（物理化学专业论文）非专一性酶催化水解壳聚糖制备壳聚糖寡糖.pdf

复旦大学硕士学位论文第1 页共i i i 页 非专一性酶催化水解壳聚糖制备壳聚糖寡糖 摘要 ， 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，是甲壳质( c h i t i n ，即0 一( 卜4 ) 聚一2 一乙酰氨基一d 一葡 萄糖) 脱乙酰化的产物，它是含0 一( 卜4 ) 一2 一乙酰氨基一d 一葡萄糖单元 g l c n a c 和0 一( 卜4 ) 一2 - 氨基一d 一葡萄糖单元 g l c n 的共聚物。 甲壳质在自然界广泛分布于微生物、植物和动物( 虾、蟹、昆虫的外壳) 中，根据推测，目前地球上甲壳质与植物纤维素产量差不多，年产量约在1 0 0 亿吨。这是取之不竭用之不尽的可再生自然资源。现阶段已利用的仅有几千吨 与植物纤维素的大量利用相比，可以说几乎尚未利用。开发利用甲壳质资源， 具有广阔的前景。 甲壳质和壳聚糖从化学结构上分析与植物纤维素非常相似，都是六碳糖聚 合体，聚合度在1 0 0 0 3 0 0 0 之间，分子量可达1 0 0 万以匕只是在第二个碳原 子上，植物纤维素是羟基( 一o h ) ，甲壳质是乙酰氨基( - n h c o e h ，) ，而壳聚糖是 氨基( 一n h 2 ) 。作为自然界中唯一的碱性多糖，近年来壳聚糖被发现有很多纤维 素所没有的性质，如抑制肿瘤、增强动物免疫力、良好的吸附性能、良好的絮 凝性、易于成膜、良好的生物相容性等。壳聚糖已在医疗、食品及工业、农业、 环保、养殖上有了重要的应用。 壳聚糖不溶于中性和碱性溶液，限制了它的应用。降解壳聚糖为低分子量 壳聚糖或寡糖可以改善它的溶解性，从而拓展壳聚糖的用途。更重要的是，低 分子量壳聚糖和壳聚糖寡糖具有比壳聚糖更吸引人的特性，他们具有抑制肿瘤， 调节人体免疫力，调节植物生长，诱导豆科植物根瘤菌生成，诱导植物抗毒素， 抑制真菌、细菌生长等重要的生物生理活性，在医药、农业，食品等行业有诱 人的应用前景。 壳聚糖的降解可以用酸水解法、h f 降解法、氧化法和酶水解法等。酸水解、 h f 降解、氧化降解除了工艺条件苛刻外，还可能改变产物构型，发生不必要的 副反应从而丧失了壳聚糖的天然性和生物相容性。酶水解壳聚糖可以保持壳聚 糖的天然性和生物相容性，在工艺上也可以比化学法更简单。另外，化学法水 解壳聚糖难以得到高产率的寡糖，尤其是聚合度 5 的寡糖，而研究表明这种寡 糖具有更高的生理活性。 酶水解壳聚糖可以用甲壳质壳聚糖酶( 称之为专一性酶) 也可以用其他 酶( 称之为非专一性酶) 。 复旦大学硕士学位论文 蔓! ! 夏苤坐夏 专一性酶水解壳聚糖能够得到高聚合度的寡糖，酶活性高，反应时需要的 酶底物比小。但是目前的壳聚糖酶成本很高，难以实现产业化。 研究者们发现一些原本用于催化其他反应的商品酶制剂对壳聚糖也有不同 程度的降解作用，称这些酶为非专一性酶。以非专一性酶降解壳聚糖可以降低 酶成本，实现壳聚糖寡糖生产的产业化。非专一性酶降解壳聚糖的关键问题是 酶的活性普遍较低，反应时需要高的酶底物比才能在一定时间内降解壳聚糖到 合适的程度。文献上报道的多数非专一性酶都不能将壳聚糖水解到寡糖范围， 最终分子量往往在1 0 0 0 0 左右。 ， 非专一性酶水解壳聚糖的作用模式还不清楚，以非专一性酶水解壳聚糖的 深入研究有助于发展酶作用的专一性理论等问题。户一、 t ： 一 ! j ”在总结前人的工作和解决壳聚糖寡糖的分析检测的基础上，基于对壳聚糖 具有水解活性的酶广泛存在的事实和酶的组合可能具有更高的活性的设想，我 们对一些酶制剂及其组合的壳聚糖水解活性进行了研究，成功地找到了一种具 有很高壳聚糖水解活性的酶( c h i x l a s e ) 。 本文以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m a l d i t o f m s ) 、薄层色谱 ( t l c ) 、f t i r 以及粘度法等重点研究了c h i x l a s e 的壳聚糖水解作用特性。 ， ( 我们发现c h i x l a s e 具有很高的壳聚糖水解活性，不同于文献上报道的非专 一性亮聚糖水解酶需要高的e s 比才能有效降解壳聚糖，c h i x l a s e 可以在较低的 酶底物比下有效降解壳聚糖为壳聚糖寡糖。c h i x l a s e 降解壳聚糖的有效作用 p h 5 0 6 5 ，最适作用p h 6 0 ，有效作用温度3 0 7 5 ，反应l h 的最佳作用温度 7 0 。c 。c h i x l a s e 对脱乙酰基度高的壳聚糖具有更高的水解括性，显示出与某些 壳聚糖专一性酶相似的底物专一性。 以近完全脱乙酰基壳聚糖为底物，在e s = 0 0 2 8 ，温度4 5 。c 下反应8 h ，产 物经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱以及硅胶薄层色谱检测，产物为聚合 度2 8 的氨基葡萄糖寡糖，2 8 糖含量为2 6 4 ：2 0 8 ：1 5 2 ：1 2 7 ：8 1 ： 11 7 ：5 1 ，具有高生理活性的6 、7 、8 糖含量高达2 4 9 。进一步控制水解 程度，还可以提高高聚合度寡糖的含量。 该酶的活性和产物的专一性可以和目前文献上报道的壳聚糖专一性水解酶 、， 媲美。， 7 我们研究了c h i x l a s e 水解壳聚糖时壳聚糖平均分子量和反应肘间的关系， 发现在水解反应的初期，壳聚糖主要被水解为较低分子量的壳聚糖而寡糖的生 成量较少。利用这一特性，可以控制酶对壳聚糖的水解程度，得到原料分子量 1 1 0 0 的轻度降解壳聚糖。l 根据不同的需要，可以得到不同分子量的产物。在 复旦大学硕士学位论文 第1 i i 页共i i i 页 e s = o 0 2 8 ，p h 6 0 ，温度6 0 。c ，水解3 0 m i n 可得到产量高达7 0 的分子量为原 料1 2 的轻度降解壳聚糖，其余部分为聚合度 7 0 的前提下，控制将壳聚糖平均分子量降低到1 1 0 0 。例如将平均分子量2 5 万的壳聚糖降解为平均分子量2 5 0 0 - - 2 5 0 0 0 的产品。 ( 5 ) c h i x l a s e 酶的壳聚糖水解性能与目前流行的壳聚糖专性水解酶相当，具 备酶水解壳聚糖产业化生产壳聚糖寡糖的基本条件，具有很大的应用价值。卜c ， 关键词：壳聚糖低分子量壳聚糖壳聚糖寡糖氨基葡萄糖寡糖酶水解 复旦大学硕士学位论文第1 页共6 0 页 非专一性酶催化水解壳聚糖制各壳聚糖寡糖 第一章绪论 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，是甲壳质( c h i t i n ，即1 3 一( 1 - 4 ) 聚一2 一乙酰氨基一d 一葡 萄糖) 脱乙酰化的产物，它是含b 一( 卜4 ) 一2 一乙酰氨基一d 一葡萄糖单元 g l c n a c 和b 一( 1 - 4 ) 一2 - 氨基一d 一葡萄糖单元 g l c n 的共聚物。0 1 c n 与g i c n a c 单元的 比例称为脱乙酰基度。壳聚糖一般以脱乙酰基度和平均分子量表征。 a b 口h 甲壳质 洲j o h 图1 - 1 甲壳素和壳聚糖结构示意图 壳聚糖一 甲壳质在自然界广泛分布于微生物、植物和动物( 虾、蟹、昆虫的外壳) 中，根据推测目前地球上甲壳质与植物纤维素产量差不多，年产量约在1 0 0 亿吨。这是取之不竭用之不尽的可再生自然资源。现阶段已利用的仅有几千吨， 与植物纤维素的大量利用相比，可以说几乎尚未利用。主要原因是甲壳质必须 从生物体中抽提，而且要去除共存的无机盐与蛋白质，其成本比纤维素直接利 用要高。近年来甲壳质被发现有纤维素所没有的性质，除7 在医疗、食品及工 业、农业、环保、养殖上应用外，预料陆续将有新产品出现。随着人类对甲壳 质和壳聚糖的开发，这项地球上储量极为丰富的生物资源将带给人类另一线生 机。 甲壳质和壳聚糖从化学结构上分析与植物纤维素非常相似，都是六碳糖聚 合体，聚合度在1 0 0 0 - 3 0 0 0 之间，分子量可达1 0 0 万以上。只是在第二个碳原 ， h 复旦大学硕士学位论文第2 页共6 0 页 子上，植物纤维素是羟基( - o h ) ，甲壳质是乙酰氨基( 一n h c o c h 。) ，而壳聚糖是 氨基( 一n h ，) 。 甲壳质中由于含有乙酰基，大分子之间的作用强烈，因而不溶于水、稀无 机酸、碱和其它一般有机溶剂，仅溶于毗咯烷酮一l i c l 、六氟异丙醇等少数有机 溶剂中，一定程度上限制了它的广泛应用，主要作为制备壳聚糖和单糖的原料。 二 一 甲壳质经浓碱高温处理，可脱去分子中的部份或全部乙酰基，成为脱乙酰 基甲壳质，即壳聚糖。与甲壳质相比，壳聚糖的溶解性大为改善，可以溶解于 酸或酸性水溶液中，因而其应用范围比甲壳质更为广泛。 壳聚糖的分子量一般在1 0 0 ，0 0 0 6 0 0 ，0 0 0 ，溶于稀酸可形成透明的胶体 粘性溶液，其粘度与产品脱乙酰基度和分子量大小有关，一般1 浓度的溶液粘 度在2 0 0 2 5 ，0 0 0 m p a s 之间。 目前，壳聚糖主要应用在以下几个方面：， 1 )在医药、医疗用品方面的应用：可制成能被机体分解的外科手术缝线， 烧伤创伤生物敷料，抑制肿瘤药物，药物缓释材料，炎症和溃疡的治疗药 物，心血管的治疗药物，抗放射线辐射的保护材料等。 2 )在分离膜材料方面的应用：目前已开发了渗析膜、超滤膜、反渗透膜、 渗透气膜、运载膜、催化功能膜和各种形式的能量转换膜。已在化工产品分离、 湿法冶金、生物产品分离、食品加工、石油化工、医药工业和环保等方面得到 初步的应用。世界各国对它的应用和开发研究正处于方兴未艾的阶段。 3 )在化工、轻工方面的应用：可作为印染固色剂，胶卷增感剂，微量金 ， 属离子的提取剂，纸张和纺织品的添加剂，涂料添加剂，配制固发剂，染色调 理剂，洗发香波等。 ： 一 4 )在食品工业方面的应用：可作为食品增稠剂，减肥食品添加剂，肠道 有益微生物生长活性剂，机体免疫增强食品，水果保鲜剂，果汁、啤酒、饮料 的澄清剂等 5 )在生物工程方面的应用；可用作固定化细胞和固定化酶的载体，动物 细胞培养贴附载体，是近年来广泛研究的内容之。 复旦大学硕士学位论文第3 页共6 0 页 6 )在农业方面的应用：可作促进家禽生长的饲料添加剂，农业透气地膜 以及农药缓释包被材料，土壤改良剂及土壤杀菌剂，农作物增产剂。 7 )在环境保护方面的应用：工业废水中有物无絮凝剂，重金属离子的吸 收剂和生活饮水的净化剂等等。 总之，壳聚糖的应用范围相当广泛，尤以医学、药物、化工、食品、化妆 品等领域最为活跃，而且随着研究的进一步深入，还会有更进一步的发展。甲 ： 一 壳质及其衍生物的研究和应用开发也因此引起人们越来越多的重视。 由于甲壳质及壳聚糖具有天然，无毒性，无刺激性，无免疫性，不溶血， 无热源反应，无致突变及无致死突变效应等优点，其应用领域正逐步扩大，尤 其在医药、材料等学科将占有举足轻重的地位。 壳聚糖具有广泛的用途，不同的应用要求它具有相应的性质，分子量是其 中的一个重要因素。制备不同分子量大小的壳聚糖以满足不同应用要求具有重 要的意义。随着研究的深入，人们也发现甲壳质和壳聚糖经水解生成的低聚合 度糖，特别是分子量低于1 0 0 0 0 的低聚糖具有独特的生理活性和功能性质，具 有更有魅力的新用途。 对壳聚糖的降解方法及降解物一轻度降解物和壳聚糖寡糖 ( c h i t o o l i g o s a c h a r i d e ) 的研究，已成为当前壳聚糖研究中的一个重要方向和 热点。 寡糖( o l i g o s a c c h a r i d e ) ，也称低聚糖，一般指聚合度2 l o 的多聚糖，对于 壳聚糖降解物的研究，不仅限于寡糖的范围，为了叙述上的统一和方便，在本 文中对壳聚糖降解物统称为低分子量壳聚糖，包括壳聚糖寡糖和聚合度 1 0 的 壳聚糖降解物。在本文中氨基葡萄糖低聚糖，氨基葡萄糖寡糖以及壳聚糖寡糖、 壳寡糖为同一概念，而n 乙酰氨基葡萄糖低聚糖、n 乙酰氨基葡萄糖寡糖、几 丁质寡糖、甲壳质寡糖、甲壳寡糖为相同概念。 二 + 复旦大学硕士学位论文 第4 页共6 0 页 1 1 低分子量壳聚糖的研究进展 。 1 1 1 低分子量壳聚糖的性质和功能 1 ) 水溶性 壳聚糖降解后，分子链长度减短，分子量下降，水溶液中各分子链间的运 动更加无序，有助于提高其水溶性。随分子量下降，水溶性显著提高。夏文水 等1 发现平均分子量1 5 0 0 的低分子量壳聚糖水溶性高达9 8 8 8 ( 如图1 2 ) ，相 同条件下未降解壳聚糖( 脱乙酰基度“) 的水溶性仅为6 8 4 。 l o o 一。o 16 1 1 董加 2 0 口 24 81 01 2 1 4 m w f r h , u s m a s ) 图1 - 2 低分子量壳聚糖分子量与水溶性 2 ) 吸湿性和保湿性 随着分子量的增加，低分子量壳聚糖的吸湿性不断减小。分子量为1 5 0 0 时具有最大值，既吸湿和保湿能力最大；当分子量上升到j 0 0 0 时，吸湿和保湿 能力基本不变：当分子量为5 0 0 0 时，各项指标仅为分子量3 0 0 0 时的半。 3 ) 抗菌抑菌作用 u c h i t a 2 以来自于芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 的壳聚糖酶( c h i t o s a n a s e ) 水解壳聚糖 制得了含总还原糖5 0 、5 0 8 、5 9 0m g g 的壳聚糖降解产品，在p h = 6 时测试了这 些产品对3 种离体培养的镰刀菌f u s a r i u ms p p 的抗真菌活性，发现轻度降解的 壳聚糖( 含总还原糖5 0m g g ) 的对真菌的最低抑制浓度是未降解壳聚糖的1 2 。 而含总还原糖5 9 0m g g 的降解物在浓度达到1 0g l 时对镰刀菌f u s a r i u ms p p 也没有抗菌活性。总还原糖为5 0m g g 的轻度降解物与未降解壳聚糖对大肠杆 菌( e s c h e d c h i ac o l i ) 的抑制作用相当，但对绿脓假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) ， 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 和葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s a l j r c u s ) 的抑制活性比未降解物更强。 k e n d r a 和h a d 、v i g e r 3 研究了壳聚糖具有抗真菌活性的爨大降解程度。对于 腐皮镰刀菌( f u s a r i u ms o l a n i ) ，能够表现出最大抗真菌活性的最短链长壳聚糖 寡糖为七糖，随着糖聚合度减小，壳聚糖寡糖的抗微生物活性降低，二糖和三 糖无活性。 h i r a n o 和n a g a 0 4 也观察到在琼脂系统中，低分子量壳聚糖比高分子量的壳 复旦大学硕士学位论文 第5 页共6 0 页 聚糖对许多植物病真菌有更强的抑制活性，但他们没有具传指明壳聚糖分子量a j r h o a d e s 和s r o l l e r 5 发现轻度降解的壳聚糖( m i l d h y d r o l y s i s o f c h i t o s a n ) 能增强对食品微生物z b a i l l i i 的抑制活性，降低最低抑制浓度5 0 。而高度降 解的壳聚糖没有抗微生物活性。 h i r a n os ，n a g a en 6 发现大分子量的壳聚糖对1 3 种，低分子量的壳聚糖对9 种，壳聚糖寡糖( 聚合度2 8 ) 对6 种植物病原体( p h y t o p a t h o g e n ) 的抑制率 超过1 0 。大分子量壳聚糖对真菌vi n a e q u a l i s ，h o r y z a e ，fo x y s p o r u m s p m e l o m i s f o x y s p o r u mf ts p 1 y c o p e r s i c i a a l t e m a t a 以及a a l t e m a t a 的抑制率 超过3 0 。而低分子量壳聚糖对r n i g r i c a n s ，v m a l i ，和c f r a g a r i a e 的抑制率 超过3 0 。 4 ) 抗肿瘤活性( a n t i t u m o ra c t i v i t i e s ) 7 ，一 s u z u k ik ，m i k a m it 等9 发现壳聚糖六糖( c h i t o h e x a o s e ) 和几丁六糖( h e x a - n - a c e t y l c 拙o h e x a o s e ) 静脉注射剂量5 0 0 m g k g 时对接种到大白鼠体内的s a r c o m a 1 8 0 癌细胞有1 0 0 抑制率，对m m4 6 癌细胞有5 5 和8 3 n 抑n 率。 5 ) 其他效应 文献上提到的低分子量壳聚糖的活性还有：诱导溶菌酶( 1 y s o z y m e i n d u c e r s ) ”活性，诱导植物抗毒素( i n d u c t i o no fp h y t o a l e x i n s ) “活性，止 血作用( h e m o s t a t i ce f f e c t s ) 1 2 免疫增强作用( i m m u n o - e n h a n c i n ge f f e c t s ) ” 等。 低分子量壳聚糖的这些性质使得它具有很多诱人的应用前景，引起了广泛 的研究兴趣。制备合适聚合度的壳聚糖产品，已成为研究热点。 1 1 2 低分子量壳聚糖的制备 低分子量壳聚糖可由化学法“ “，”，”，”，”，”和酶法2 1 1 2 02 3 12 4 2 5 降解壳聚糖或用 糖基转移法”制备 1 1 2 1 化学法降解壳聚糖 化学法降解壳聚糖主要有酸水解法、h f 降解法、氧化法。 1 ) 酸水解法 采用浓盐酸完全水解甲壳质可制得d 一氨基葡萄糖盐酸盐。其制法为：甲壳 质经浓盐酸在1 0 0 反应数小时后，经浓缩，去除多余的盐酸，再经结晶干燥 可得到白色的d 一氨基葡萄糖盐酸盐。 ， 甲壳质经盐酸部分水解可制得甲壳质寡糖，箕聚合度常为2 7 ( ( g i c n a c ) 2 ( g i c n a c ) 7 ) ，有b a k e r 法”、r u p l e y 法”、c a p o n 法”等。 复旦大学硕士学位论文第6 页共6 0 页 b a k e r 法，以甲壳质先在1 7 0 1 9 0 与k o h ( 氮气保护) 反应9 5 m i n 进行脱 乙酰化，再经盐酸处理，透析和离心干燥，制得壳聚糖盐酸盐，再在1 0 0 ， 3 3 m o l l 盐酸作用下反应3 2 h 后，经活性炭脱色，甲基二辛铵中和，甲醇 a m b e r l i t ei r 4 0 0 树脂醋酸活性炭一硅藻土柱分离( 乙醇梯度洗脱) ，可得到 聚合度l 7 的寡糖，然后在甲醇中结晶，可精制得高纯度的产物。根据需要可 选择性地对寡糖进行乙酰化( 与乙酸酐m t 啶反应) ，可制得甲壳质寡糖。 r u p l e y 法，是将甲壳质在4 0 ，l i m o l l 盐酸中部分水解2 3 小时，用5 0 n a o h 中和，离心过滤，经过活性炭一硅藻土色谱分离( 用乙醇线性梯度洗脱) ， 可得到聚合度1 5 的组分。第一组分( n 一乙酰氨基葡萄糖) 经m b 一1 固定床离子交 换树脂去离子后得以纯化，其他组分再经2 次活性炭一硅藻土色谱得以纯化。此 法直接进行水解，与b a k e r 法相比，经济、快速、方便，无需经过脱乙酰化， 部分水解，再乙酰化多步过程，但活性炭一硅藻土只吸附寡糖，不吸附单糖，并 且吸附能力低，需大量乙醇，速度慢，不适于工业化。 c a p o n 法将甲壳质在室温经浓盐酸处理2 h 后加热到4 0 cj h ，用5 0 n a o h 中和，经硅藻土过滤，s e p h a d e xg - 2 5 柱脱盐，可得到聚合度l 6 的寡糖混合 物，再经s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶过滤，冷冻干燥。分离后的组分再经s e p h a d e xl h - 2 0 过滤，在甲醇水中重结晶，可得到纯化产物。 壳聚糖寡糖的制备有h o r o w i t z 法”。壳聚糖经乙酸碱处理后用0 1 m o l l 盐酸制成壳聚糖盐酸盐，然后在5 34 c ，4 m o l l 盐酸中反应4 8 h ，可得到壳聚糖 寡糖混合物，经浓缩干燥，再经阳离子树脂( d o w e x 一5 0 h ) 色谱分离，用盐酸梯度 洗脱，可得到聚合度i 5 的寡糖。此法可分离氨基葡萄糖寡糖糖，分离较有效， 可进行大规模的色谱分离。 2 ) h f 降解法 d e f a y e 2 9 等以无水h f 降解壳聚糖可分离得到可观产量的3 1 0 糖，但是必 须移去大量的h f 和对产物进行脱氟处理。 3 ) 氧化降解法 7 氧化法最常用的是h 。0 ：氧化法。在1 壳聚糖溶液，在催化剂存在条件下， 加入适量h 2 0 ：溶液，调节p h 值3 5 进行反应；也可以将壳聚糖溶液p h 调节到 1 1 5 ，控制温度7 0 c 左右，分批加入一定量3 5 h 2 0 。溶液进行反应。 另外还有h 2 0 2 - n a c l 0 2 法，h 2 0 2 - h c i 法，n a b 0 3 法，c 1 2 法等氧化法。 1 1 2 2 壳聚糖的酶法降解 在生物体内，甲壳质和壳聚糖的分解合成代谢是在相关酶的催化下进行的。 甲壳质和壳聚糖水解酶能水解甲壳质和壳聚糖分子中b 1 ，4 糖苷键，生成一系 列甲壳低聚糖和乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖。这些酶有甲壳质酶、壳聚糖酶、 溶菌酶和n 一乙酰葡糖胺酶等。除了这些专一性酶外，目前还发现包括糖酶、蛋 白酶、脂肪酶等在内的三十多种水解酶对甲壳质和壳聚糖有部分或完全水解作 用。 。 一 复咀大学硕士学位论文第7 页共6 0 页 1 2 2 1 专一性酶和非专一性酶 1 ) 专一性酶 甲壳质酶( c h i t i n a s e ，e c 3 2 1 1 4 ) 主要存在于微生物、植物、昆虫和鱼类等 中”，在正常高等植物中其酶活极低，但在其病害阶段，酶活则较高。 甲壳质在生物体内被水解成n 乙酰氨基葡萄糖g i c n a c 是由甲壳质酶水解 酶体系来完成的。该酶系为复合酶系，主要包括两种酶，内切甲壳质酶( e n d o 。 c h i t i n a s e ) 和n 乙酰葡萄糖胺酶有时也称为甲壳二糖酶，两者相互协调作用。 内切甲壳质酶随几地将甲壳质降解，最终产物为甲壳质二糖( g l c n a c ：) 和少 量甲壳质三糖( f g l c n a c ，) 。n 乙酰葡萄糖胺酶将甲壳二糖降解为n 乙酰氨基 葡萄糖。也有人提出存在第三种酶即外切甲壳质酶，该酶从甲壳质链的还原端 水解连续释放出甲壳二糖或低聚糖。陈崇顺等报道“，在2 l 属4 1 种( 变种) 植 物叶子中，检测出甲壳质酶活性，并同时包括外切酶酶活和内切酶活，对于不 同的植物，两种酶活力比例有所不同。甲壳质酶的内切或外切作用方式主要取 决于底物的性质。 近年来，对于不同来源的甲壳质酶的分离、纯化、鉴定作了大量的工作”。 从已有资料来看，不同来源的甲壳质酶之间分子量范围2 6 9 0 k 、等电点范围 3 9 、最适p h 为4 6 - - 8 5 。甲壳质酶的作用模式至今依然还很模糊。 壳聚糖酶( c h i t o s a n a s e ，e c 3 2 1 9 9 ) 主要存在于真菌细胞中，处于应激状态 的植物中也发现有该酶活性。壳聚糖酶和甲壳质酶的主要区别在于其作用底物 的不同，壳聚糖酶仅能作用于甲壳质脱乙酰化反应后的产物或壳聚糖，这种酶 以内切作用方式将壳聚糖分解为聚合度2 8 的寡糖。通过对大量不同来源的壳 聚糖酶进行分离鉴定研究，结果表明：从植物中分离得到的壳聚糖酶分子量范 围在1 0 - 2 3 kd a ，而从微生物中分离得到的壳聚糖酶分子量范围为2 0 4 0 kd a 。 根据氨基酸顺序分析表明，不同来源的壳聚糖酶其氨基酸顺庄差别很大，通常 只是n 末端及- - 4 部分肽链上的氨基酸顺序相同，而这一相同部分又与溶菌酶 的结构有相似性。 h u a t a d i l o k 等”研究了壳聚糖酶对具有不同n 乙酰化程度的壳聚糖的水解作 用。在均相反应中，随着n 乙酰化度的提高，米氏常数k m 增大，而最大反应 速率v m a x 降低。 溶菌酶( 1 y s o z y m e ，e c3 2 1 1 7 ) 存在于鸡蛋蛋白、人的眼泪及唾液中。溶 菌酶的天然底物为某些真菌细胞壁中的粘肽( p e p t i d o g l y c a n s ) 、甲壳质以及部分 n 乙酰化壳聚糖。溶菌酶能催化一系列的反应：裂解b 1 ，4 糖苷键、水合碳 正离子中间产物以及碳正离子中间产物的转糖苷化反应。对于不同来源的酶， 其催化反应的重点有所不同。在通常情况下，从鸡蛋蛋白中提取的溶菌酶，其 转糖苷化反应能力要比其水解能力强的多，而对于人唾液中的溶菌酶，其裂解 0 1 ，4 糖苷键的能力较强。 7 以水溶性n - 乙酰化壳聚糖( n 乙酰化度为4 6 0 ) 为底物，研究溶菌酶 动力学，其结果表明：溶菌酶和壳聚糖反应体系遵循m i c h a e l i s m e n t e n 动力学。 复旦大学硕士学位论文第8 页共6 0 页 随着壳聚糖分子中n 一乙酰氨基葡萄糖单元的增加，其反应初速度大大提高。以 不同乙酰化度的六聚糖为底物，n 乙酰氨基葡萄糖单元为3 4 时，水解活力最 为显著。但是随着乙酰化度的增加，壳聚糖的水溶性下降，而影响酶的活力。 乙酰化度极低( 1 8 5 ； 氨水( a m m o n i as o l u t i o n ) ，含量2 5 0 2 8 o ，分析纯： 乙氰( a c e t o n i t r i l e ) ，含量9 9 o ，分析纯： 丙酮( a c e t o n e ) ，含量9 9 5 ，分析纯； 正丙醇( p r o p a n 0 1 ) ，含量9 9 5 ，分析纯； 茚三酮( n i n h y d r i n ) ，分析纯： 考马斯亮蓝g 2 5 0 ( c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg2 5 0 ) ，生化试剂； 牛血清白蛋白( a l b u m i n ( b o v i n es e r u m ) ) ，生化试剂； 铁氰化钾：分析纯 无水碳酸钠：分析纯 碳酸氢钠：分析纯 无水乙醇：分析纯 复旦大学硕士学位论文第1 9 页共6 0 页 去离子水 薄层层析硅胶板：a 硅胶g f 2 5 4 ，青岛海洋化工厂。b h s g f 2 5 4 ，烟台市芝 罘( f 6 ) 黄务硅胶开发实验厂。 2 2 实验方法 。 2 2 1 壳聚糖溶液的配置 a 壳聚糖溶液的配制 称取i o 0 9 壳聚糖于5 0 0 m l 烧杯中，加入2 5 0 m l 2 h a c 溶液，搅拌至 壳聚糖完全溶解。以饱和n a h c o ，溶液中和至p h 接近6 。充分搅拌过夜。以 p h 计精确测定p h 值，以饱和n a h c 0 3 调p h = 6 0 。定量转移并以蒸馏水定 容到5 0 0 m l 。溶液含壳聚糖2 0 m g m l 。 b 无盐壳聚糖溶液的配制 称取2 0 98 8 脱乙酰基壳聚糖于烧杯中，加入4 0 m l 蒸馏水，缓慢滴加 o 8 m l 乳酸或o 4 m l 冰乙酸，充分搅拌，直至壳聚糖基本溶解。此时的壳聚糖 溶液p h = 5 6 。乳酸体系p h 约5 4 ，乙酸体系p h 约5 2 。 为了提高溶液的p h 值，可加入更多的壳聚糖，溶解达封平衡后再分离未 溶解的固体。 2 2 2 还原糖的测定“2 c h i x l a s e 水解壳聚糖产生还原糖端基。生成的还原糖以i m o t o 改良的s c m e s 法测定。 s c a l e s 试剂的配制： 称取0 5 9 铁氰化钾，溶解于1 lo 5 m 0 1 l 。1 n a 2 c o ，溶液半，贮藏于棕色试剂 瓶，作为显色剂。 s c a l e s 试剂的标定： 分别取0 1 0 0 m g m l 1 氨基葡萄糖盐酸盐溶液0 ，0 2 0 ，o 4 0 ，0 6 0 ，0 8 0 ，1 0 0 ， 1 2 0 ，1 5 0 m l 于试管中，加蒸馏水补足至1 5 0 m l 。加2 0 0 m ls c m e s 试剂，沸 水浴加热1 5 r a i n ，冷却，以蒸馏水作参比，于4 2 0 n m 以分光光度计测定光吸收 复旦大学硕士学位论文第2 0 页共6 0 页 ， 值。以氨基葡萄糖含量对光吸收值作图得标准工作曲线线性回归方程。 壳聚糖寡糖中还原糖含量分析： 取经稀释适当倍数的壳聚糖酶降解产物1 5 0 m l ，加2 d 0 m ls c a l e s 试剂， 沸水浴1 0 m i n ，离心，取上清液，以蒸馏水作参比于4 2 0 n m 处测光吸收值，以 标准工作曲线线性回归方程计算样品中的还原糖含量。 2 2 3c h i x l a s e 蛋白质含量测定 为了控制酶底物比，需要测定酶液中的酶蛋白含量。 酶液中的蛋白质含量测定采用b r a d f o r d 法( 考马斯亮蓝染色法) 3 1 4 考马斯亮蓝o 2 5 0 与蛋白质结合，引起染料最大吸收从4 6 5 n m 变为5 9 5 n m ， 而且光吸收增加。 ， 最低检出量为lpg 蛋白质m l 。 ； 染料与蛋白质结合大约只需2 分钟，结合物在1 h 内稳定。 标准方法：取含1 0 - - 1 0 0 1 1g 蛋白质溶液于小试管中，用重蒸水或缓冲液 调体积到0 1 m l ，然后加入5 m l 蛋白试剂( 蛋白试剂的配制见下面) ，充分振 荡混合，2 m i n 后于5 9 5 n m 测定光吸收值。以o 1 m l 重蒸水或缓冲液及5 m l 蛋 白试剂作为空白对照。 蛋白试剂： 称取】0 0 r a g 考马斯亮蓝g - 2 5 0 溶于5 0 m l9 5 7 , 醇，加入 1 0 0 m l 8 5 ( w v ) 磷酸，将溶液用水稀释到1 0 0 0 m l 。试剂韵最终浓度为o 0 1 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，4 7 ( w v ) 乙醇和8 5 ( w v ) 磷酸。 ： 一 2 2 4c h i x l a s e 的壳聚糖水解活性测定 取一定浓度和一定p h 值的壳聚糖溶液，在一定温度下恒温3 0 r a i n 。按照一 定的酶底物比加入一定量的e h i x l a s e 酶液，准确计时反应一定时间。加入反应 液2 体积的浓h c l 终止酶反应，再沸水浴加热1 0m i n 使酶变性。冷却，将反 应液定量转移、定容至适当体积。取定容后溶液分析还原糖含量。 还原糖含量的测定见实验方法2 2 2 。 复旦大学硕士学位论文 第2 1 页共6 0 页 2 2 5 粘度法测分子量 称取壳聚糖( 或水解产物) ( 经4 5 真空干燥) o 2 5 0 9 ，以( 0 1 m 0 1 l “ c h ，c o o n a + 0 2 m 0 1 l c h ，c o o h ) 溶解，定量转移并定容至2 5 0 m l 。4 号砂 芯漏斗过滤。 3 0 0 0 5 恒温，在乌氏粘度计中以五点法测流出时间和特性粘度。以文 献门所订定的9 1 和8 4 脱乙酰基度壳聚糖之m a r k h o u w i n k 方程线性插入k 和 q 值，得8 8 脱乙酰基壳聚糖的m a r k h o u w i n k 方程为 n = 4 3 7 5 1 0 1 m ”1 。 由实验所得特性粘度计算壳聚糖的平均分子量。 ， 2 2 6 壳聚糖及其酶解产物的红外光谱测定 ： 一 样品的红外光谱在n i c o l e t5 s x cf t i rs p e c t r o m e t e r 仪上测定， 为1 0 0 次，仪器分辨率为i - _ 2 c m 一。 取少量壳聚糖或其酶解产物，与k b r 在红外灯下混合研磨至细。 溶液与研磨细的k b r 混合，在红外灯下烘干。 i o m p a 压片，记录波数8 0 0 c m - 1 4 0 0 0 c m l 范围内图谱。 扫描次数 或取少量 2 2 7 壳聚糖寡糖( c h i t o o i i g o s a c c h a r i d e s ) 的薄层色谱( t l c ) 检测 对青