（预防兽医学专业论文）大熊猫γ干扰素基因克隆、原核表达及真核表达载体构建.pdf

四川农业大学硕士学位论文 大熊猫铲干扰素基因克隆、原核表达及真核表达载体构建 摘要；f 干扰素( m n - 砷主要是由活化的t h l 细胞、c d s * t 细胞和汹胞产生，除 具有抗病毒和抗肿瘤活性外，免疫调节作用是其主要的生物学功能，如：激活巨噬细 胞、上调m h c i 、类分子表达水平和促进抗原提呈，诱导t h 细胞的分化等，在机体 针对肿瘤及多种胞内病原体感染等疾病的细胞免疫中发挥重要的作用，是体现机体免 疫功能的一项重要指标 大熊猫( a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) 是我国特有的珍稀野生动物，被誉为中国的“国 宝”据国家林业总局最新公布的调查数字，野生大熊猫现存数量在1 5 9 0 只左右，人 工圈养的大熊猫也仅有1 8 9 只，它们仍处于绝灭的边缘。长期人工圈养的大熊猫( 特 别是幼年大熊猫和老龄化大熊猫) 大多免疫力低下，抗病毒、细菌和寄生虫感染的能 力相对较弱，对其疾病的防治目前仍以药物控制为主，并无专用疫苗，加上频繁用药 导致耐药性菌( 虫) 株出现，以及药物自身存在的毒副作用，这些都给大熊猫的疾病 防治及繁殖工作带来了很大的难度。因而为迸一步搞好大熊猫的饲养管理及疾病控 制，就需要研究新的防治技术，通过细胞因子的作用来提高大熊猫的自身免疫力将可 能是一个相对有效的拯救措施之一。 1 本试验应用反转录聚合酶链反应( r 1 二p c r ) 技术，从c o n a 诱导培养的大熊 猫外周血淋巴细胞总r n a 中扩增得到大熊猫t 干扰素基因，并将其克隆到p g e m t 载体中。经茵落p c r 鉴定、序列测定及序列分析，克隆得到的i f n - , 基因开放阅读 框由4 9 8 个核苷酸组成，编码一个由1 6 6 个氨基酸组成的多肽，包括编码1 9 个氨基 酸的信号肽和1 4 7 个氨基酸的成熟肽。与g e n b a n k 中其他哺乳动物的i f n - 3 , 序列比较， 它与犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的核苷酸同源性在5 7 7 ( 鼠) 9 3 2 ( 犬) 之间；i f n - 1 , 编码氨基酸同源性在4 6 8 ( 鼠) 9 2 8 ( 犬) 之间；进化树构建结果表明 大熊猫与犬的亲缘关系最近。 2 本试验构建了i f n - 7 基因全编码序列的原核表达质粒p e t 3 2 a i f n - v , 并进行了 原核表达研究。将克隆在p g e m t 载体中的i f n - 3 , 基因全编码序列插入原核表达载体 p e t 3 2 a ，得到重组质粒p e t 3 2 a l f n - 3 r , 转化大肠杆菌b l 2 1 ( 表达菌株) ，册g 诱导 表达后，裂解菌体作s d s - p a g e 分析，得到融合表达蛋白特异条带，该表达条带大 小为3 4 6 k d a ( i f n - 3 , 成熟蛋白为1 7 4 k d a ，菌蛋白为1 7 2 k d a ) 。 3 将克隆在p g e m t 载体中的i f n - ，y 基因全编码序列经e e o r i 和x h o l 酶迸行双 酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒回收纯化酶切产物，然后与同 四川农业大学硕士学位论文 样酶切的p c d n a 3 1 ( 十) 质粒定向连接并转化到大肠杆菌中，构建真核表达质粒 p c d n a 3 1 ( + ) w n - - , 并用酶切分析和序列测定进行了鉴定，结果酶切分析和序列测定 都证实真核表达质粒成功构建。 本研究成功克隆了大熊猫矾1 基因，构建了原核和真核表达质粒，并进行了原 核蛋白的表达。本研究为了解各物种间干扰素序列的进化关系提供理论依据，同时也 为迸一步研究口f n 帼组蛋白的免疫学特性和生物学活性及其应用奠定了基础。 关键词：大熊猫；克隆；表达；午干扰素 n 四川农业大学硕士学位论文 c l o n i n g ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n a n dc o n s t r u c t i o no fe u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o ro fl f n - tg e n ei na i l u r o p o d am e l a n o l e u c a h u a n gd a o c h a o ( p r e v e n t i v ev e r t e r i n a r ym e d i c i n e ) d i r e c t e db yp r o f e s s o r y a u gg u a n g y o uz h a n gz h i h e a b s t r a c t ：i n t e r f e r o n g a m m a ( i f n - o ，p r o d u c e dm a i n l yb yt h lc e l l s , c d s + tc e l l sa n d n a t u r a lm i l e rc e l l s ，p l a y sac r i t i c a lr o l ei na n t i - v i r u s , a n t i - n l m o r ，a n di l t l m u n em o d u l a t i o n i t si n l l m u n em o d u l a t i o ni n c l u d e sa c t i v m i n gm a c r o p h a g e s ，u p - r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no f m h cc l a s sia n dc l a s s hm o l e c u l e s ，p r o m p t i n gt h e p r e s e n t a t i o no f a n t i g e n s ，a n di n d u c i n g t h lc e l lg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o n t h el e v e lo f i f n 吖i s 锄i m p o r t a n ti n d e xt ot h ec e l l u l a r i m m u n i t y g i a n tp a n d ai sac h a r a c t e r i s t i ca n dp r e c i o u sw i l d l i 角i no u rc o u n t r y , i ti sn a m e d n a t i o n a lt r e a s u r e i nc t h e i n v e s t i g a t i o nf r o mn a t i o nf o r e s t r yh e a do f f i c ei n d i c a t e s t h a tt h en u m b e ro f w i l dg i a n tp a n d ai sa b o u t1 5 9 0 ，c a p t i v eg i a n tp a n d ai so n l y1 8 9 ，t l l e y a r es t i l lf a c e dt oe x t i n c t i o n t h el o n g - t e a mc a p t i v eg i a n tp a n d a s ，e s p e c i a l l yb a b yo ra g i n g g i a n tp a n d aw i t hh y p o i n u n u n i t y , a r ；ee a s i l yi n f e c t e db yv i r u s g e r ma n dp a r a s i t e t h ew a y o f p r e v e n t i n go rc u r i n gd i s e a s ei sm a i n l yb yd r u g , n os p e c i a lv a c c i n e , b u tt h ed r u gw o u l d b e n o x i o u sf o rg i a n t p a n d aw i t h a d v e r s er e a c t i o na n dt h e p a t h o g e n w o u l db e c 鲫e d m g - r e s i s t a n la l lo ft h e s ea r eb a df o rd i s e a s ep r e v e n t i o na n db r e e d i n go fg i a n tp a n d a , s o w en e e dn e w t e c h n o l o g i e st ob r e e dg i a n tp a n d aa n dc o n t r o ld i s e a s e s , t h ew a yo f i m p r o v i n g a u t o i m m u n i t yb yc y t o k i n e sm a yb eo n ee f f e c t i v er e s c u c i n gm e a s u r er e l a t i v e l y 1 b yr 翻i e r s e 扛a n s c r i p f i o np o l y m e r r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) ，g i a n tp a n d ai f n - 7 g e n ew a sc l o n e df r o mt o t a lr n a w h i c hw a se x t r a c t e df r o mc o n a - s t i m u l a t e d - c n l t u r e d p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e so f g i a n tp a n d a , t h ea m p l i f i e dp r o d u c t so f p c rw e c l o n e d i n t op g e m tv e c t o r 腧i d e n t i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n g , t h es e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a t t h eo p e nr e a d i n gf r a h l eo fg i a n tp a n d ai f n - 7g e n ec o n t a i n e d4 9 8n u c l e o t i d a sw h i c h e n c o d i n g1 6 6a m i n oa c i d s ，t h es i g n a lp e p t i d ec o n t a i n e d1 9a m i n oa c i d sa n dt h em a t u r e i f n - 7 9 e n e w a sc o m p o s e d o f l 4 7a m i n o a c i d s c o m p a r e d w i t h o t h e r m a m m a l s i n g e n b a n k , i n c l u d i n gd o g ，c a t ，h u m a n ，p i g ，c o w ，h o r s e ，g o a t ，r a b b i t ，r a ta n ds oo n ，t h eh o m o l o g y o f n u c l c o t i d es e q u e n c ew a sb e t w e e n5 7 7 ( r a t ) a n d9 3 2 ( d o g ) ，t h eh o m o l o g yo f a m i n o l n 四川农业大学硕士学位论文 a c i ds e q u e n c ew a sb e t w e e n4 6 8 ( r a t ) a n d9 2 8 ( d o g ) p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do n t h en u c l e o t i d es e q u e n c ef r o mt h ei f n - tg e n es h o w e dt h a tg i a n tp a n d ah a st h em o s tc l o s e d r e l a t i o n g s h i pg e n e t i cd i s t a n c ew i t hd o g 2 i nt h i ss t u d y , p e t 3 2 a l f n * t h ep m k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dw i t ht h ec o m p l e t e s e q u e n c eo fi f n - 3 g e n e , w a sc o n s t r u c t e da n de x p r e s s e dt h ec o r r e s p o n d i n gp r o t e i n 。t h e c o m p l e t es e q u e n c e o f i f n - 7 9 e n e f r o m p g e m t w a ss u b e l o n e d i n t o p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e t o rp e t 3 2 a , t h e nar e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 3 2 a l f n - tw 8 8o b t a i n e d t h ep l a s m i d p e t 3 2 a i f n - 7 w a st r a n s f o r m e di n t oe c o l i b l 2 1 ( e x p r e s s i o ne , c o l i ) t h et a r g e tp r o t e i nw a s d e t e c t e db ys d s - p a g ea n a l y s i sa f t e ri n d u c t i o nb yi p t g t h e nt h es p e c i a lb a n do ff u s i o n e x p r e s s e dp r o t e i nw a sr o u g h l yo b t a i n e d ，a n di tw a sa p p r o x i m a t e l y3 4 6 k d a ( t a r g e tp r o t e i n a n de c o l ip r o t e mw e r e1 7 4k d aa n d1 7 2k d ar e s p e c t i v e l y ) 3 t h ec o m p l e t es e q u e n c eo f i f n - t g e n ef r o mp g e m tw a sd o u b l ec l e a v e db ye c o r i a n dx h o lt h ec l e a v e dp r o d u c tw a sr e c l a i m e db yd n a u n i q 1 0s p i nc o l u m np u r i f i c a t i o n k i ta f t e rg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t h e nl i g a t e dw i t hp c d n a 3 1 ( + ) p l a s m i dd o u b l ec l e a v e dw i t h t h es a l n oo n z y l n ea n dt r a n s f o r m e di n t oe c o l i ，p c d n a 3 i ( + ) i f n - tw a si d e n t i f i e db y c l e a v i n ga n a l y s i sa n ds e q u e n c i n g , t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a tt h e e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n p l a s m i dw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y i f n - 7g e n ew a sc l o n e da n d x p r e s s e di np m k a r y o c y t es u c c e s s f u l l y , a n dt h e e u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dw a sc o n s t n l e t e d i tw o u l dp r o v i d es o m ee v i d e n c ef o rt h e e v o l u t i o n a lr e l a t i o n s h i po fd i f f e r e n ts p e c i e s ，m e a n w h i l e , i tp r o v i d e dab a s i sf o rf u r t h f f f r e s e a r c ho l li m m u n o l o g i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g i ca c t i v i t ya n di t sa m p l i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n ti f n - t p r o t e i n k e yw o r d s ：a i l u m p o d am e l a n o l e u c a ，c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ，i n t e r f e r o n - g a m m a ( i f n - 7 ) w 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四i i 农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢看主芝 7 年f 月一7 曰 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名 导师签名 誓i 起 乖锨 如厂年占月时厂日 细歹年f 月矽日 四川农业大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 干扰素的发现 干扰素的发现是在上世纪3 0 年代，许多病毒学家在研究两种病毒感染同一宿主细 胞时，发现普遍存在两种病毒相互拮抗的干扰现象( i n t 刊砾m c e ) ，由此便开始了干扰 物质的研究。从那以后很多科学家试图寻找出这种引起干扰现象的活性物质，但一直 没有获得成功。1 9 4 4 年，g a r d 等发现感染了脊髓灰质炎病毒的鼠脑有一种抗病毒因子， 这种因子与病毒颗粒无关，而且也不能与病毒相结合，由此认为这种因子并非是抗体 1 1 。在1 9 5 2 年，b u n a e t 将a 型流感病毒m e l 株注射到鸡胚绒毛尿囊膜上，在1 8 2 0 h 后再注射n w s s 株流感病毒，结果n w s s 没有引起出血性脑炎在此实验条件下鸡胚 不能产生特异性抗体，所以这种干扰现象与抗体无关，由于m e 腓在鸡胚绒毛尿囊膜 细胞内繁殖不会进入鸡胚血液循环中而到达脑部，所以这种干扰现象也不可能是由于 病毒直接干扰引起的f 2 - 3 1 。因此说明感染病毒的细胞发生干扰现象并菲是由于细胞缺 少了某种物质，相反是由于细胞内产生了某种非抗体物质所引起的。直至u 1 9 5 7 年， i s a a c s 和l i n d c n m a n n 在研究流感病毒时，先把流感病毒加温灭活，然后与鸡胚绒毛尿 囊膜块一起培养，把没有吸附到细胞的灭活病毒彻底洗去，在3 7 ( 2 条件下几小时之后 去掉膜块，另外加入新鲜的鸡胚绒毛尿囊膜块，3 7 c 培养过夜后用活病毒进行攻击， 结果发现流感病毒的繁殖明显的被抑制了【4 】。这清楚地说明，灭活的流感病毒作用于 细胞后，细胞产生了一种可溶性物质干扰了病毒的繁殖当时，他们把这种物质命名 为干扰素( i n t e r f e r o n ) ，也就是现在所称的t 干扰素1 9 6 5 年，w h c e l o c k 报道用n i a 刺 激人白细胞时产生一种对酸不稳定的t 干扰素( i n t e r f c r o n - 1 ) ，又名免疫干扰素闭。 1 2 干扰素产生 玎烈1 由抗原或有丝分裂原诱导t 细胞和h 珏嘲胞产生，抗原或特异性激活剂( 包 括植物血凝素( p h y t o h a e m a g g l u t i n i n , p h a ) 、刀豆素a ( c o n c a n a v a l i n a , c o n a ) 和金黄色葡 萄球菌蛋白a ( s t a p h y l o c o c c u sp t o t e ：i na , s p a ) 刺激t 细胞或i d 2 刺激细胞均能产生 巧 n - i 1 。3 1 。这种诱导作用受顺势调节元件和反式调节作用调控的同时也受m h h 韵反馈 调节作用【们。不成熟的n - 伍白含有信号肽，成熟的刀f n 吖因为含有较大的糖基侧链 而分子量较大。已证明基因工程干扰素不含糖基侧链而仍有活性，所以有人认为糖基 侧链可能与干扰素活性无关而是参与维持干扰素的抗原性与稳定性用。生理状态下， 四川农业大学硕 学位论文， 干扰素基因受到蛋白抑制物的抑制，阻止基因活性的启动。在干扰素诱生剂的作用下， 表达一些与基因活性有关的蛋白成分，与抑制蛋白结合后，使之变成不活动状态，干 扰素基因的抑制受到解除，转录生成m r n a ，后者在细胞核中合成后，迅速转移至胞 浆与核糖体结合，翻译成干扰素前体，然后由信号肽引导进入内质网，经一系列加工、 修饰后成为成熟的干扰素，最后被分泌到细胞外。干扰素诱生原理详见( m 1 ) ，n 7 诱生过程可以分为两个阶段：第一阶段是诱生剂和细胞表面受体相互作用，激发一系 列的生化反应；第二阶段的生化反应产物作为调控信号启动特定的基因表达，直接或 间接地激活i f n 基因的表达。现在已经清楚诱生信号的靶位点位于刀m 堪因上游的干 扰素反应元件( i n t e r f e r o n r e s p o n s e e l e m e n t ，m e ) 序列。i r e 是一种多功能的增强子序列。 就i f n - 俪言，i r e 包括三个功能区，其中3 7 - 6 2 为负调控区，- 6 7 7 7 和5 5 - 6 6 为两个正调控区( p o s i t i v er e g u l a t i n g d o m a i n , p r d i 、) 其中p r d i 包括两个拷贝的重复序 列a a g t g a g ，分别与不同的反式作用因子相互作用。现已肯定的反式作用因子有干 扰素调节因子- 1 ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r - 1 ，i r f 1 ) ，i r f - 2 和核因子o k 那n u c l e a r f a c t o r - k , n f - r 国三种，其中i r f - 1 和刀附自身可与激活的p r d i 相互作用，而n f k 口可激 活p r d i i ，i r f - 2 可能是静止子，当诱导剂出现时，静止状态被解除d - 3 i 。 l i 膏或其他诱生卉i 抑制蛋白基因组颤r 服 抑豺蛋白曲卧 灭活抑翻蛋西盼特殊器子 h 占 帮钽蛋白+ 于抗素基因去抑翻 + 千 不活动性抑制蛋白千抗基因激活 ：f 嗨慊_ 雕 i 千扰素前体 干扰素前体毒移到细腿骥 信号肽教切翻 士 成熟干扰素分泌到细撮外 图1 干扰素合成机制示意图 f i g ld i a g r a m o f t h ec o m p o s i f i v en 埒d 柚血缸no f i f n 在细胞诱生玎附椭过程中还有一种叫超诱导( s u p 舐n d u c t i o n ) 的现象3 1 。所谓超诱 导就是指细胞在大分子蛋白合成抑制物的作用下发生的种诱生小分子蛋白质合成 增加的现象。现在己知有多种大分子抑制物或其他物质可以引起i f n 的超诱导作用， 2 四川农业大学硕士学位论文 包括放线菌素d 。采用这一技术可使人i f n 的产量增加1 0 1 0 0 0 倍。关于超诱导现象 有如下假说：超诱导作用的本质实际上是不稳定的蛋白抑制现象，当抑制物作用于细 胞时，可阻断干扰素抑制蛋白m r n a 的翻译，可能这一阻抑物在胞质内与抑制蛋白 m r n a 直接作用，使其m r n a 翻译活性丧失，此时干扰素基因大量表达，细胞中干扰 素积累唧。 1 3 干扰素诱导原 口烈谨因是位于染色体上的，其基因组的表达受抑制物的控制，这种抑制物是 种很易转变的蛋白质，与i f n - 任因上游的操纵基因区段相结合，从而阻止了启动 基因位置上的r n a 多聚酶括性的发挥，砸n 谨因的表达就被抑制唧。当病毒或其它 i f n 徊生剂作用于细胞后产生了一种灭活抑制蛋白的特殊因子，这种特殊因子与抑 制蛋白结合，使后者变成不活动状态，这就解除了对i f n 谨因表达的抑制，卫限1 基 因就被激活，很快就转录成m r n a 。由于h h 基因组成中有插入序列，其成熟m r n a 的核苷酸序列w l f n - 灌因组的序列要短。刀附德因对应的m r n a 在细胞核内合成之 后，迅速转移到胞浆核糖体翻译成i f n 荫i 体。然后，借助于分泌信号肽的功能使i f n - 7 前体搬运到细胞膜、信号肽被切割，成熟n 僦分泌到细胞外。概括来讲，各种 病毒( 包括r n a , d n a 病毒) ，如感染的轮状病毒、流感病毒、传染性胃肠炎病毒和细 小病毒等，都会产生i f n - t ；细胞自身的或人工合成的双链r n a ；细胞内繁殖的 微生物，包括立克次氏体、支原体、弓形虫、衣原体、疟原虫及其它原虫；细菌代 谢产物，如细菌脂多糖，真菌多糖；多聚物，多羟基聚合物如吡喃、聚丙烯酸等； 低分子物质：如环己亚胺、卡那霉素、二苄呋喃、碱性染料、丙烷二胺，细胞有丝 分裂素( 植物凝集素) 等均可诱生干扰素 t - 1 0 。目前国外已经通过 p h p h o r b o l - m y r i s t a t e a c i 砌t e 口m a ) 和p h a 等处理猪淋巴细胞来生产畜用干扰素i i i j 。但 是，这些诱生的细胞干扰素含量非常低，而且通常含有多种亚型，其成份复杂。另外 由于在制作过程需要血液或脾脏，不仅难以大量获得，而且有潜在各种血液病毒污染 制品的危险，因而使临床应用受到限制。 1 4 干扰素的作用机理 干扰素不是直接与靶分子发挥作用，而首先要与靶细胞表面的特异性受体相结 合，通过信号传递，引发一系列特定的生化反应，刺激细胞内多种效应蛋白质分子合 成，从而发挥干扰素的功能。目前所知，干扰素受体( i f n r ) 分两类( k i m ，s h ，c ta 1 1 9 9 7 ) ， 四川农业大学硕士学位论文 第一类为玎附，嘲鼬厅受体；第二类为d 附陵体( 陀l 。近年来的研究表明，细胞因子受 体家族的信号传递是通过所谓j a y , s 和s t a t s 系统进行的【廿】。首先，细胞因子受体与 配体结合后通过一类胞浆内的蛋白酪氨酸激酶( j a kj a n u sk i n a s e ) 使酪氨酸磷酸化。 j a k s 功能与结合有配体的受体膜近侧端区段有关，它可导致j 灿江的磷酸化和激活， 而激活的j a k s 可进一步使受体磷酸化，并使胞浆内一组转录因子也磷酸化，后者称 为信号转导和转录激活因子，简称s t a t s 。几种磷酸化的s t a t s 与另一种d n a 结合蛋 白形成复合体，转移到核内，与细胞因子诱导基因的上游增强子区段相结合，引起多 种细胞因子诱导基因的表达，从而发挥细胞因子的功能。j a k s 家族目前所知只有4 种：j a k i 、j a k 2 、j 甜。和t y k 2 。不同细胞因子受体利用不同的j a k s 成员进行信号传 递。刀f n 邮利用j a k1 和t y k 2 ，而删1 贝0 利用j a k i 和j a k 2 进行信号传递。j a k s 的 底物是s t a t 蛋白：s t a t l 醍p 9 1 ；s t a l f l ；是p 8 4 ：s t a t 2 ：黾p 1 1 3 ：s t a t l 是，a k l 的底 物；而s t a t 2 是t y k 2 的底物f 。 干扰素发挥作用的起点是i f n 与i f n 受体的结合，使相应的j a k s 磷酸化，激活的 j a k s 可进而使受体磷酸化，并使胞浆内i s g f 3 确三个亚单位磷酸化( s t a t s ) 。在此之 前，三个亚单位系以非活化状态独立存在于胞浆内，但在磷酸化即活化后则互相结合 成三联复合体，后者与另一d n a 结合蛋白相结合，共同进入胞核内，作用于效应分 子基因5 端的结合干扰素刺激反应元件0 s r e ) ，从而使一系列效应分子表达。近年来 的研究表明，所谓干扰素激活基因( i s g ) 的产物也就是干扰素的效应分子，它包括蛋 白激酶和2 5 a 系统。2 5 a 系统涉及3 个酶：2 - 5 a 合成酶、2 ，5 磷酸二脂酶，它能降解2 5 a 为a t p 和a m p ；依赖2 5 a 的r n a 酶( r n a s e l - 瓤n a s e f ) 【1 5 j 。现已证实i f n 的效应分 子远远不只上述几种，因为在不少情况下细胞抗病毒状态的建立与这些分子的生成量 并不平行，而且i f n 的许多其他活性也不是少数几种效应分子可以解释的。一些当时 已知的蛋白质因子也可以因蜊的诱导而增加合成，例如m h c 【类抗原和类抗原，所 以从广义上说，这些蛋白质也是口限的效应分子。但还不仅于此，一些新的n 效应 分子逐渐得到分离和分析，包括所谓1 5 k d a 蛋自、6 7 k d a 蛋白、m x 蛋白和肽链释放 因子等。尽管它们的功能还有待进一步研究，但已被直接或间接证明具有重要的生物 学意义。 1 5 干扰素基因工程学研究 i f n 首次发现，引起了无数科学研究者的兴趣和关注，在2 0 世纪6 0 年代，学者们 4 四川农业大学硕士学位论文 就开始了动物干扰素基因工程的研究工作7 0 年代末，学者们大规模地从事人干扰素 基因的研究。1 9 7 9 年，人成纤维细胞干扰素f a u i f n - f 1 ) 基因创先克隆成功【1 6 1 。8 0 年代 初，人自细胞干扰素( r l u l f n - a ) 和免疫干扰素( h u l r n - r ) 基因相继成功克隆和表达，并 应用于临床获得显著效果f 1 7 1 关于动物干扰素基因的研究相对滞后，c e r r e t t i 等在1 9 8 6 年首先克隆出牛玎烈r 1 基因，而后利用基因工程技术生产重组牛i f n 3 ( r b o v l f n - 3 , ) 的研究开始兴起，国外学者 已先后利用酿酒酵母、p g e x - 5 x - 1 融合蛋白表达系统、巴斯德毕赤氏酵母系统、牛i 型疱疹病毒载体( b a y - 1 ) 、昆虫细胞和家蚕细胞杆状病毒系统表达h b r b o v i f n - 7 , 并对 其免疫学和生物学活性进行了研究。在国内，许金俊等( 2 0 0 3 ) 分别在大肠杆菌和c o s 细胞中将r b o vf n - t 表达成功。张红燕( 2 0 0 4 ) 等构建表达载体p p i c 9 k b o v 口附叫，并转 化至巴斯德毕赤酵母g s t l 5 q ，成功表达【1 柚2 1 。 1 9 9 0 年，d i j i k m a n s 等首先从基因水平开展了猪i f n - c 鬟j 研究，并成功获得猪i f n q , 基因的部分序列；1 9 9 1 年，v a n d e n b r o e c k 等又应用p c r 技术从猪基因组d n a 的燧菌 体文库中克隆了猪砸n 幡因的外显子，获得完整的猪口f n 陲因后在大肠杆菌中进行 了表达，表达产物以包涵体的形式出现。随后p o i f n - 3 6 争别在昆虫细胞( s f g ) 和兔肾细 胞( r k l 3 ) 中成功表达。我国学者在细胞水平上进行猪i f n - 饷研究较晚，郭濠军等 ( 1 9 9 9 ) 采用大肠杆菌表达p o i f n - y ；万建青等( 2 0 0 2 ) 在毕赤酵母中成功表达了 p o i f n - 1 f 2 3 埘】 ， 国内外学者对犬i f n - 1 基因也进行了深入研究z u c k e r 等( 1 9 9 2 ) 、d e 、，o s 等( 1 9 9 2 ) 及a k i m 等( 1 9 9 6 ) 先后克隆出犬巧n 谨因( c a w n q ) ，同时z u c k e r 等还将该基因在中 国地鼠卵巢细胞( c h 0 ) 中进行表达。n i s h i k a w a 等( 1 9 9 7 ) 和o k a n o 等( 1 9 9 7 ) 分别利 用痘病毒和重组杆状病毒表达了犬重组干扰素( r c a l f n - ，并进行了犬重组干扰素 ( r c a t f n - - y ) 抗病毒感染和提高m h c h 表达等实验。国内杨琪等( 2 0 0 2 ) 克隆了犬 i f n - , e d n a 。并用p r c c m v 2 表达载体率先在鼠骨髓瘤细胞( s p 2 o ) q a 进行表达。杨玉 英等( 2 0 0 2 ) 也克隆了大干扰素1 基因，并构建了原核表达载体p p r o e x 孙3 2 1 。 与人类和哺乳动物相比，鸡口f n 1 在分子水平方面的研究比较滞后。l o w e n t h a 等 ( 1 9 9 5 ) 从有丝分裂原刺激的鸡脾淋巴细胞中得到了对热、p h 敏感的刀附，它能激活巨 噬细胞产生n o ，这与哺乳动物蜊吖相似，从而证明鸡体内同样存在i f n - 7 。同 年, d i g b y 等成功克隆了鸡刀附谨因。1 9 9 8 年，k a i s e 对鸡卜1 1 基因组结构进行了研 究，首次从基因组d n a 克隆得到鸡刀刚- 馑因的全序列，随后k a i s e r 等又克隆了日本 i j qj 1 ) 农业大学硕士学位论文 鹌鹑、火鸡、珍珠鸡和雉鸡干扰素基因，并且在e c o l i 中和c o s 细胞获得成功表达。 在国内，刘胜旺等( 2 0 0 0 ) 、程略等( 2 0 0 0 ) 、吴志光等( 2 0 0 1 ) 、戴建华等( 2 0 0 2 ) 、 鲍鸣等( 2 0 0 4 ) 和蔡梅红等( 2 0 0 4 ) 先后对鸡m 限崖因进行了克隆，且分别扭, c o l i 、 c o s 细胞和鸡痘病毒载体中成功表达 3 3 - 3 7 1 。 2 0 世纪9 0 年代是干扰素基因工程研究最活跃的时期，在这段时期内，关于人和多 种动物( 如猴、猪、马、牛、羊、驴、犬、猫、兔、鹿、鼠、鸭、鸡、海豚等) 的干 扰素基因研究得到了蓬勃发展【3 9 】，许多动物的干扰素基因都得到了成功克隆和表 达，并且对其生物学活性做了相关研究，这些在基因工程学方面取得突破和进展，为 进一步研究i f n 的作用机理、生物学活性及与其他细胞因子之问的相互作用等奠定了 坚实的基础。 1 0i f n - t 生物学活性及应用 n 伯生物学活性有以下几个方面：诱导t h 0 细胞向t h l 细胞分化；抑制i f n - t 诱导的t h 0 细胞向t h 2 细胞分化，提高t h l 细胞数及其细胞功能；提高其细胞毒活力， 发挥抗细胞内病毒和抗寄生虫作用。拮抗i f n - 惯导b 淋巴细胞增殖及其产生i g e 、 i g g i ：并通过与t h 2 细胞上的i f l 受体( i f n - 1 r ) 结合，抑制t h 2 细胞功能，包括i f n - 7 的分泌，使i g e 的产生受阻。诱导单核，巨噬细胞、树突状细胞、皮肤纤维状细胞、 血管内皮细胞表面m h ci i 类抗原表达，以调节这些细胞参与抗原提呈和特异性免疫 识别过程。辅助b 淋巴细胞产生i g g 2 ，i g a 和i g d ，降低i g g l ，i g g 2 b ，i g g 3 和i g e 的产生， 参与抗感染免疫。抗肿瘤作用卅。 由于i f n 具有的独特的免疫调节和抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤作用，在临床上有 很好的应用前景和潜力。在上个世纪八十年代以前人们主要通过诱导培养的人血细胞 或细胞系生产重组干扰素，后来随着基因工程技术的兴起，生产大量活性高、价廉的 i f n 成为了现实，n 在临床上应用也越来越广泛。目前，国内外均有商品化的重组i f n 供应，如美国生产的a c t i m m u n e 、丽珠集团生产的丽珠因得福、复星实业生产的复星 克隆伽吗等。在美国，f d a 批准的重组人刀f n 吖主要用于肿瘤( 如肾细胞癌、卵巢癌、 黑色素瘤、慢性髓性白血病等) ，风湿性关节炎、过敏性皮炎、过敏性哮喘等疾病治 疗，但单独使用i f n 往往效果不明显，必须与其他抗肿瘤药物或细胞因子联合使用才 能体现出一定的协同作用( 搏5 “。 相对于人i f n 而言，动物i f n 的研究相对滞后，用于临床治疗的甚少，到目前为 6 四川农业大学硕士学位论文 止，已有多种动物的i f n 基因相继被克隆出来，也有大量利用大肠杆菌、酵母、杆状 病毒等表达系统表达重组i f n 的报道，许多研究报道均证实动物的i f n 在直接作为治 疗制剂或作为疫苗使用的佐剂呈现出一定的效果，如猪重组i f n l 在m a r e - 1 4 5 细胞上 能够抑制猪口蹄疫病毒( 融似，) 、蓝耳病病毒0 r r s v ) 、非洲猪瘟病毒( a s w ) 的复制， 而且还具有抗弓形体的作用，刘成芳( 2 0 0 5 ) 在探讨弓形虫可溶性抗原( s t a g ) 和 i r n - - r 联合鼻内免疫对小鼠的保护作用时，发现随着佐剂i f n 俐量的增加，小鼠存活 率有升高趋势，能有效诱导黏膜免疫应答。重组奶牛i r r , r - , r 对实验性大肠杆菌引起的 乳房炎具有较好的预防和控制效果，重组玎融何显著地增强小鼠对鸡僻蛋白的抗体 反应，鼎1 处理提高了小鼠针对该蛋白所有亚型i g g 的产量、诱导了长期的抗体产生 和免疫记忆。重组羊r f n - v 在羊细胞上对衣原体有较好的抑制作用，重组猫n 一僦增 强猫疫菌抗体的产生，重组鸡t r n - , r 体内能明显抵抗肠炎沙门氏菌的入侵，商品鸡用 f a v 重组病毒表达的i f n 治疗能够减少因为艾美耳球虫引起的增重下降，与a i v 的h a 基因在鸡痘病毒中共表达能够有效提高疫苗的免疫效力和降低病毒载体的毒力，重组 鸭h 1 能在肝细胞上抑制d i - i b v 的复制等等，这些研究结果进一步证实动物的i f n 与 人口p n 一样，在动物某些疾病的预防和控制中具有较好的应用前景，值得进一步加以 开发和利用f 5 2 侧。 7 殴川农业丈学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 试验动物 大熊猫外周血液由成都大熊猫繁育研究基地提供。 2 1 2 主要试剂 r p m l l 6 4 0 、c o n a 、i p t g 、x - g a l ，s i g m a 公司： 淋巴细胞分离液，天津血液研究所； r n a 抽提试剂盒( t r i z o i rt o t a lr n ai s o l a t i o nr e a g e n t ) ，g i b c o b r l 公司； 逆转录试剂盒( t r i z o l rt o t a lr n ai s o l a t i o nr e a g e n t ) ，g i b c o b r l 公司： t a q 酶，上海生物工程有限公司； 限制性内切酶( e