（发酵工程专业论文）产朊假丝酵母生产谷胱甘肽过程控制与优化.pdf

摘要 摘要 谷胱甘肽( g s h ) 作为一种具有丫谷氨酰基和巯基的生物活性三肽，是由谷氨 酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成。g s h 可清除胞内超氧物因离子和自由基，保护 细胞膜的完整性，具有抗脂质氧化作用，使细胞免受伤害，从而维持细胞正常代 谢。因而，g s h 在食品、医药、保健、抗衰老方面的应用日益广泛。 与其他生产g s h 的方法( 活性组织提取、化学合成和酶转化法) 相比较，微 生物发酵法是目前g s h 工业化生产的最普遍方法之一。本论文以一株高积累g s h 的产朊假丝酵母( c a n d i d au t i l 西w s h0 2 0 8 ) 为出发菌株，以实现g s h 发酵高产 量、高得率和高生产强度为目标，采用增加细胞密度( 流加培养) 、提高胞内g s h 含量( 前体氨基酸添加、a t p 再生) 以及环境胁迫等一系列技术与策略，对g s h 发酵过程进行优化控制，主要研究内容如下： ( 1 ) 考察了分批培养、指数速率流加和恒速流加对细胞生长和g s h 合成的影 响，并提出了三阶段( 分批培养、指数速率流加和恒速流加) 细胞高密度培养策 略。分批培养时初糖( 葡萄糖) 浓度为1 5e , m ，发酵9h 时葡萄糖消耗完毕，经过 1 2 h 指数速率流加( 比生长速率为0 2h 。1 ) ，和2 4h 恒数流加( 补糖速度为5 5g l 1 1 ) ， 发酵培养4 5h 后，细胞密度达1 0 2e , m ，g s h 浓度为9 8 1m g l 。 ( 2 ) 在细胞高密度培养基础上，考察了半胱氨酸添加对g s h 合成的影响，一次 性添加半胱氨酸为5 0m m o l l 时，g s h 产量达最大值1 5 3 4m g l ；由于胞内g s h 的大量积累会对谷氨酰半胱氨酸合成酶( g s hi ) 活性产生反馈抑制作用，因而进一 步考察低p h 胁迫与半胱氨酸添加相结合对g s h 合成的影响，将5 0m m o l l 半胱 氨酸分两次( 每次2 5 m m o l l ) 添加并与低p h 胁迫结合促进g s h 合成，最终g s h 总产量达1 8 2 5m g l 。 ( 3 ) 当半胱氨酸添加量为5 0m m o l l 时，发现用于g s h 合成的半胱氨酸仅为其 添加量的4 ，为此，考察了溶氧对半胱氨酸吸收和g s h 合成的影响，并提出了 两阶段溶氧水平控制与半胱氨酸添加相结合的策略来促进g s h 合成，结果半胱氨 酸的添加量由5 0m m o l l 减少到3 0m r n o l l ；添加量降低了4 0 ，而g s h 产量却 达到1 7 3 4m g l ，比对照提高了1 3 。最后将p h 胁迫和溶氧控制同时与半胱氨酸 添加( 添加浓度为3 0r e t o o l l ) 相组合，通过低p h 胁迫和两阶段溶氧控制，g s h 终 产量达1 9 3 6m g l ，比对照提高了2 6 。 ( 4 ) 研究摇瓶条件下细胞生长阶段谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸对细 胞生长和g s h 合成的影响，与添加谷氨酸和半胱氨酸相比，添加甘氨酸对细胞生 摘要 长和g s h 合成均有促进作用，当2h 时添加6m m o l l 甘氨酸，发酵到第1 0h 时， 细胞密度和g s h 产量达1 0 4 1g l 和1 2 5m g l ，分别比对照提高了1 0 1 和3 4 1 。 ( 5 ) 细胞停止生长后，加入三种氨基酸，并通过c e n t r a l c o m p o s i t e 实验优化得 到三种氨基酸最佳浓度配比( 谷氨酸6m m o l l 、甘氨酸5 5m m o l l 、半胱氨酸6 5 m m o l l ) ，经过3 0h 培养，g s h 总产量达2 7 8 m g l 。两阶段氨基酸添加使细胞干 重和g s h 产量达到1 0 4g l 和2 7 8m g l ，将此策略应用于7l 罐上，细胞干重和 g s h 产量分别为1 2 8 1 9 l 和3 2 8m g l ，进一步将两阶段氨基酸添加策略与细胞高 密度培养相结合时，最终g s h 产量可高达1 9 5 2m g l ，胞内g s h 含量为1 8 1 。 ( 6 ) 在两阶段氨基酸添加基础上，考察了发酵后期胞内前体氨基酸浓度、a t p 含量和g s hi 活性变化，发现g s h 停止合成的主要原因是由于a t p 不足所致。 通过添加a t p 促进g s h 继续合成，当a t p 添加量为3g l 时，g s h 总产量达2 1 4 1 m g l ：细胞进一步经s d s 处理后，a t p 添加量为2g l 时，g s h 总产量可达2 1 5 3 m g l ，而a t p 用量则可减少3 3 ；此外，通过补加葡萄糖和硫酸铵再生a t p 促 进g s h 合成，结果g s h 总产量为2 1 6 3m g l ，与直接添加a t p 相比，成本显著 下降，说明该策略具有很好的实用性。 ( 7 ) h 2 0 2 胁迫对g s h 合成影响结果表明，h 2 0 2 可促进g s h 合成但同时又会抑 制细胞生长，为此提出在细胞生长期添加低浓度h 2 0 2 和细胞停止生长时添加高浓 度h 2 0 2 的h 2 0 2 多次( 6h 添加1m m o l lh 2 0 2 、8h 添加2m m o l lh 2 0 2 、1 0h 添 加4m m o l lh 2 0 2 ) 胁迫策略，摇瓶分批发酵结束时( 3 0h ) ，g s h 产量为1 8 8m g l ， 胞内g s h 含量达2 0 5 。将此策略应用于7l 罐上，发酵3 0h 时细胞干重和g s h 产量分别为1 0 2 1 9 l 和2 5 8m g l ，进一步将此策略应用于7l 罐上和细胞高密度 培养相结合，发酵结束( 6 0h ) 时，g s h 产量高达1 4 8 2m g l ，胞内g s h 含量为 1 5 2 ，分别比对照提高了3 2 和3 8 。同时，h 2 0 2 胁迫使胞内过氧化氢酶和g s h 还原酶活性明显增强，说明c a t 和g s h 直接参与了清除胞内h 2 0 2 和其它活性氧 离子。 ( 8 ) 对n a 2 s 0 4 胁迫促进g s h 合成机理进行初步探讨，结果表明n a 2 s 0 4 胁迫可 使胞内半胱氨酸含量、g s hi 酶活性、g s h 还原酶( g r ) 活性显明提高，进而促进 g s h 合成。 关键词：谷胱甘肽，产朊假丝酵母，发酵过程优化，细胞高密度培养，氨基酸 添加，a t p 再生，环境胁迫 a b s t r a c t a b a t r a c t g l u t a t h i o n e ( g s h ) ，a sa l la c t i v et r i p e p t i d e ，c a l lb eb i o s y n t h e s i z e df r o ml - g l u t a m i c a c i d ，l - c y s t e i n ea n dg l y c i n ec a t a l y z e dc o n s e c u t i v e l yb y7 - g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h a s e ( g s hi ) a n dg l u t a t h i o n es y n t h a s e ( g s hi i ) i nt h ep r e s e n c eo fa t eg s hp l a y sm a n y i m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lr o l e si nl i v i n gc e l l s ，s u c ha sc l e a ra c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n d f r e er a d i c a l ，p r o t e c ti n t e g r i t yo fc e l lm e m b r a n ea n dd e l a yo x i d a t i o no ff a ta c i d s a sa r e s u l t ，t h ed e m a n df o rg s h i nt h ef i e l d so ff o o di n d u s t r y , c l i n i c a lm e d i c i n e ，h e a l t hc a r e a n da n t i a g i n gi se v e r - i n c r e a s i n ga n de x p a n d i n g c o m p a r e dw i t ho t h e rm e t h o d s ，f e r m e n t a t i v eg s hp r o d u c t i o ni sc o n s i d e r e da sa n e f f i c i e n ta n dp r a c t i c a la p p r o a c h i nt h i sp a p e r , c a n d i d au t i l b pw s h0 2 - 0 8 ，as t r a i nt h a t c a na c c u m u l a t eh i g hc o n c e n t r a t i o no fg s h i n t r a c e l l u l a r l y , w a su s e df o rg s hp r o d u c t i o n a c c o r d i n gt ot h ep r i n c i p l e so ff e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n , as e r i e so f f e a s i b l ea p p r o a c h e s o rs t r a t e g i e sw e r ea c h i e v e dt om a x i m i z eg s hp r o d u c t i o nd u r i n gt h ep r o c e s s e so f o p t i m i z a t i o no fc u t i l i sw s h 0 2 - 0 8c u l t i v a t i o n t h em a i nc o n t e n t so ft h i sd i s s e r t a t i o n a r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) e f f e c t so fd i f f e r e n tc u l t i v a t i o nw a y so ne e l lg r o w t ha n dg s hp r o d u c t i o nw e r e i n v e s t i g a t e di nh i g he e l ld e n s i t y ( h c d ) c u l t i v a t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a l i n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a s15 9 lf o rb a t c hc u l t u r e o p t i m a ls p e c i f i cg r o w t hr a t e ( “) w a s0 2h - 1f o re x p o n e n t i a lf e e d i n g ，a n do p t i m a lr a t ew a s5 5 9 l hf o rc o n s t a n t f e e d i n g b ya p p l y i n gt h r e e s t a g eo p e r a t i o nm o d e ( 9hb a t c hf e r m e n t a t i o ns t a g e ，12h e x p o n e n t i a lg l u c o s e f e e d i n ga n d2 4hc o n s t a n tg l u c o s ef e e d i n g ) ，a f t e r4 5hf e r m e n t a t i o n ， e e l lc o n c e n t r a t i o nr e a c h e s10 2g la n dg s h y i e l di s9 8lm g l ( 2 ) h i 曲c e l ld e n s i t yc u l t i v a t i o ni sp r e f e r a b l ef o ri n c r e a s i n gc e l lc o n c e n t r a t i o n ，b u t i n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n td e c r e a s e dw i t ha ni n c r e a s ei ne e l ld e n s i t y t h e r e f o r e ， s i n g l e s h o ta d d i t i o no fc y s t e i n ew a su t i l i z e dt oi n c r e a s eg s hp r o d u c t i o na t4 5h a st h e g l u c o s ef e e d i n gs t o p p e d r e s u i t si n d i c a t e dt h a ta sc y s t e i n ec o n c e n t r a t i o nr e a c h e s5 0 i n m o 。g s hc o n c e n t r a t i o nr e a c h e st h em a x i m u mo f15 3 4m e c la n dc o r r e s p o n d i n g i n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n ti s1 5 0 ( w w ) a f t e r6 0hc u l f i v a t i o n h o w e v e r a ni n c r e a s ei n i n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n tt r i g g e r e di n h i b i t i o no fg s 胃i as t r a t e g yt h a tc o m b i n e st w o s h o t sc y s t e i n ea d d i t i o n ( 2 5m l n 0 1 lf o re a c ht i m e ) w i t hl o w p hs t r e s sw a sd e v e l o p e dt o f u r t h e re n h a n c eg s h p r o d u c t i o n a n dt h ef m a lg s h c o n c e n t r a t i o nr e a c h e s18 2 5m g l ( 3 ) b a s e do nc y s t e i n e ( 5 0 m m o l l ) a d d i t i o ni na b o v ee x p e r i m e n t ，i tw a sf o u n dt h a t u t i l i z a t i o nr a t i oo fc y s t e i n ef o rg s hp r o d u c t i o nw a sv e r yl o w e f f e c t so fd i s s o l v e d o x y g e n ( d o ) c o n c e n t r a t i o no ng s hp r o d u c t i o n a n dc y s t e i n eo x i d a t i o nw e r e i a b s t r a e t i n v e s t i g a t e da c c o r d i n g l y i tw a ss h o w nt h a tl o w e rd 0c o n c e n t r a t i o nf a v o r sc y s t e i n e a b s o r p t i o nb u tr e t a r d sg s hp r o d u c t i o n h i p e rd op r o m o t e sg s hp r o d u c t i o nb u t f a v o r sc y s t e i n eo x i d a t i o ni nt h eb r o t h at w o s t e pd oc o n t r o ls t r a t e g ya f t e rc y s t e i n e a d d i t i o n i nw h i c hd ow a sc o n t r o l l e da t5 i nt h ef l r s t3ha n dt h e na t2 0 i nt h e f o l l o w i n g 12h ，w a sd e v e l o p e da n dc o m p a r e df o rt h ep o t e n t i a li ne n h a n c i n gg s h p r o d u c t i o na n dc y s t e i n ea b s o r p t i o n a sar e s u l t c y s t e i n ea d d i t i o ni sd e c r e a s e df r o m5 0 m m o 。t o3 0m m o l l ，w h i l eg s h y i e l dr e a c h e s17 3 4m g 1a f t e r6 0hf e r m e n t a t i o n s o ， b yu s i n gt w o s t e pd oc o n t r 0 1s t r a t e g y , a4 0 d e c r e a s ei nc y s t e i n ea d d i t i o na n da13 i n c r e a s ei ng s h p r o d u c t i o na r eo b s e r v e da sc o m p a r e dw i t ht h a tw i t h o u tc o n t r o lo fd o ( 4 ) w h o l ep r o c e s sf o rb a t c hg s hf e r m e n t a t i o nw a sd i v i d e di n t ot w op h a s e so fc e l l g r o w t ha n dg s hs y n t h e s i s a tc e l lg r o w t hp h a s e ，e f f e c t so ft h r e ep r e c u r s o ra m i n oa c i d s o ne e l lg r o w t ha n dg s hp r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e ds e p a r a t e l y g l u t a m i ca c i ds h o w s a l li n s i g n i f i c a n te f f e c to np r o m o t i n gc e l lg r o w t ha n de n h a n c i n gg s h p r o d u c t i o n ；a l s o ， c y s t e i n ei n c r e a s e sg s h c o n t e n tr e m a r k a b l yb u ti n h i b i t se e l lg r o w t hn o t a b l y c o m p a r e d t og l u t a m i ca c i da n dc y s t e i n e ，g l y c i n ec a np r o m o t ec e l lg r o w t ha sw e l la se n h a n c e i n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n ts i g n i f i c a n t l y a t2hw i t h6m l t i o i lg l y c i n ea d d i t i o n ，d c w a n dg s h y i e l dr e a c ht h eh i g h e s tv a l u eo f10 41g la n d12 5m e g l ，w h i c ha r e10 1 a n d 3 4 1 h i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 ( 5 ) m o r e o v e r , am i x t u r eo fg l u t a m i ca c i d ，g l y c i n ea n dc y s t e i n ew a sa d d e da t12ha t s t a t i o n a r yp h a s eo fc e l lg r o w t h t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o n so ft h r e ea m i n oa c i d s ( g l u t a m i ca c i d6m m o l l ，g l y c i n e5 5m m o l l ，c y s t e i n e6 5m m o l l ) w e r eo b t a i n e db y r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w i t ht h et w o s t e pa d d i t i o ns t r a t e g y ，b i o m a s sa n d g s hy i e l dr e a c h e d10 41e e la n d2 7 7 9 m g li nf l a s ke x p e r i m e n t sa f t e r3 0h f e r m e n t a t i o n ，i n c r e a s e db y1 0 1 a n d1 2 9 8 ，r e s p e c t i v e l y ，雏c o m p a r e d 澌t 1 1t h e c o n t r o lw i t h o u ta m i n oa c i d sa d d i t i o n b ya p p l y i n gt h i sa m i n oa c i d sa d d i t i o ns t r a t e g yt o b a t c hf e r m e n t a t i o ni n7lf e r m e n t o r ，g s hy i e l dr e a c h e s3 2 8 1m g lm g l ，w h i c hi s 118 7 h i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 m o r e o v e r ，f u r t h e ra p p l y i n gt h i ss t r a t e g yt oh c d c u l t i v a t i o n ，a f t e r6 0hf e r m e n t a t i o n ，ag s hc o n c e n t r a t i o no f19 5 2m e g li sa c h i e v e da n d c o r r e s p o n d i n gi n t r a c e l l u l a rg s h c o n t e n ti s1 81 ( 6 ) a c c o r d i n g t ot w o s t e pa m i n oa c i d sa d d i t i o ns t r a t e g ym e n t i o n e da b o v e ， c o n c e n t r a t i o n so fi n t r a c e l l u l a ra t pa n dt h r e ea m i n oa c i d sa n dg 娜ia c t i v i t yw e r e d e t e r m i n e dd u r i n gt h ep e r i o do f4 5ht o6 0h r e s u l t si n d i c a t e dt h a tc e s s a t i o no fg s h p r o d u c t i o na t6 0hw a sc a u s e db ya t ps h o r t a g ea n dd e c r e a s ei ng s 日i h o w e v e r c o m p a r e dw i t hd e c r e a s ei n 伽ia c t i v i t y ，a t ps h o r t a g ea c c o u n t sf o ral i o ns h a r eo n i n h i b i t i n gg s hp r o d u c t i o n s oas t r a t e g yo fc o m b i n i n ga d d i t i o no fa m i n oa c i d sa d d i t i o n 、i t i la t pw a sd e v e l o p e dt of r r t h e re n h a n c eg s hy i e l da si t sp r o d u c t i o ns t o p p e da t6 0h i v a b s t r a c t w i t l l3g la t pa d d i t i o na t6 0h ，a f t e r7 2hc u l t i v a t i o n ，g s hy i e l dr e a c h e s2141m g n a n dc o r r e s p o n d i n gi n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n ti s1 9 8 ( w w ) b yf u r t h e rt r e a t i n gt h e c e l l sw i t hi o n i cs u r f a c t a n t st oi n c r e a s ee e l lo s m o s i sf o ra t pa b s o r p t i o n ，ag s hy i e l do f 215 3m g li sa c h i e v e db ya d d i n g2g ua t p m o r e o v e r ，b yf e e d i n gs u i t a b l e c o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s ea n d 州h 4 ) s 0 4f o ra t pr e g e n e r a t i o nt os y n t h e s i z eg s h ，g s h y i e l dr e a c h e s216 3m g l ，s u g g e s t i n gt h ea p p l i c a t i o no f a b o v es t r a t e g ya sb e i n gf e a s i b l e ( 7 ) e f f e c to fh 2 0 2 一i n d u c e do x i d a t i v es t r e s so ng s hp r o d u c t i o nw a si n v e s t i g a t e d r e s u l t si n d i c a t e dt h a th 2 0 2c a l le f f e c t i v e l ys t i m u l a t eg s ha c c u m u l a t i o nb u ti n h i b i tc e l l g r o w t hs i m u l t a n e o u s l y s oan o v e ls t r a t e g yo fm u l t i p l eh 2 0 2s t r e s s e sw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 1m m o l la t6 h ，2m r n o l la t8 h ，a n d4m m o l la t10h ) w e r ed e v e l o p e d t om a x i m i z eg s hp r o d u c t i o n a sar e s u l t ，am a x i m a lg s hy i e l do f18 8m g lw a s a c h i e v e da n dac o r r e s p o n d i n gi n t r a c e l l u l a rg s hc o n t e n tw a s2 0 5 b ya p p l y i n gt h i s s t r a t e g yt o7lf e r m e n t o r , g s hy i e l da n di n t r a c e l l u l a rg s h c o n t e n tw e r e2 58m g la n d 2 5 3 f u r t h e ra p p l y i n ga b o v es t r a t e g yt oh c dc u l t i v a t i o n ，a f t e r6 0hf e r m e n t a t i o n ，a g s hc o n c e n t r a t i o no f14 8 2m g li sa c h i e v e da n dc o r r e s p o n d i n gi n t r a c e l l u l a rg s h c o n t e n ti s1 5 2 m o r e o v e r , i n c r e a s e da c t i v i t i e so fc a t a l a s e ( c a t ) a n dg s hr e d u c t a s e ( g r ) i n d i c a t e dt h a tg s ha n dc a tw e r ed i r e c t l yi n v o l v e di np r o t e c t i n gc e l la g a i n s t o x i d a t i v es t r e s sb yh 2 0 2 ( 8 ) a l s o ，i m p a c to fn a 2 s 0 4s t r e s so ng s hp r o d u c t i o nw a ss t u d i e d r e s u l t ss h o w e d t 1 1 a tn a 2 s 0 4c a r le n h a n c eg s hp r o d u c t i o nr e m a r k a b l yb u ti n h i b i te e l lg r o w t ha tt h e s a m et i m e m o r e o v e r , t h ek e ys u b s t a n c e sa n de n z y m e sr e l a t i v et og s h p r o d u c t i o nw e r e d e t e r m i n e da n dr e s u l t si n d i c a t e dn a ：s 0 4s t r e s sc a nl e a dt oas i g n i f i c a n ti n c r e a s ei n c y s t e i n ec o n t e n ta n da c t i v i t i e so f 伽ia n dg & e x p l a i n i n gt h er e a s o nf o re n h a n c e m e n t o fg s hp r o d u c t i o nb yn a 2 s 0 4s t r e s s k e y w o r d s ：g l u t a t h i o n e ( g s h ) ，c a n d i d au t i l b a ，f e r m e n t a t i v ep r o c e s so p t i m i z a t i o n ， h i g hc e l ld e n s i t y ( h c d ) c u l t i v a t i o n ，p r e c u r s o ra m i n oa c i d sa d d i t i o n ，a t pr e g e n e r a t i o n ， e n v i r o n m e n t a ls t r e s s v 附录 英文缩写与中文名称对照 1 0 l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本 人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意 签名： 黜日期：2 翌塑：2 ：! 仝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 黎鲴逸丝塑：2 ：2 导师签名：立壶型全坐 日 期： 巡：z ! 乞 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 1 1 1 谷胱甘肽的性质及分布 谷胱甘肽，即丫l 谷氨酰l 半胱氨酰甘氨酸( 丫l g l u t a m y l l c y s t e i n y l g l y c i n e ， g l u t a t h i o n e ) ，是由l 谷氨酸、l 半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具 有丫谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。作为生物体内的非蛋白巯基化合物， 谷胱甘肽主要有还原型( g s h ) 和氧化型( g s s g ) 两种形态，在机体中大量存在并起主 要作用的是还原型谷胱甘肽。g s s g 可以由谷胱甘肽还原酶( g r ) 还原成g s h ， 该酶为黄素蛋白，它能利用n a d p h 作为电子供体【l 】。由于g s h 还原酶的存在， 使得g s h 主要以还原形态存在，因此，正常情况下细胞中g s h 与g s s g 的比例 约为1 0 0 ：1 1 2 l 。酵母细胞中氧化型和还原型谷胱甘肽之间的相互转化过程可用图1 1 来表示【3 1 。 f r e e r a d i c a l s c e l l u l a r 明日秒 图1 - 1 酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程 f i g 1 - 1r e c y c l i n go fg l u t a t h i o n ei ny e a s tc e l l s 除g s s g 以外，g s h 还能以其它二硫键，例如g s s c o a ，g s s c y s 和g s s 蛋白等形式存在【4 】。 g s h 作为细胞中最丰富的小分子硫醇类化合物，其结构特点是分子中含有一 个特殊的丫肽键：由l 谷氨酸的丫c o o h 与l 半胱氨酸的a n h 2 缩合而成，它不同 于蛋白质分子中的普通肽键【5 】。g s h 的分子量为3 0 7 3 3 ，熔点1 8 9 0 c 1 9 3 0 c ( 分解) ， 等电点为5 9 3 ，比旋光度为【仪】d 2 5 - - 1 9 0 ( c = 4 6 5g l ，h 2 0 ) ，晶体呈无色透明细长 柱状。它易溶于水、稀醇、液氨和n ，n 二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等 有机溶剂。g s h 固体较为稳定，但其水溶液在空气中极易被氧化成g s s g 。g s s g 是由两分子g s h 经氧化脱氢而形成的以二硫键连接的二聚体，一般以水合物的形 式存在，熔点1 7 8 0 c 1 8 2 0 c ，比旋光度为 仅】d 2 0 = 1 0 8 。( c = 2 0g l ，h 2 0 ) ，分子量为 6 1 2 6 3 ，是一种溶于水的白色晶体【6 1 。g s h 在水溶液中的构象存在分子内氢键，而 江南大学博士学位论文 g s s g 无此现象发生1 7 j 。 谷胱甘肽在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物体内，其中以酵母、小 麦胚芽以及人和动物肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较为丰富，许多植物 如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类等也含有一定量g s h 悼j 。动物细胞中g s h 主要 起着巯基缓冲剂的作用，人体血液中g s h 的正常浓度为3 7 1m e c l ，肝脏、肾脏是 g s h 主要的合成、代谢和排泄器官【9 1 。另外，g s h 还可以在红细胞中合成且都以 还原形态存在【1 0 d 。 1 1 2 谷胱甘肽的功能及应用前景 g s h 在生物体内有着多种重要的生理功能，大致可概括为三个方面，如抗氧 化、免疫调节和解毒【1 2 】。第一，g s h 对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着 至关重要的作用【1 3 i 。g s h 作为一种重要的抗氧化剂，可清除体内自由基，保护 d n a 、蛋白质和其它生物分子抵抗氧化破坏，防止机体衰老等。第二，临床实验 结果表明，g s h 可以迅速增强机体的免疫力，人体内g s h 增加后对消化系统、呼 吸系统和新陈代谢等都有很大帮助。第三，g s h 还被用于与其它物质组合构成治 疗或保健药物，如以高剂量与治疗肿瘤的药物配合使用，可以防止这些药物对肝 脏和肾脏的毒性：与维生素g 一起服用，可防止空气污染和紫外照射诱发肿瘤等 1 4 - 1 5 】。近年来还发现g s h 具有抑制艾滋病病毒的功效【1 6 】。随着人们对g s h 研究 的不断深入，g s h 在医药及临床领域内还会有更多的用途。 g s h 具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。日本等国家在2 0 世纪五十年代就开始将g s h 作为生物活性添加剂并积极开发应用在保健食品的生 产中【1 7 1 ，而我国对g s h 的研究起步相对较晚，在食品方面的应用还处于起始阶段。 作为一种抗氧化剂，g s h 具有昂贵的市场价格，目前还没有能在食品加工领域中 得到广泛应用。但是，由于g s h 在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它的 应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂【l 引。因此，在价格下降的前提 下，采用g s h 作为食品抗氧化剂是食品加工业的发展趋势之一。根据相关文献报 道，g s h 作为一种多功能生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广， g s h 的需求量正日益增大。显然，g s h 在2 1 世纪将有一个极其巨大的需求市场。 1 2 生物法合成谷胱甘肽研究动态 1 2 1 谷胱甘肽生产的历史概况 早在1 8 8 8 年，法国科学家d er e y p a h l a d e 就在面包酵母的乙醇萃取物中首先 发现了谷胱甘肽，将其命名为p h i l o t h i o n ；1 9 2 1 年，英国生化学家h o p k i n s 从酵母 抽提物中分离得到了谷胱甘肽并正式命名为g l u t a t h i o n e l l 9 】；其后，经过化学分析、 2 第一章绪论 酸碱滴定、降解与合成等方面研究工作，谷胱甘肽的化学分子结构才最终被确定。 自h a r i n g t o n 和m e a d 2 0 1 首先化学合成得到g s h 以来，国内外学者围绕g s h 的生产开展了大量的研究，概括来说，目前g s h 的生产方法主要有溶剂萃取法、 化学合成法、酶转化法和发酵法。萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有g s h 的动植物组织中进行g s h 的分离提取，由于原料不易获得且g s h 在组织中的含 量极低，制取的g s h 纯度和收率不高，因此该法的实际应用价值不大。化学合成 法生产g s h ，是将l g l u 、l c y s 和g l y 经过一系列化学