种现象问题，但多肽渗透压比 氨基酸低得多，可作为口服及肠道营养液蛋白源，使用多肽比氨基酸更容易见效【l ”。 123 4 促进微生物生长发育 多肽具有促进微生物生长发育和活跃代谢的作用。实验表明，多肽能促进双歧杆 菌发酵及促进乳酸菌和霉菌等增殖。把多肽用于生产新型发酵类食品，如酸奶、干酪、 醋、酱油和发酵火腿等发酵食品中，可以提高生产效率、增强品质稳定性及改善产品 风味并提高产品营养性【l ”。 吉林农业大学硕士学位论文 楱仁肽的制各搜特性研究 l235 抗氧化性 最近，多肽抗氧化性研究也取得一些进展【“】，有人通过亚油酸自动氧化鉴定并分 离出大豆球蛋白蛋白酶水解物中六种多肽具有抗氧化特性，此类多肽具有捕捉自由基 及螯合金属离子作用，而且多肽中都含有组氨酸和酪氨酸，此类多肽抗氧化机制尚未 很明确，有待进一步深入研究。 由于多肽溶解性好，吸湿性和保湿性强，能易溶解于多种化妆品溶剂，水解得到 的低肽可与金属元素在一定条件下形成复合氨基酸络合物。多肽还具有一定的抗氧化 作用，因此在头发及皮肤护理上有一定的功效，可用作一些修复型化妆品的添加剂 1 7 1 ， 如营养霜和面膜，可快速恢复皮肤光泽与弹性，减少皱纹，对延缓衰老起着积极作用； 用f 护发，能有很好光泽和高效保护作用，使头发免受环境条件和化学因素破坏。 124 分类 活性肽可按原料来源和保健功能来划分【”1 。按原料来源划分的类别有乳肽、大 豆肽、玉米肽、豌豆肽、卵白肽、畜产肽、水产肽等。按保健功能划分的类别有：易 消化吸收肽、抗菌肽、血管紧张素转换酶抑制肽( 简称a c e i 肽) 、抑制胆固醇肽、促进 矿物质吸收肽、机体防御功能肽、肝性脑病防治肽等。 12 5 制备 生物活性肽的制备方法和途径主要有三条：一是从自然界的生物体中提取其本身 固有的各种天然活性肽类物质：二是通过蛋白质降解的途径可以获得具有各种生理功 能的生物活性肽；三是应用合成方法来制备各种生物活性肽。天然生物体中存在着具 有各种生理功能的生物活性肽，因此可以从天然生物体中提取生物活性肽，但其生产 成本较高，而且生物活性肽在生物体内的含量普遍很低，很难实现大规模的生产。而 合成法虽可按人们的意愿合成任意活性肽，但目前因为存在成本高、副反应多及残留 有毒化合物等问题制约着发展。 目前用的最多的是水解蛋白质制备生物活性肽。过去，科学家一直未对利用植物 蛋白和动物营养蛋白及乳蛋白水解制备生物活性肽给予应有的重视。但是现在，科学 家逐渐注意到：在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，将其水解出来，可 制备成各种各样的生物活性肽。蛋白质水解包括酸水解、碱水解、酶水解，其中利用 酸碱水解蛋白质，反应条件剧烈，会破坏氨基酸原有构型，产生有毒物质，放不宜使 用。而用酶法水解蛋白质具有多种优点【l “2 0 】：蛋白质的酶水解是一种不完全、不彻 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制各及特陛研究 底的水解，其产物宅要是肽而不是氨基酸。反应条件温和，反应时间短，效率商，不 产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物易分离，成本低，因此酶法水解 蛋白质制备生物活性肽是目前生产活性肽的主要方法。为此，本试验选择了以蛋白酶 水解榛仁蛋白来生产榛仁肽。 此外，利用蛋白酶来水解蛋白质时，还可通过选择酶的种类，控制反应条件等措 施来得到具有特定生理功能的生物活性肽。本试验选择了几种不同的酶，通过单因素 和正交试验确定了最佳的水解条件，目的是最大限度地得到所需要的产物。 目前，应用蛋白酶水解法制备生物活性肽己成为国内外研究的热点，并成为人们 开发新型保健食品及其基料的主要途径之一。目前生物活性肽类食品在日本、美国以 及西欧等发达国家早已上市，而我国对生物活性肽的研究和开发尚处于起步发展阶 段。 126 生物活性肽的研究进展 近几十年来，科学家在动( 植) 物体中发现许多种肽，就人体来说，几乎没有器官 不分泌肽，即使神经细胞和心脏也能分泌肽。而且发现由人体各种器官和细胞分泌的 肽的种类还在不断增加，研究表明这些含量极微的生物活性肽，在生命过程中起着重 要的调控作用，与人( 动物) 的生殖、发育、生长、代谢、免疫、疾病、学习、记忆、 衰老甚至精神状态都有极为密切的关系。6 0 7 0 年代多肽研究的一个主要方向是从生 物体中分离、纯化生物活性肽，鉴定其结构，进行合成并研究它们的生理活性以及结 构与活性的关系。到了9 0 年代由于人们认识到它与生命现象的密切关系，再加上实验 仪器，如核磁共振、质谱、高效液相色谱、毛细管电泳技术等的普遍应用，以及计算 机技术在多肽研究领域的应用，分子生物学在理论与技术上突飞猛进的发展，都促进 了多肽研究的深入，引起了多种学科的科学家，如有机化学家、生物化学家、药物学 家、结构化学家等的高度重视。多肽学科体现了多种学科之间相互渗透、互相交叉的 特点。如计算机辅助的多肽分子全新设计，多肽模拟物、组合化学、活性肽受体、多 肽疫苗、构象约束肽生物大分子识别和核苷酸杂合肽等。生物活性肽的结构与功能关 系的研究仍然是重点领域，但研究的方法和手段已与过去大不一样了。近年来，越 来越多的蛋白质的一级结构己经研究清楚，所以可以根据所需制备的多肽的氨基酸组 成或结构特点来选择相应的原料，如生产促钙吸收肽时可选择氨基酸具磷酸化结构较 多的蛋白质，故生产上选用一级结构中含较多的磷酸化丝氨酸的酪蛋白作为原料 2 1 - 2 4 1 ：选用大豆蛋白作为生产大豆多肽的原料 2 5 - 2 7 1 ：利用乳酸链球菌发酵淀粉类原料 生产乳链菌肽等【2 。 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制各及特性研究 127 在功能食品中的应用 功能食品是指对人体具有增强机体防御功能、调节生理节律、预防疾病和促进康 复等有关生理调节功能的加工食品。随着人们生活水平的提高，各种“富裕病”如高血 压、肥胖病等已经越来越引起人们的关注，人们的观念已从吃饱吃好向防病治病方向 转变。蛋白质经酶解后可产生多种具有生物活性的多肽，在功能食品中具有重要作用。 1271 生理活陛肽 ( 1 ) 阿片肽 内源性阿片肽包括脑啡肽、内啡肽、强啡肽、生长激素抑制剂等。阿片肽的功能 主要是镇静止痛、诱导睡眠、延长胃肠蠕动等。它与目前使用的镇痛剂的不同之处在 于：它经过消化器官进入体内后无任何副作用，这方面已成为食物药理学家们和食疗 科学家们的一个非常活跃的研究领域。 ( 2 ) 谷胱甘肽 谷胱甘肽( g s h ) 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化 合物。其具有抗氧化、清除自由基的功能，使生物大分子、生物膜免受损害；g s h 对于放射线、放射性药物或由于抗肿瘤药物所引起的白细胞减少等症状能够起到强 有力的保护作用；g s h 能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结 合，并促进其排出体外，起到中和解毒作用；g s h 可阻止过氧化氢氧化血红蛋白， 保证血红蛋白能持续发挥输氧功能；还可抑制乙醇侵害肝脏产生脂肪肝。 ( 3 ) 易消化吸收肽 蛋白质经消化酶作用后并不一定为完全游离氨基酸才被吸收，而是主要以低 肽的形式吸收，吸收原型肽己同吸收氨基酸同样重要。肽的吸收是通过粘膜纹状 缘存在的肽载体，利用质子梯度主动转运机制来实现的。低肽的吸收率比氨基酸 大，比氨基酸更易、更快被机体吸收利用；低肽的低抗原性使得食用后不会引起 过敏反应；且低肽的渗透压比氨基酸低，食用后也不会引起痢疾等不良反应；低 肽还具有良好的感官效应，因而可利用低肽来为那些通常有饮食不能满足蛋白质 需要的人员提供氮索营养。 ( 4 ) 抑制胆固醇作用肽 大豆蛋白经酶作用产生的食饵饲喂老鼠时，血清胆固醇浓度降低。因此，有人认 为消化生成的肽能刺激甲状腺激素的分泌增加，促进胆固醇的胆汁酸化，粪便排泄胆 固醇增加，由此起到降低血液胆固醇的作用。 ( 5 ) 环肽 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制备及特性研究 环肽包括环己肽、环八肽等，、泛分布于人类中枢神经系统和胃肠道，有些天然 存在于一些植物和动物体内，具有很多生理功能。外源性给予环肽在老鼠体内可呈饱 腹感，抑制胰岛索和胰高血糖素的分泌。 ( 6 ) 抗菌多肽 根据结构，抗菌多肽可分为环状肽、糖肽和脂肽三类。由于使用抗生素会导致人 类致病菌对抗生素产生耐药性，所以使用抗菌肽来代替抗生素是将来生物医学发展的 必然，具有无限的发展前景。 l272 食品感官肽 ( 1 ) 调味肽 具有不同氨基酸序列的肽能够增进酸、甜、苦、咸四种味觉。通过模拟、掩盖 和增进口味，肽可以被用来调整食品的风味。阿粒甜素和阿斯巴甜二肽可作为强效 低热甜味剂。赖氨酸二肽被证明是有效的阿斯巴甜二肽的替代品，因为它不含有酯 的功能特性，因而在食品加工和储藏过程中更加稳定。苦味是啤酒、咖啡、果汁和 奶酪等食品中的一个重要口感组分。苦味肽己从发酵食品如奶酪、可可、米酒和蛋 白水解产物中分离得到。 ( 2 ) 增强风味肽 缓冲肽利用它的缓冲作用可起到增强风味的作用，与酵母浸出物相关的烤肉的香 味多归因于短的风味肽。另外，肽也可作为食品的风味和香味化合物的前体。 ( 3 ) 苦味掩盖肽 寡聚谷氨酸可作为各种食品的苦昧掩盖剂，是高钠调味剂的替代品，可为糖尿病 患者和高血压患者所用。 ( 4 ) 抗氧化肽 肌肽是一种大量存在于动物肌肉中的天然肽，体外可抑制铁、血红蛋白、脂质氧 化酶及单态氧催化的脂质氧化作用，可作为储存熟肉的一种氧化型酸败抑制剂。某些 肽具有金属清道夫和过氧化氢分解促进剂作用，可降低自动氧化速率，减少脂肪过氧 化氢含量，减少自由基的生成，在动物饲料和人类食品市场中具有巨大的开发前景。 1 3 榛子研究概述 榛子，别名榛栗、山板栗、锤子等，是灌木榛子树的种子，起源于欧洲、洲和 北美洲，年产量4 3 万吨，为世界四大名坚果之一。 榛子是一种集营养、保健和食疗于一身的天然功能性食品资源。榛予坚果的种仁 营养丰富，含有蛋白质、脂肪、碳水化合物以及多种维生素和矿物质等。据分析，榛 吉林农业大学硕士学位论文榛仁肚的制备及特性研究 仁中含蛋白质为1 62 2 3 6 ，淀粉66 ，碳水化合物1 65 ，脂肪为5 06 6 38 ，种仁的出油率在5 06 5 44 。榛子中含有人体必需的八种氨基酸，其含量远 远高过核桃，所以吃起来特别香美，余味绵绵，而且没有核桃嫩皮的涩味，尤其是对 儿童比较重要的氨基酸精氨酸含量之高是植物蛋白资源中很难见到的。榛予中 钙、磷、铁含量也高于其它坚果，含油脂仅次于核桃，对人体有益的不饱和脂肪酸含 量高，而且还含有微量的亚麻酸，因此被誉为“心脏的保健食品”【2 9 i 。 榛子还有很高的药用价值。中医认为榛子味甘性平，具有开胃、调中、明目、健 脾、止泻、驱虫之效，可医治体弱和肠胃不适等症 3 0 - 3 2 。而榛树的雄花干粉有止血、 消炎的作用。也有人用榛仁与党参中药配合，治疗体虚无力、食欲不佳。另据b b c 报道，榛予还可作为提供制抗癌药物红豆杉醇的原料。美国研究人员已发现榛子里包 含着抗癌化学成分紫杉醇( t a x 0 1 ) ，它是红豆杉醇中的活跃成分，这种药可以治疗卵期 癌和乳腺癌，以及其它一些癌症，可延长病人一年的生命。因此，榛子是一种营养价 值很高的补养品 世界榛子产量居前列的国家有土耳其、意大利、西班牙和塞浦路斯等，目前我国 有2 2 个省( 区) 有榛属分布，仅东北三省就有榛林1 7 0 万平方米，但多为野生或半野 生状态，并且仍是传统的食用方法，即烘炒后去壳食用，因其果壳坚硬，食用起来非 常麻烦，严重影响其消费程度，而且国内榛仁加工几乎是空白【3 。”l 。因此，研究开 发榛子，对其进行深加工，具有重要的意义。 1 4 本试验的研究目的及意义 综上所述，榛仁肽是榛仁蛋白质经酶水解、精制后所得到的短肽混合物。本研究 采用物理和生物技术相结合，即物理方法预处理与酶结合作用，生产榛仁肽。通过对 比不同的原料粒度对水解度的影响，确定最佳的预处理方法；通过单因素和正交试验， 确定酶水解的最佳工艺参数；添加活性碳脱苦、脱色及脱臭；应用阴阳离子交换树脂进 行脱盐；通过凝胶层析作用进行多肽的分离与纯化。制得的榛仁肽具有优良的加工性 能，可以广泛地应用到各种加工食品中，同时也促进了榛子深加工技术的发展，具有 积极意义。 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制备及特性研究 2 1 试验材料 榛仁分离蛋白 2 7 0 9 碱性蛋白酶 木瓜蛋白酶 菠萝蛋白酶 酪蛋白 标准酪氨酸 甘氨酸 葡聚糖凝胶s e p h a d e x g 一2 5 昆明种小鼠( 体重2 2 2 6 9 ) 以下试剂均为分析纯 浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、 硝酸、过氧化氢、甲醇等 2 2 试验仪器和设备 第二章试验材料与方法 实验室提供 北京房山酶n n ) - 北京房山酶制剂厂 北京房山酶制剂厂 上海试剂厂 上海试剂厂 宝泰克公司 p h a r m a c i a 进口分装 吉林大学动物实验站 氢氧化钠、硼酸、乙醇、盐酸、甘油、甘氨酸、氯化铁、 水浴恒温振荡器s h z 8 8 电子分析天平s a r t o r i u sb s 2 1 0 s 型 离心机t d l 5 型 旋转蒸发器r e 一5 2 a 消化炉h y p - i i 型 p h s 3 c 精密p h 计 循环水式多用真空泵 凯氏定氮仪 三颈瓶 7 2 1 型分光光度计 磁力搅拌器 粉碎机 核酸蛋白检测仪 冻干机 江苏省金坛市医疗仪器厂 德国赛多利斯股份公司 上海安亭科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 上海纤检仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 郑州长城科技有限公司 天津玻璃仪器厂 天津玻璃仪器厂 上海分析仪器厂 威海宏协化工机械有限公司 江阴市宏达粉体设备有限公司 上海精密仪器仪表有限公司 北京四环科学仪器厂 1 0 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制备及特陛研究 2 3 指标测定 2 3 1 水分的测定 真空干燥法【3 6 】 2 3 2 灰分的测定 高温炉6 0 0 。c 灰化【3 6 i 2 3 3 酶活力的测定 f o l i n 酚法m 1 2 3 4 蛋白质含量测定 微量凯氏定氮法p 8 2 3 5 水解度( d h ) 的测定：t c a 法p 9 1 取l o m l 酶解上清液加入l o m l l o 三氯醋酸( t c a ) 溶液，混合振荡，静止3 0 m i n 后 在4 0 0 0 r p m 离一t j , 3 0 m i n ，取上清液，蛋白质总氮和上清液可溶性氮由凯氏定氮法钡得 d h = ( n ：- - n 0 ( n o - n 0 x 10 0 n 2 ：榛仁蛋白酶酶解上清液中加l o t c a 可溶性氮( r a g ) n l 反应前榛仁蛋白液中加l o t c a 可溶性氮( r a g ) n o ：榛仁蛋白中总氮( r a g ) 2 4 榛仁肽干粉的制备工艺流程： 原料预处理一粉碎一匀浆一水解一灭酶一离心分离一脱苦、脱色、脱臭一脱盐一分离 纯化一浓缩一冷冻干燥一成品 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制备及特性研究 2 5 榛仁蛋白酶解工艺的确定 2 5 1 酶解反应的单元操作 准确称取榛仁分离蛋白，用缓冲液配成一定浓度的蛋自液，经处理，加入一定量 的2 7 0 9 碱性蛋白酶，以o1 m o l l 的n a o h 调至一定p h 值，精确反应一定时f 司( p h 变动范 围士o 1 ) ，到达时间后，调节溶液p h 值n 4 0 ，并在8 5 。c 水浴中维持2 0 m i n ，对酶进行 灭活，然后迅速冷却至室温，在4 0 0 0 r p mf 离一l , 2 0 m i n ，倾倒出上清液，记录总体积， 取一部分上清液测蛋白质含量。 2 5 2 蛋白酶的筛选 25 212 7 0 9 碱性蛋白酶水解试验 以温度t = 4 5 。c ，p h = 1 00 ，底物浓度为5 ，酶浓度为5 ，反应时间为1 h ，进行榛仁 分离蛋白的水解试验。 25 22 木瓜蛋白酶水解试验 以温度t = 5 0 。c ，p h - 7 0 ，底物浓度为5 ， 分离蛋白的水解试验。 2523 菠萝蛋白酶水解试验 以温度t = 4 0 。c ，p h = 60 ，底物浓度为5 ， 分离蛋白的水解试验。 2 5 3 预处理对水解作用的影响 酶浓度为5 ，反应时间为l h ，进行榛仁 酶浓度为5 ，反应时间为1 h 进行榛仁 将榛仁蛋白粉碎后分别过6 0 ，8 0 ，1 0 0 目筛子，水解1oh 。以d h 为指标，确定 最佳的预处理方法。 2 5 4 各因素对水解作用的影响 2 5 4 1 温度对水解反应影响 以p h 9 ，0 ，5 底物浓度，5 酶浓度水解榛仁分离蛋白，分别在 4 0 。c ，4 5 。c ，5 0 。c ，5 5 。c ，6 0 。c 水解1 h ，测其上清液水解度。 吉林农业大学硕士学位论文榛仁肽的制备及特 生研究 2 5 4 2p h 值对水解反应的影响 在水解温度为5 5 。c ，p h 值分别为80 ，85 ，9 0 ，95 ，1 00 的缓冲液中水解榛仁分离蛋白， 其它同上，测其上清液水解度。 2 5 4 3 底物浓度对水解反应的影响 水解温度为5 5 ，p h 值为95 底物浓度分别为l ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 水解 榛仁分离蛋白，其它条件同上，测其上清液水解度。 2 5 4 4 酶浓度对水解作用的影响 水解温度为5 5 。c ，p h 值为95 ，底物浓度为3 ，酶与底物比分别为l ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 水解榛仁分离蛋白，其它条件同上，测其上清液的水解度。 2 5 4 5 时问对酶解作用的影响 在5 5 。c ，p h 值为95 ，底物浓度为3 ，酶与底物比为4 条件下，分别水解 o5 h ，1o h ，2o h ，3o h 、4o h ，5o h ，测其上清液水解度。 2 5 5 蛋白酶水解最佳条件的确定 通过单因素试验得到温度、底物浓度、p h 值、酶浓度等因素对榛仁分离蛋白水 解作用的影响，为进一步优化水解条件，拟通过l 。s ( 4 5 ) 正交试验( 见表1 ) 来确定最佳作 用条件，以d h 为指标，确定榛仁最佳水解工艺参数。 表1 正交试验因素水平 t a b l e1f a c t o r sa n dl e v e l so fo r t h o g o n a lt e s t 吉林农业大学硕士学位论文榛仁肽的制备及特性研究 2 6 水解液的精制1 4 0 i 蛋白质经酶催化降解生成低肽分子以后，其溶解性能得到 明显的改善，在不同 的p h 范围内均高度可溶，但同时疏水性氨基酸也暴露出来，苦味是由于疏水性氨基 酸和味觉细胞发生作用的结果。在完整的球蛋白中，大部分疏水性侧链被包埋在蛋白 质的内部，它们不和味觉细胞接触，因而不会产生苦味。然而，当蛋白质被水解以后， 疏水性氨基酸含量丰富的多肽被释放到溶液中，于是它们便和味觉细胞反应，从而造 成所得到的水解物呈明显的苦味，影响到水解物在食品中的直接应用。在水解的过程 中，为了维持较快的水解速度，使蛋白酶处于较高的活性p h 范围，需不断的加入一 些强酸强碱来调节反应时水解混合物的p h 值，且在水解后，为了灭活酶，调节p h 用 大量的酸。所加入的酸碱转变为相应的盐，其含量要高于人的感觉器官，故得到的水 解物具有一定的成昧。因此，需要利用活性碳及离子交换树脂对水解物进行脱苦及脱 盐处理。 2 6 1 活性碳脱苦处理 将水解液d h 值调为4 5 ，在30 0 0 r m i n 速度下离, 心l o m i n ，取上清液作为待评定 液。脱苦方法：将活性碳按一定比例加入待脱苦的水解液中，用磁力搅拌器搅拌2 0 m i n ， 过滤即可。 感官评定小组由5 人组成，评定员用蒸馏水漱口后，取待评定液2 3 m l 置于口中， l o s 后吐出，漱e l 后取与之苦味程度相近的标准液品尝，如确认两苦味相近，即可将 待评定液的苦味值定为该标准液的苦味值，否则需取其它标准液再尝，直至确定苦味 值，结果取5 人评定值的平均值。 以奎宁为基准物质，按l m o g e n s e n 和j a d l e r - n i s s e n 的方法配置标准液，苦味 值的评分标准( 见表2 ) 。当标准液浓度c ( c = 3 1 0 6 m o l l ) 时，刚好无苦味，定c 值为 下限，3 2 c 为上限( 此时若再增加奎宁浓度，苦味基本上不再增加) 1 4 1 o 表2 苦味值评分标准表 t a b l e2 t h es t a n d a r do fb i t t e r n e s sm a r k 吉林农业大学硕士学位论文榇仁肽的制备及特性研究 2 6 2 水解液的脱盐【4 2 取离子交换树脂于水中浸泡处理2 4 h 后装柱，然后分别用1 ：4 h c l 或1 0 n a o h 对其 进行处理，再用水清洗至微酸性或微碱性待用【4 3 1 。 将一定体积的榛仁蛋白水解上清液以1 0 倍柱体h 的流速通过h 型阳离子交换树 酯进行脱钠处理。收集，合并流出液，然后以同样的流速将水解液通过o h 型阴离子 交换树酯至流出液呈弱酸性。收集，合并流出液，并测定其氮含量。同时分析脱盐后 的水解物中粗盐分的含量，以氮回收率，脱盐率评价脱盐过程对氮含量、盐分含量的 影响。 氮含量的测定【“1 ：取5 m l 样品，加入1 0 m l 浓h 2 s 0 4 ，1 5 9 k 2 s 0 4 及l m l l 0 c u s 0 4 后进行消化处理；消化完全后定容至1 0 0 m l ，并取出2 0 m l 进行碱化蒸馏，流出液用2 硼酸吸收后，用00 5 m o l l 的标准h c l 溶液滴定至终点，氮含量以g l 表示。 粗盐分的测定1 4 5 】：取1 0 m l 的样品于已恒重的瓷坩埚中，水浴上蒸发至干，然后 于电炉上加热炭化；炭化完全后于茂福炉中5 5 0 。c 灼烧至残渣呈浅灰色为止；用热蒸 馏水滤入2 5 0 m l 容量瓶中，洗至无氯离子存在为止( 即取滤液2 - 3 滴，加l 滴a g n 0 3 ，至 无a g c l 沉淀生成) 定容至刻度。粗盐分含量以g ，l 表示。 2 6 3 浓缩 将水解液在旋转蒸发器上真空浓缩。由于水解液具有良好的起泡性，所以应严格 控制浓缩液的温度、压力、浓度。 2 6 4 冷冻干燥 将浓缩水解液经预冷，经冻干机冻干。 2 7 榛仁肽的理化性质分析 2 7 1 感官性质评定 感官评定榛仁多肽的颜色、味道、气味等。 吉林农业大学硕士学位论文 榛仁肽的制备及特性研究 2 7 2 溶解度的测定 蛋白质溶解性是指蛋白质在水溶液或食盐溶液中溶解的性能，其溶解程度称为溶 解度，平时所说的溶解性一般指水溶性。蛋白质的溶解度常用氮溶解度指数i t r o g e n s o l u b i l i t yi n d e x ，简称n s i ) 表示，n