（生物化学与分子生物学专业论文）广西黑叶猴trachypithecus+francoisi遗传多样性研究.pdf

i 广西黑叶猴广西黑叶猴(trachypithecus francoisi)遗传多样性研究遗传多样性研究 作者姓名：朱 兵 指导老师：黄乘明 教授 周歧海 副教授 学科专业：生物化学与分子生物学 研究方向：分子生态学 年级：2005 级 中文摘要中文摘要 黑叶猴(trachypithecus francoisi)为灵长目(primates)猴科(ceropithecidae)疣猴 亚科动物，主要分布在中国和越南，为世界濒危和国家一级保护动物。广西作为 黑叶猴在中国的主要分布区之一，黑叶猴的数量在近 30 年急剧下降，栖息地破 碎化十分严重，保护形势不容乐观。深入了解黑叶猴各地理种群的分子变异及遗 传水平现状，可以为黑叶猴保护提供重要的依据。本文以黑叶猴的粪便为实验材 料，以线粒体 dna 分子标记为研究对象，对采自广西和贵州的 145 个粪便样品 （其中 142 个样品来自广西的龙州，大新，隆安，扶绥 4 个县）的线粒体 dna 控制区的部分序列的一级结构进行测定， 依据测序结果对广西黑叶猴的遗传结构 进行初步分析，并对采样和实验工作中遇到的一些问题进行了初步探讨。主要研 究结果如下： （1）本次实验共使用了 145 个样品，最后有 110 个样品的测序结果可以用于 分析研究，黑叶猴的粪便样品的扩增成功率为 75.86%。 （2）本次分析的广西黑叶猴样品的 mtdna d-loop 的长度为 395bp，并且有 16 种单倍型，43 个变异位点。 （3）在广西 4 个黑叶猴地理种群中，龙州（gx-lz）种群的单倍型和多态位 点最多，单倍型间核苷酸差异平均数最大。 （4）在大空间尺度上，来自贵州和广西的黑叶猴单倍型严格聚类，但在小 空间尺度上，来自各县的单倍型在系统树中呈镶嵌分布。 （5）通过对全部单倍型进行网络关系分析，我们发现各单倍型间的变异位 点数为：1-32 个。 我们建议：龙州县黑叶猴种群携带的遗传信息较为丰富，为了能更好的保护 黑叶猴的基因多态性，应将龙州县的黑叶猴种群列为最优先保护的单元；讨论迁 地保护的可行性，加强种群间的基因交流。 关键词：关键词：黑叶猴(trachypithecus francoisi) 粪便分子生物学 线粒体 dna 控制区(d-loop) 遗传结构 变异位点 ii the study on genetic diversity of the francois langur (trachypithecus francoisi) in guangxi province,china auther:zhu bing supervisor: professor huang chengming associate professor zhou qihai majority: biochemistry and molecular biology direction: molecular ecology grade:2005 abstract francois langur (trachypithecus francoisi) has been defined the first-class national protected species in china and endangered-class in the world.it distributes restrictedly in the southwest of china and northern vietnam. guangxi province is one of the main distribution area of the francois langur in china,but their habitat fragmentation seriously destroy and the population size declines every quickly in guangxi.therefore understanding the morphologicaland molecular variation of different geographic group of francois langur is every important for us designing conservation strategies.we used faecal samples to investigate their mitochondrial dna, and 142 samples were came from the counties of longzhou,daxin,longan, fushui in guangxi and 3 were came from guizhou.we used the sequence data of control rigion to investigate the current status of population genetic structure of francois langur in guangxi.the results show : (1)only 110 samples could used to analyse,the success ratio of pcr amplification was 75.86%. (2)the length of the d-loop of mtdna genome from faecal samples was 395bp,43 sites were polymorphic,16 haplotypes were identified. (3)among the francois langur population of four geographical groups,the longzhou group have higher haplotype higher numbere of base differences, average number of nucleotide difference. (4)in short distance no obvious phylogenetic structure among haplotypes was found for samples of different origins,but in long distance the phylogenetic structure was found for samples of different area. (5)the network shows that the number of the variable sites between haplotypes is 1-32. iii based on these results,we suggest that,in term of protecting gene diversity of francois langur in guangxi we propose classifying the longzhou group as the unit of high priority protection in the future.and enhance the scotch cousin intercommunion of different groups,sometimes we must use ex-situ conservation. keywords: francois langur (trachypithecus francoisi) molecular scatology mitochondrial dna control region(d-loop) genetic structure variable site 论文独创性声明论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下进行 的研究工作及取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 含其他个人或其他机构已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究 作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担 本声明的法律责任。 研究生签名： 日期： 论文使用授权声明论文使用授权声明 本人完全了解广西师范大学有关保留、使用学位论文的规定。 广西师范大学、中国科学技术信息研究所、清华大学论文合作部，有 权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容 相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以 公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。论文的公布（包括刊登） 授权广西师范大学学位办办理。 研究生签名： 日期： 导 师签名： 日期： 1. 黑叶猴 2. 休息时的黑叶猴群 3. 广西黑叶猴的栖息环境喀斯特石山（远景） 4. 广西黑叶猴的栖息环境喀斯特石山（近景） 5. 黑叶猴的夜宿地 （图中褐色部分为黑叶猴排泄痕迹） 6. 广西师范大学生态学研究组位于龙州弄岗国家自然 保护区的野外科研基地 1 2 3 4 5 6 1 第一章第一章 文献综述文献综述 过去的 100 年是人类历史上知识和财富飞速增长的黄金时期， 人类的活动范 围触及地球的每一个角落，对自然的干扰越来越多、越来越强。生物的自然栖息 地被人类活动的痕迹割裂得支离破碎。科学家们据此推断，地球正面临第六次生 物大灭绝。据统计，因为人类的干扰，使鸟类和哺乳类动物灭绝的速度提高了 100 倍到 1000 倍。现在全世界每天有 75 个物种灭绝，每小时有 3 个物种灭绝。 据估计现有物种的灭绝速率是化石记录上的 4-5 倍12。美国杜克大学著名生物 学家斯图亚特皮姆认为，如果物种以这样的速度减少下去，到 2050 年，目前 的四分之一到一半的物种将会灭绝或濒临灭绝。 1.1 保护生物学与保护遗传学保护生物学与保护遗传学 1.1.1 保护生物学保护生物学 严酷的事实，科学的发展，使人们终于认识到：保护物种及生物多样性其实 就是在保护人类自己34。在人们的期盼与呼唤中，一门新兴的学科保护生 物学(conservation biology)诞生了。保护生物学的主要研究内容有:（一）研究人 类对生物多样性的影响； （二）研究防止物种灭绝的有效途径5-7。 1.1.2 保护遗传学的定义和研究内容保护遗传学的定义和研究内容 20 世纪 70 年代以后，由于分子生物学、群体遗传学和生态学等学科的迅猛 发展， 保护遗传学(conservation genetics)成为一门新兴的独立学科89。 2000 年， 国际性专业期刊conservation genetics在荷兰创刊，标志着保护遗传学的逐步 成熟。 根据 woodruff 的定义，保护遗传学即是运用遗传学的原理和研究手段，以 生物多样性尤其是遗传多样性的研究和保护为核心的一门新兴学科1011。保护 遗传学的主要研究目标是保护物种遗传多样性(genetic diversity)和保持物种进化 潜力(evolutionary processes)12。其研究内容主要包括种群遗传结构(population genetic structure)、近亲繁殖(inbreeding)、遗传变异(genetic variation)、基因流 (gene flow)、杂交(hybridization)、迁移(migration)、亲系关系(kinship)、有效种 群大小(effective population size)、种群的亚分化(population subdivision)以及进化 显著单元(evolutionary significant unit, esu)的确定等方面。 1.1.3 保护遗传学常用的技术和方法保护遗传学常用的技术和方法 随着生物学，尤其是遗传学和分子生物学的发展,越来越多的研究方法被应 2 用到保护遗传学研究，它们主要分为 4 种：形态学法、染色体法、等位酶法以及 dna 分子标记。 在保护遗传学研究中我们经常使用的技术和方法有： （1）蛋白质电泳技术。 蛋白质电泳技术是在分子生态学的早期研究中起着十分重要的作用。 但是由于等 位酶存有中性进化的疑问13，蛋白质不易变异、进化速率异常缓慢以及采样时 容易对个体造成损伤阻碍了该技术的应用与发展。(2)限制性片段长度多态性。 制性片段长度多态性标记(restriction fragment length polymorphism，简称 rflp 标记)它通过限制性片段长度多态性为核苷酸多态分析提供了有力的工具，它的 核心是限制性内切酶的广泛应用。 （3）southern 杂交技术。该类技术包括许多 dna 指纹技术、sine 等。 （4）基于克隆及 dna 测序技术。这类技术主要包括： 单核苷酸多态性(single nuleotide polymorphism，简 snp 标记)、序标位(sequence tagged sites， 简称 sts 标记)、 序列特征化扩增区域(sequence charactered amplified region，简称 scar 标记)以及基于线粒体 dna 的直接测序技术。 （5）基于聚合 酶链式反应 pcr 的技术。随着 pcr 技术的完善和发展，它已经成为保护遗传学 家手中最有力的武器，它比以前建立在杂交基础上的技术更简单。pcr 的四个 特点是：快捷、简单、非损伤和非常高的特异性扩增效率（35 个循环后一般可 将目标产物扩增 1106倍） 。目前 pcr 技术已经广泛的应用于分子生态学研究 中,如 rapd、vntr、aflp、ssr、pcr-rflp。 1.2 非损伤性取样与粪便分子生物学非损伤性取样与粪便分子生物学 1.2.1 非损伤性取样非损伤性取样 保护遗传学研究需要大量的实验样品，尤其是用于遗传分析的 dna 样品， 常规的取样方法有 3 种：伤害取样；非伤害性取样；非损伤性取样14。 前 2 种方法都或多或少的会对动物尤其是珍惜濒危动物造成伤害和影响。 特别是 在对野生动物的研究中前 2 种方法可行度也不高。 许多野生动物不但对人类相当 警觉 ,而且研究者难以接近它们的栖息地，因此要捕获它们不容易，而濒危动物 由于其数量稀少，要对它们进行精确定位就更不容易，更不用说捕获后采样。非 损伤性取样法(noninvasive sampling)是指在不伤害或触及研究对象的前提下，通 过各种方式收集被研究对象脱落的羽毛或毛发、 尿液、 粪便、 口腔脱落细胞、 角、 鳞片、陈旧皮张等不同形式的分析样品进行遗传分析的一种取样方法14。随着 非损伤性取样法的不断发展、成熟，它已经被许多研究者广泛提倡和接受1415。 1.2.2 粪便分子生物学粪便分子生物学 得益于行为学和生态学研究者们的出色工作， 分子生态学家发现动物排便有 3 着很强的规律性、节律性 , 与其他通过非损伤性取样法采集的样品相比，粪便 样品更易于采集。越来越多的学者在分子遗传学、种群生态学和行为生态等研究 领域把粪便作为研究材料1617。一门新兴的学科呼之欲出，90 年代中期,学者们 将分子生物学的技术与传统的粪便分析方法相结合,诞生了一门以动物粪便为材 料进行多领域研究的学科分子粪便学(molecular scatology)18。分子粪便学 一经诞生，以它的独特性和优势在国际国内得到了一定的发展和应用。1997 年 reed,tollit 等人用微卫星技术对 82 个海豹粪便样品成功地进行了个体识别 19。 方盛国等人以野生大熊猫粪便为材料,应用 dna 指纹技术和微卫星个体识别 技术,准确无误地认定了大熊猫种群数量20。 1.2.3 粪便分子生物学的研究基础粪便分子生物学的研究基础 粪便能够成为分子生物学的研究对象主要原因是： （1）粪便中含有宿主的肠 道上皮细胞。未完全消化的食物残渣是粪便的主要组成部分，这些残渣从肠道经 过时会携带大量的肠道上皮细胞， 学者们通过研究发现每克人的新鲜粪便中含有 大约 1105个人肠道上皮细胞21。另人惊讶的是这些细胞中的大多数在检测时 还具有活性。 （2）粪便中的 dna 分子标记。由于粪便携带着大量的肠道细胞， 自然粪便中含有大量的 ndna(核 dna)和 mtdna(线粒体 dna)，而这 2 种遗传 物质中含有大量的遗传信息和 dna 分子标记。 （3）pcr 技术。pcr 技术是粪便 分子生物学的研究基石和最普遍的研究方法， 几乎所有的粪便分子生物学研究都 要使用 pcr 技术。虽然粪便中含有大量的上皮细胞，但是由于环境和自身性质 的原因，仍然不能直接用于实验研究。而 pcr 技术的特点之一是高效率的特异 性扩增，它能在很短的时间内将目标遗传物质从痕量级(10-12g)扩增到可用于研 究的微量级(10-6g)。 1.2.4 常用的粪便常用的粪便 dna 的提取方法的提取方法 因为粪便成分复杂,除了含有我们研究的目标遗传物质,还含有大量的杂质 如：未完全消化的食物、肠道微生物、消化酶、黏液、胆盐、胆红素等22,食草 动物的粪便中的植物多糖等杂质也能抑制 pcr 反应的进行23。使用常规抽提方 法得到的粪便 dna中存在许多共纯化的dna聚合酶抑制物,它们能够降低pcr 的扩增效率23。因此粪便中的 dna 提取远比组织中 dna 的提取复杂许多。目 前从粪便中抽提 dna 主要使用以下 4 种方法。 （1）试剂盒提取。这种方法的优 点是操作简单，dna 的抽提效率高。缺点是试剂盒价格昂贵，不利于大规模的 使用。 （2）常规提取方法。该方法来自经典的分子技术，原理清晰，如果实验不 顺利可以追根溯源找到实验失利的原因，并改进。常规提取方法费用低，便于在 4 抽提大样本量的粪便样品时使用。缺点是由于使用了 ctab,酚/氯仿等抽体液， 使模板 dna 中含有许多抑制 pcr 扩增效率的杂质，影响了扩增效率。 （3） chelex-100 煮沸法。该方法主要原理是使用螯合剂来抑制 dna 酶的活性。它的 特点是操作简单、方便易行。缺点是螯合剂会引起 dna 大量变性。 （4）硫氰酸 胍裂解法。 高浓度的硫氰酸胍可以使细胞裂解,核酸酶失活,从而有效地抑制 dna 酶的活性,防止dna降解,同时由于高浓度的硫氰酸胍的存在,dna能够直接与硅 质颗粒相结合而与其它物质相分离。 1.3 动物线粒体动物线粒体 dna 简介简介 高等动物惟一的核外遗传物质是 mtdna(mitochondria dna，线粒体 dna)， 它在动物的起源进化、亲缘关系、遗传变异等方面的研究有着广阔应用。几乎所 有的细胞都含有线粒体，但是成熟的红细胞不含线粒体。线粒体多为圆柱形，直 径一般为 0.5-1.0um， 长为 0.5-3.0um。 线粒体在每个细胞中含有 1000-10000 个拷 贝。 尽管 mtdna 在生物总 dna 中的含量低于 1%24， 但在物种不同层次的遗传 分化研究中有着重要的意义。 1.3.1 动物线粒体基因组的基本结构动物线粒体基因组的基本结构 大多数动物线粒体的结构非常简单，呈闭环双链，由 37 个基因和一段长度 可变的非编码序列组成 ,包括 2 种 rrna(16srrna 和 12srrna),22 种 trna(ta、 tr、tn、td、tc、tq、te、tg、th、ti、tl1、tl2、tk、tm、tf、tp、 ts1、ts2、tt、tw、ty、tv)和 13 种蛋白多肽的编码基因。这些多肽的具体 分 布 位 置 为 ： 复 合 体(nadh- 泛 醌 还 原 酶 ) 中 含7个 亚 基 （nd1,nd2,nd3,nd4,nd4l,nd5,nd6)；复合体( 泛醌-细胞色 c 还原酶)中 1 个亚基 cytb；复合体( 细胞色素 c 氧化酶)中有 3 个亚基(co,co,co ) 和 复合体 v(atp 合酶)中的 2 个亚基(atpase6 和 atpase8)。在动物 mtdna 中除编 码区外，还有两段长度可变的非编码区，一段是 mtdna 复制及转录的起点，即 链 复 制 起 始 区 ； 另 一 段 是 控 制 区 (control region) ， 又 称 为 d- 环 区 (displacement-loop region， 简称为 d-loop)， 位于 trna-pro 和 trna-phe 之间25。 近年国内有报道在小鼠 mtdna 中初步发现了新的 r-loop 结构26。 1.3.2 动物线粒体基因组的特点动物线粒体基因组的特点 mtdna 的进化速率快，是单拷贝核基因的 510 倍27。且各部分进化速 率不同，d-loop 区的进化速度最快。分子较小。mtdna 长度有变异。 mtdna 具有相对恒定的信息量。编码结构较稳定。mtdna 核苷酸组成具有 5 不均一性；编码效率高蛋白质编码基因无内含子,基因间分隔常少于 10bp； 两基因间几乎没有空间。mtdna 的基因排列相对稳定。mtdna 遵循严格的 母性遗传方式25。 1.3.3 动物线粒体研究的局限性动物线粒体研究的局限性 尽管动物 mtdna 在分子生态学的研究中由着许多，但是也有它的局限性。 主要表现在以下几个方面：线粒体序列的异质性。祖先多态性。非恒定分 子钟。两性遗传。线粒体 dna 遵循严格的母性遗传方式，不能用于父系研究。 多重替换等。 1.3.4 动物动物 mtdna 的研究内容的研究内容 动物mtdna因其不可替代的优势在进化生物学和保护遗传学研究上已被广 泛的应用，它的主要研究方向为：种群间的亲缘关系研究,并推测它们的起源、 分化和扩散途径 ,以及探讨地理隔离等因素在物种形成中的作用。 张亚平等对 40 只大熊猫的线粒体 trna 及 d-loop 区进行了序列测定，发现大熊猫中虽然群体 间的遗传分化程度很低但在个体间存在着广泛的遗传变异， 他们还发现群体内和 群体间的遗传多样性相差不大28。 作为分子钟来研究亲缘物种间的系统演化 , 研究物种间的亲缘关系、分歧年代和演化过程。目前,这一研究在灵长类29、小 鼠亚属30、马属31以及鱼类32中进展较快。日本学者 hasegawa 等33研究认为, 长臂猿、猩猩、大猩猩、黑猩猩与人类祖先分歧的时间分别为 1330 万、1086 万、 367 万和 268 万年。durand 等34也分别研究了龟和海龟等物种的亲缘关系。 研究物种内的系统演化。brehm 等根据蜥蜴的线粒体核甘酸序列分析了 mabuyaspp、reptilia 和 scincidae 3 个亚种的进化关系35。追踪特异物种的生 活史。johnson 等利用 mtdna 研究山猫(oreailurus jacobita)的进化 36； bermingham 等在热带淡水鱼与中美洲鱼的起源和进化研究中使用了 mtdna 的 分子标记37； hanni 等将 mtdna 应用于洞穴熊(ursus spelaeus)的起源研究38。 1.4 黑叶猴概况和研究进展黑叶猴概况和研究进展 1.4.1 黑叶猴概况黑叶猴概况 黑叶猴(trachypithecus francoisi)为灵长目(primates)猴科(ceropithecidae)疣猴 亚科动物，又名乌猿、黑猴、岩蛛猴、乌叶猴、白颊黑叶猴，成年个体体毛黑色， 体形较瘦，头小尾长，无颊囊，头顶有一撮冠毛，两颊从耳尖至嘴角各有一条白 毛，形似胡须，雌体在会阴区至腹股沟内侧有一块花白斑，略显三角形，这是区 6 别雌雄体的主要外部特征之一。初生的黑叶猴幼体除尾巴灰黑色外，其余体毛金 黄色，大约 1 至 3 个月后逐渐向黑色转变，到一岁左右变为黑色39-42。 黑叶猴主要栖息在喀斯特石山地区的悬崖峭壁上，切割很深的江河、溪流两 岸的崖壁也是它们栖息生活的场所，这些地区的天然岩洞是黑叶猴良好的夜宿 地，相对较好的植被为它们的生活繁殖提供了必要的食物来源和避难地43。黑 叶猴非常擅于攀爬，跳跃，峭壁上的树木和裸露的岩壁是它们主要的活动场所， 主要营家庭式的群居生活，每群 5-17 只，包括 1 成年雄性，几只成年雌性及其 后代4445。 黑叶猴是中国一级保护的珍稀灵长类动物，在热带、亚热带森林生态系统生 物多样性保护中有着十分重要的意义，被国际濒危野生动植物种进出口贸易公 约(cites)列为附录物种，被国际自然与自然资源保护联盟(iucn)红皮书列 为易危种(vu)，中国濒危动物红皮书将其列为濒危(e)39,46。据颁布的“亚洲灵 长类保护行动计划” ，通过濒危程度、分类独特性和与其它濒危灵长类的关系等 3 项指标分析，黑叶猴属 9 级优先保护者，在亚洲叶猴属中是保护等级最高的物 种，主要分布在中国和越南，在中国仅分布在广西、贵州、重庆；国外分布于越 南凉山、大原、北件、宣光省47。 1.4.2 黑叶猴的研究进展黑叶猴的研究进展 自从 pousargues 根据广西西南部龙州的一个标本首次将黑叶猴定名为 semnopithecus francoisi48。 100 多年来， 学者们对黑叶猴研究的研究从未中断过。 国内学者对黑叶猴的研究始于 50 年代，笼养黑叶猴成为人们的首选研究对象。 余振富49首先对黑叶猴的繁殖成功作了研究。70 年代后，广东昆虫研究所、梧 州动物园、南宁西郊动物园相继开展了黑叶猴的驯养和人工繁殖。曾中兴50、 赖月梅51、梅榘年52、朱本仁等53先后研究了笼养状态下黑叶猴的生活习性和 饲养繁殖技术。 与笼养黑叶猴的研究相比， 很少有人将野生黑叶猴作为研究对象。 直到近年， 研究力度才有所加强，蔡湘文54，周歧海55和黄中豪56等对陆续开展野生黑叶 猴的食性，数量分布，种群结构，行为学，生态学等方面的研究工作，积累了许 多宝贵的资料。 随着分子生态学的兴起，王文，张亚平等以笼养黑叶猴和白头叶猴 mtdna 的 nd-4 基因和 d-loop 区为研究对象，证实了白头叶猴为黑叶猴的亚种57。丁 波等对笼养白头叶猴和黑叶猴的 ndna 进行了遗传分析，证明白头叶猴是黑叶 猴的一个亚种且它们之间存在近期的基因交流58。但是有关野生黑叶猴的分子 遗传学研究，无论是在国际还是国内都鲜有报到。 7 1.5 研究内容研究内容 1.5.1 研究对象的选择研究对象的选择 本文选取的研究对象是分布在广西境内的野生黑叶猴种群 （并分析了少数贵 州的黑叶猴样品） 。这是因为： （1）目前我们还没有掌握任何关于广西野生黑叶 猴遗传多样性的研究资料； （2）广西野生黑叶猴保护形式严峻，从事该项研究意 义重大； （3）前人对广西黑叶猴做了许多相关研究，使得该项目具有一定的可行 性。 （4）有关灵长类的分子生态学研究技术已经成熟。 1.5.2 分子标记选择分子标记选择 mtdna 因为由于其独特的优点，在分子进化研究中有许多独特的优越性， 已经分子系统学研究中得到广泛应用， 是研究黑叶猴种群间亲缘关系的好材料 。 所以本文选择黑叶猴 mtdna 的 d-loop 区部分序列作为分子标记。 1.6 研究目的、意义研究目的、意义 生物多样性包括三个主要层次，即生态系统多样性，物种多样性和遗传多样 性。遗传多样性是生物体内决定性状的遗传因子及其组合的多样性，它是生物多 样性的基础和灵魂。任何物种只有具备一定的遗传多样性才能适应自然选择，否 则，灭绝将不可避免2428。遗传变异与环境因子间存在在广泛而普遍的联系和 相互作用，即使仅从哲学的角度来说事物之间的联系也是普遍存在的。那种认为 它们是 2 个相互独立的影响因子的看法是错误的59，我们只有在了解了物种的 遗传结构和遗传多样性现状的前提下,才能够制定出符合实际情况的最佳保护策 略,否则,任何物种保护措施的实施,都不会达到我们所期待的效果。黑叶猴作为喀 斯特石山地区生态系统的顶级物种之一，对当地生态系统多样性有着重要的意 义，但我们关于野生黑叶猴种群的遗传多样性的研究十分有限，尤其是在分子水 平上的研究仍十分缺乏。近年来研究者们急切的想了解黑叶猴的濒危机制和原 因，因此对黑叶猴种群的遗传结构和遗传多样性的研究成为了焦点和热点。 本研究拟采用线粒体分子标记技术研究中国广西野生黑叶猴当前的遗传多 样性和种群动态，查明其在遗传水平上是否已经濒临灭绝，种群的适应能力及进 化潜力如何。并在此基础上分析其濒危的可能原因和机制，进而评估广西黑叶猴 的适应能力及进化潜力和保护地位等。因此，本研究一方面可以从分子遗传学角 度为广西种群有效保护和遗传管理方案的制定提供科学和切实可行的参考依据 8 另一方面可填补野生黑叶猴在遗传学研究上的空白， 为分布在喀斯特石山地区珍 惜濒危动物的研究和保护提供新的技术与手段。 9 第二章第二章 材料和方法材料和方法 2.1 样品的采集与保存样品的采集与保存 2.1.1 采样地点采样地点 野生种群现仅分布于越南北部和我国的广西、贵州、重庆的部分石山地区 4660。我们选择的采样区域为广西的龙州县、扶绥县、大新县、隆安县、德保 县、 靖西县的 9 个区域。 另外我们还在贵州的麻阳河保护区采集了 3 个实验样品。 2.1.2 采样工具采样工具 记号笔、采样标签、50ml 平底离心管、一次性 pe 手套、一次性保鲜膜、口罩。 贵州省 广西壮族自治区 重庆市 图 2-1 采样区域图 2-1 采样区域 道真自然保护区道真自然保护区 麻阳河自然保护区麻阳河自然保护区 靖西南坡靖西南坡 靖西岳圩靖西岳圩 靖西新兴靖西新兴 龙州龙州 德保德保 隆安咘也隆安咘也 隆安群吁隆安群吁 扶绥扶绥 大新大新 10 2.1.3 采样方法采样方法 由于黑叶猴属于国家一类重点保护动物，数量稀少，其栖息地普通人难以观 察、到达。所以本研究采取非损伤性取样法，采集黑叶猴的粪便作为实验样品。 经过调查研究后选择具有采样可能性的黑叶猴夜宿地，统筹安排后进行实地考 察，若果发现有黑叶猴的新鲜粪便，立刻装入灌有 100酒精的采样管中，标明 采集的日期、地点、编号等。由于黑叶猴粪便样品中的 dna 含量少且容易降解， 而隔天的粪样易受到污染，所以采样过程中我们优先采集当天排泄的新鲜、完整 的粪便，并立刻将粪便样品置于装有 30ml 无水乙醇（ar 分析纯）的 50ml 离心 管中。同时为了避免外源 dna 特别是人的 dna 的污染，在采样过程中应戴口 罩并使用一次性 pe 手套，然后将采样管放入一次性保鲜膜中（2 层） 。对于粪便 样品的新鲜程度我们一般根据粪便色泽，尿液味道，以及排泄痕迹进行判断。 封装后的粪便样品可置于室温条件下保存，如能在-20以下的环境中存放 则最佳。 2.1.4 采样结果采样结果 表 2-2 黑叶猴采样表 采样地点 采样时间 样品数量 样品质量 贵州（gz） 2005.8 3 新鲜 龙州（gx-lz） 06.11、07.4 93 新鲜（当天排泄） 隆安（gx-la） 05.6 、06.10 6 新鲜（当天排泄） 扶绥（gx-fs） 06.4、07.4 28 新鲜（当天排泄） 大新（gx-dx） 06.10、06.11 15 部分为新鲜样品 总计：145 2.2 粪便样品的粪便样品的 dna 提取提取 2.2.1 主要试剂和仪器主要试剂和仪器 （1）主要试剂 十二烷基硫酸钠(sds)、三羟基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠盐(edta)、 tris 饱和酚、 氯仿-异戊醇(购自上海生物工程技术服务有限公司)、 无水乙醇 （ar 分析纯） 、bsa（上海生物工程技术有限公司） 、蛋白酶 k、premix taq 酶（大 连宝生物工程公司） 、 标准分子量 250bp labber （购自上海生工） 、 washing buffer、 ctab buffer、binding buffer、消化液(10mmol/l tris-hcl ph8.0、0.1mol/l edta ph8.0、5sds)等。 11 （2） 主要仪器设备 nichipet 移液器(nichiryo 公司)、 hitachi himac cf 16rx 离心机(日立公司), 高速冷冻离心机（sigma3-16k，made in germany） 、国华牌 thz-82 恒 温震荡器、pcr 扩增仪(geneamp pcr system9700， made in singapore, thermo mbs 0.2s pcr 仪 made in usa)、电泳仪（dyy-12 型，北京六一厂） 、电泳槽 （dyc-33a 型，北京六一厂） 、dycz-20c dna 序列分析电泳槽、超净工作台 （苏净集团安泰公司制造） 、techne te-10d tempunit 水浴锅、 sanyo labo autoclave ml s-3020 高压灭菌锅、dhg-9140 a 型电热恒温鼓风干燥箱（上海 一恒） 、tanon gis-2008 凝胶成像系统、电子天平 灭菌锅等。 2.2.2 粪便样品中目的粪便样品中目的 dna 的提取的提取 因为粪便中含有大量的杂质和 pcr 反应抑制物，因此我们要使用特殊的药 品和特殊的抽提方法来降低杂质的含量，提高 dna 的纯度。在实验过程中我们 使用由中科院李明研究员提供的粪便提 dna 法提取黑叶猴粪便中携带的 dna， 该法属于常规抽提法。其具体操作步骤如下： （1）在无水乙醇中保存的粪便样品，尽量将其搅拌均匀后静置，使其自然 沉淀（20min 左右） 。 （2）吸样品与乙醇交界处的粪样转入 15ml 离心管。 （3）向管中加入 10ml 左右无水乙醇，摇匀沉淀后，2000-4000r/min 离心 10min 弃上清液。重复此步骤 3-5 次，直至上清液无色。 （4）向管中加入 10ml 左右灭菌水/双蒸水，摇匀沉淀后，2000-4000r/min 离心 10min 弃上清液。重复此步骤 3-5 次，直至上清液无色。 （5）向管中加入 3ml 消化液（10mmol/ll tris-hcl ph8.0、0.1mol/l edta ph8.0、5sds、 ）100ul pk（10mg/ml 蛋白酶 k） ，摇匀沉淀后，55水浴 10-15h 进行消化过夜。 （6）消化结束后将 15ml 离心管放入离心机，2000-4000r/min 离心 10min， 取上清液倒入另一15ml离心管中， 加入3g淀粉， 摇匀2000-4000r/min离心10min。 （7）取上清液入 2ml 离心管中，加入 250ulnacl(3.5mol/l),ctabuffer 溶液 280ul，混匀后离心一下使液体流入管底，70水浴 20min，摇匀。 （8）将 2ml 离心管中的液体分装入 2-3 个 2ml 离心管中，毎管不超过 1ml 且应尽量一样多，加入等体积的酚/氯仿-异戊醇（25：24：1）充分摇动 10 min， 10000r/min 离心 10min，吸取上清液入新 2ml 离心管；重复此步骤 3-5 次直到 白色杂质消失 。 （9）吸取上清液加入新 2ml 离心管，并加入严格等体积的 binding buffer 12 混匀，移入 column 离心纯化柱，静置 30min，10000r/min 离心 5min 抛去滤液。 （10）加 500ul washing buffer 入离心纯化柱，10000r/min 离心 5min，去滤 液。重复此步骤 1 次。将离心柱移入一新 1.5ml 离心管中。 （11）向离心柱中加入 100ul 高纯水，10000r/min 离心 1min 洗脱 dna， -20保存。 2.2.3 黑叶猴粪便黑叶猴粪便 dna 质量的检验质量的检验 为了检验从黑叶猴粪便中提出的 dna 的质量，将抽提的黑叶猴粪便 dna 在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测。 2.2.4 pcr 扩增扩增 （1）pcr 引物的选择 我们由金丝猴线粒体控制区的保守区域的序列设计的引物进行特异片段扩 增（该 pcr 引物是由中国科学院动物研究所李明研究员惠赠） 上游引物 467：5-aactggcattctatttaaactac-3 下游引物 468：5-attgatttcacggaggatggt-3 (2)目的片段的扩增 本实验经反复摸索 pcr 反应条件，并参考前人的成功经验，最后确定最适 的扩增条件和反应体系。 实验第一阶段使用的反应体系 表 2-3 实验第一阶段使用的反应体系 试剂及浓度 浓度 体积 10buffer 4l dntp 2.5mmol/l 4l bsa 10mg/ml 3l dna 聚合酶 5u/l 0.5l 引物 467 10pmol/ul 1.6l 引物 468 10pmol/ul 1.6l 模板 dna 1l 超纯水/灭菌水 25.3l 总体积 40.0l 13 实验第二阶段使用的反应体系 表 2-4实验第二阶段使用的反应体系 试剂及浓度 浓度 体积 premix taq 20l bsa 10mg/ml 3l 引物 467 10pmol/ul 1.6l 引物 468 10pmol/ul 1.6l 模板 dna 1l 超纯水/灭菌水 12.8l 总体积 40.0l （3）pcr 反应条件： 反应条件为：95预变性 10min；95变性 30s，55退火 30s，72延伸 40s，35 个循环后，72再延伸 7min，4保存。 （4）pcr 扩增产物的检测 采用 1.5的常规琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为 5ul pcr 产物1ul 6 loading buffer，100v 电压电泳 30min，eb 染色，凝胶成像系统观察电泳谱带。 我们将较亮较窄的 pcr 扩增产物送北京诺赛基因公司进行纯化测序，每个样品 采用双向测序发生两个反应，测序结果中包括 2chromas 个文件、2 个序列文本 文件。 2.3 数据分析数据分析 2.3.1 序列处理序列处理 双向测序后得到的结果用 dna star 软件包进行剪切和拼接、核对序列。除 了利用软件以外，还要用人工对照测序的峰形图对序列疑问处进行一一核对。然 后将所得序列在 ncbi 中进行比对，确认为黑叶猴线粒体控制区序列。因为粪便 样品存在重复采样的问题，所以我们采用 dambe 软件将所有序列进行比对， 确定单倍型。然后将所有单倍型序列重新整理，用 mega3.1 软件进行变异检测 确定变异位点。 2.3.2 种群遗传结构分析种群遗传结构分析 用 dnasp4.20.2 统计分析各地理种群的遗传结构信息，包括变异位点的基本 信息、核苷酸歧异度(nucleotide divergence)。使用人工统计各变异位点的详细信 息，使用 mega3.1 分析遗传距离。 14 2.3.3 系统发育树的构建系统发育树的构建 在 mega3.1 上构建各地理种群的无根系统发生树，通过自引导获得系统树 分支的置信值（重复次数为 1000） 。而构建各单倍型序列的无根系统发生树时则 使用 dambe,通过自引导获得系统树分支的置信值（重复次数为 1000） 。 15 第三章第三章 结果与分析结果与分析 3.1 粪便样品的实验效果粪便样品的实验效果 本实验共采集了 145 个黑叶猴粪便样品，其中有 120 个样品的 dna 能够成 功的用于 mtdna d-loop 区的 pcr 扩增。扩增产物全部送诺赛基因公司测序， 其中 110 个 mtdna 的 pcr 产物测序结果较好，符合分析要求。 （1）从粪便样品中抽提的 dna 琼脂糖凝胶电泳图 图 3-1 黑叶猴粪便样品总 dna 电泳图 m：dna 分子标记 250bp dna ladder；1-10：从粪便样品中提取的 dna figure 3-1 amplification of dna of