（应用化学专业论文）有机分析试剂与蛋白质显色反应及其应用研究.pdf

硕士学位论文 摘要 在查阅大量关于染料与蛋白质作用的文献基础上，提出了用对一二甲胺基亚苄 罗丹宁( p d b r ) 、对一氯酚偶氮罗丹宁( c p a r h ) 、4 ( 2 噻唑偶氮) 一l ，3 二羟基 萘( t a d n m ) 、2 - 2 1 一苯并噻唑偶氮1 ，8 - 二羟基3 ，6 一萘二磺酸( b t a c ) 等测定蛋 白质的方法。 1 研究了蛋白质与p d b r 的结合反应，h s a 浓度在3 6 1 0 一m o l l 。1 1 0 l o 。7 m o l l 。1 范围内，该反应符合p e s a v e n t o 模式。反应的最佳条件为p h8 0 ，7 0 x 1 0 4 m o l l p - d b r ，1 2 5 x 1 0 4m o l l c t m a b ，室温显色1 5m i n 。在该条件下，h s a 与p d b r 生成橙黄色复合物，最大吸收波长在4 8 0r l n l ，表观摩尔吸光系数为 3 4 1 0 6l m o l - 1 c m 。该方法可用来测定生物样品中的蛋白质，线性范围为1 2 m g l 4 1 1 0 m g l ，最低检测限为0 4 2m g l ，回收率为9 5 1 0 2 。 2 研究了蛋白质与c p a r h 的结合反应。反应的最适条件为：p h 4 0 ，2 o 1 0 4 m o l - l c p a r h ，5 0 x 1 0 一m o l l c t m a b ，室温显色1 5m i n 。在此条件下，h s a 与c p a r h 生成橙黄色复合物，最大吸收波长为4 6 0n l n ，表观摩尔吸光系数为 4 7 x 1 0 5l m o l - 1 e m 一。利用该体系可测定蛋白质，线性范围为1 2 0m g l 4 9 6 0 m g - l 。 3 研究了蛋白质与t a d n m 的结合反应。该反应在h s a 浓度为3 6 1 0 0 m o l l 8 1 1 0 m o l l 1 范围，符合p e s a v e n t o 模式，最大结合数为2 1 2 。显色反 应的最适条件为p h5 0 ，1 5 1 0 。4m o l l t a d n m ，0 0 0 5 0 t r i t o nx 1 0 0 ，室温显 色1 0m i n 。h s a 与t a d n m 生成橙红色复合物，最大吸收波长在5 0 0n n a ，表观摩 尔吸光系数为5 1 1 0 5l m o l - 1 c m 。用h s a - t a d n m 复合物测定血清等生物样品 中蛋白质时，线性范围为1 2 0 m g l 。1 4 8 0 m g l ，最低检测限为2 1m g - l 。 4 研究了蛋白质与b t a c 的结合反应。该反应的最适条件为p h4 0 ，1 2 5 1 0 4 m o l l b t a c ，室温显色1 5m i n 。h s a - b t a c 复合物为紫红色，最大吸收波长为 5 8 0h a l ，表观摩尔吸光系数为2 7 l o l m o l - c m 一。该方法可用来测定生物样品中 的蛋白质，线性范围为4 8 0 m g l 。1 2 0 0 m g - l ，最低检测限为8 0 m g l 1 。 关键词：分光光度法，p d b r ，c p a r h ，t a d n m ，b t a c 有机分析试剂与蛋白质的显色反应及其应用研究 a b s t r a c t a f t e rc o n s u l t i n gm a n ya r t i c l e sa b o u tt h ei n t e r a c t i o no f d y e sw i t hp r o t e i n s ，t h en e w m e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nu s i n gp - d i m e t h y l a m i n o b e n z y l i d e n e r h o d a n i n e p d b r ) ，5 - 【2 一( 4 - c h l o r o p h e n 0 1 ) a z o 一r h o d a n i n e ( c p a r h ) ，4 - ( 2 - t h i a z o l y l a z o ) 一l ， 3 - n a p h t h a l e n e d i o l ( t a d n m ) a n d2 - 2 一b e n z o t h i a z o l y l f l z o - 1 ，8 - d i h y d r o x y n a p h t h a l e n e 一3 ， 6 - d i s u l f o n i ca c i d ( b t a c ) h a v eb e e np r o p o s e d 1 t h ei n t e r a c t i o no f p d b rw i t hh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) w a ss t u d i e d i n t h eh s ac o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m3 6 x 1 0 一m o l - l 一1t o1 0 x 1 0 一m 0 1 l 一t h er e a c t i o no f h s a 、v i t l lp - d b ro b e y e dt h ep e s a v e n t o sm o d e l t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h e r e a c t i o no fh s a 、v i t l ip d b rw e r ea sf o l l o w i n g ：p h8 0 7 0 x 1 0 5m o l l p d b r , 1 2 5 x 1 0 4m o l l c t m a b ，r o o mt e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m eo f1 5m i n h s a f o r m e da no r a n g ec o m l e xw i t hp - d b r i t sm a x i m u ma b s o r p t i o np c a ki sa t4 8 0n mw i t h a b s o r p t i v i t y o f3 4 x 1 0 6l m o l - t c m t h e p r o p o s e d m e t h o dh a sb e e n a p p l i e d t o d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i ni ns e l u r r l t h el i n e a rr a n g ei sf r o m1 2m g l “t o11 0m g l 一 w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f 0 4 2m g l 一，a n dt h er e c o v e r y , f r o m9 5 t o1 0 2 2 t h ei n t e r a c t i o no fc p a r hw i t hh s aw a ss t u d i e d t h eo p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w i n g ：p h4 0 ，2 0 x 1 0 4m o l l c p a r h ，5 0 1 0 m o l 0 1 c t m a b ，r o o mt e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m eo f1 5m i n u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s h s af o r m sa no r a n g ec o m p l e x 谢出c p a r h 。i t sm a x i m u ma b s o r p t i o np e a ki sa t4 6 0 n l nw i t ha b s o r p t i v i t yo f4 7 x 1 0 3l m o r l c m 。t b ep r o p o s e dm e t h o dw a su s e df o r d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n i ns e r u m w i t h t h e l i n e a r r a n g e f r o m l 2 ，0 m g 。l t o9 6 0 r a g l 3 t h ei n t e r a c t i o no ft a d n mw i t hh s aw a ss t u d i e d i nt h eh s ac o n c e n t r a t i o n r a n g ef r o m3 6 x 1 0 一m 0 1 l 1t o1 0 x 1 0 m 0 1 l t h er e a c t i o no fh s aw i t ht a d n m o b e y e dt h ep e s a v e n t o sm o d e l 1 1 l er e a c t i o nc o n d i t i o n so fh s a w i t ht a d n mw e r e0 , 8 f o l l o w i n g ：p h5 0 ，1 5 x 1 0 - 4m o l l - 1t a d n m ，o 0 0 5 钟at r i t o n ) ( - 1 0 0 ，r o o mt e m p e r a t u r e a n dr e a c t i o nt i m eo f1 0m i l l i nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，h s af o r m e dar e dc o m p l e x 谢mt a d n m i t sm a x i m u ma b s o r p t i o np e a ki sa t5 0 0n n l 、v i ma b s o r p t i v i t yo f 5 1 x 1 0 3 l m o l - l - c m 一t h ep r o p o s e dm e t h o dh a sb e e na p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no fp r o t e i ni n s e r u ma n dt h el i n e a rr a n g ei sf r o m1 2 0m g l t o4 8 0m g 。l 1w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f 2 1m g l 1 4 t h ei n t e r a c t i o no fb t a cw i t hh s aw a ss t u d i e d ：t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w i n g ：p h4 0 ，1 2 5 x 1 0 4m o l 。l b t a c ，r o o mt e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m eo f 1 5m i n u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，h s af o r m e dap u r p l i s hr e dc o m p l e xw i t hb t a c ，i t s i i 硕士学位论文 m a x i m u ma b s o r p t i o np e a ki sa t5 8 0n l nw i t ha b s o r p t i v i t yo f 2 7 x 1 0 5l m 0 1 - 1 c m t h e p r o p o s e dm e t h o dh a sb e e na p p l i e dt o d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i ni ns e r u m t h el i n e a r r a n g ei sf r o m4 8 0m g l t o1 2 0 0m g l w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f 8 0m g l k e yw o r d s ：s p e e t r o p h o t o m e t r y , p - d b r ，c p a r h ，t a d n m ，b t a c i i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：狄扳氧日期：动。眸| 月2 j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密回。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：狄振蜘 导师签名：；2 1 ：乙争 日期：2 。s 年f f 月2 - 1 日 日期：嘶年，月跎日 硕士学位论文 1 1 文献综述 第1 章绪论 蛋白质是人体中重要的一类生物大分子，在人体中有特殊地位。它是生物体 细胞的重要组成物质之一，是生命活动的基础，没有蛋白质，d n a 的复制，信息 的转录，遗传密码的翻译等生命现象都无从谈起i l 2 1 。随着人类对于生命现象研究 的深入，人类对自己的了解也越来越清晰。2 0 0 3 年4 月人类基因组序列图绘制成 功，标志着“后基因组时代”( p o s tg e n o m ee r a ，p g e ) 来临，即蛋白质组研究的开 始【3 】。蛋白质组的提出标志着生命科学已从核酸时代回归蛋白质时代，对生命奥秘 的探索由基因、核酸层次深入到蛋白质的更深层次。蛋白质组学作为后基因组时 代的重要支柱之一，其发展不可限量，它的研究将带来巨大的经济和社会效益1 4 】。 目前，美国、英国、日本等国家纷纷投入巨资资助蛋白质组研究。 蛋白质分析是蛋白质组学中的重要课题，某些生命物质如多肽、酶、蛋白质、 激素等的分离和纯化更离不开蛋白质的定量测定1 5 j 。目前，蛋白质的分析方法研究 在不断发展，同时，小分子化合物与蛋白质豹相互作用机理研究也在不断深入。 1 1 1 蛋白质结构与功能 蛋白质是分子量很大的生物分子，分子量变动范围很大，从6o o o 到l0 0 0 0 0 0 道尔顿( d a l t o n ) 或更大一些。蛋白质是由2 0 种l 型a 氨基酸首尾相连而成的共 价多肽链，这些氨基酸被称为蛋白质氨基酸。这些氨基酸列于表1 1 ： 表1 12 0 种基本氨基酸 有机分析试剂与蛋白质的显色反应及其应用研究 构成蛋白质的氨基酸含有氨基和羧基，它既具有酸性，又具有碱性。除甘氨 酸外，氨基酸分子中会有不对称c 原子，因此它们都有旋光性。参与蛋白质组成 的2 0 种氨基酸在可见光区没有光吸收，但在近紫外区( 2 2 0r i m ) 均有吸收【6 】。 氨基酸在蛋白质分子中通过肽键( p e p t i d eb o n d ) 一c o - n h 一连接，形成共价多 肽链。肽链上氨基酸的排列顺序是由遗传物质d n a 的碱基顺序所规定的，氨基酸 的顺序是蛋白质的高级结构和生物功能的基础。可见，研究和开发蛋白质的分析 方法具有重要意义。 1 1 2 蛋白质的检测方法 蛋白质的检测主要有定性分析，结构测定和定量分析三个方面。 1 i 2 1 定性分析方法 蛋白质的结构特性决定了蛋白质具有一些特征的理化性质和特征的化学反 应，它们可以用于蛋白质的定性检验。 1 双缩脲反应，双缩脲在碱性溶液中与c u s 0 4 反应，生成紫红色络合物。而 蛋白质中的肽键与缩脲结构相似，故能显此反应。 2 c u s 0 4 反应蛋白质与c u s 0 4 反应，显紫红色。 3 米伦反应米伦试剂是h g ( n 0 3 ) 、h 9 2 ( n 0 3 ) 2 、h n 0 3 和h n 0 2 的混合物， 它与蛋白质反应，生成白色沉淀，加热后沉淀转变为红色。 4 乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁缓缓加入浓硫酸， 在两层问呈现紫色环。 5 茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热，则产生紫色的茚三酮、还原性茚三酮 和氨的缩合物。 1 1 2 2 蛋白质的结构测定 2 硕士学位论文 蛋白质结构的测定是蛋白质研究的重要内容之一，其研究的内容包括蛋白质 分子量的测定、肽链氨基酸排列顺序测定( 测序) 和高级结构鉴定。 1 分子量的测定方法 早期采用超离心和光散射技术测定蛋白质的分子量。6 0 年代初采用凝胶过滤 法确定蛋白质的分子量，常用的方法是s d s p a g e 法。近年，毛细管电泳和质谱 法的出现，使蛋白质分子量的测定精度大大提高，精确度约为o 0 2 0 。质谱法更 是测定蛋白质分子量的有力工具。 2 氨基酸序列分析 利用蛋白质末端( n 端和c 端) 的特征反应，然后借水解的方法，使末端氨 基酸与蛋白质链分离，这样逐段检测断裂下来的氨基酸而实现氨基酸测序。对于 n 端可采用d p n 法、e d m a n 法和丹磺酰法。 ( 1 ) d p n 法d p n 法于1 9 4 5 年由s a n g e r 提出，采用2 - 4 二硝基氯苯与肽链 n 端稳固的结合再进行水解反应，从而n 端第一个氨基酸与肽链脱离。 ( 2 ) 丹磺酰法丹磺酰法较d p n 法更灵敏。常用丹磺酰氯做试剂，与蛋白质 中n 端氨基酸反应，而丹磺酰基有很强的荧光，通过测定荧光，便可检测n 端氨 基酸。 ( 3 ) e d m a n 法e d m a n 法于1 9 5 0 年提出，采用异硫氰酸苯与蛋白质n 端氨基 反应，脱落氨基酸后又形成新的n 端蛋白质，从而测定整个肽链的氨基酸序列。 目前，该法被广泛用于蛋白质测序。1 9 7 0 年发展成为一种全自动测序方法。 ( 4 ) 对于c 端氨基酸进行测序时，最早使用的方法是肼解法。以后又发展了 羧肽酶法。羧肽酶能够专一的使肽链c 端的第一个氨基酸脱落。 ( 5 ) 质谱法目前多采用质谱测序。首先酶解蛋白质，经h p l c 分离纯化， 得到肽段，再以m s m s 测定个肽段序列，找到其重叠部分，从而获得整个蛋白质 的序列。 生物体内的蛋白质分子具有一条或数条多肽链。多肽链不是一条直线，也不 是无规则的任意线团，而是在空间中有特定走向和排布的高级结构，它又称为空 间结构、立体结构、三级结构等。蛋白质的高级结构对于生物功能具有特殊的重 要性，因此蛋白质的高级结构鉴定是蛋白质组学研究的重要内容。 根据蛋白质所处的环境，蛋白质高级结构的鉴定法有两大类，对溶液中的蛋 白质可采用核磁共振法、园二色法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法和紫外光谱法 进行鉴定，而对于晶体蛋白质则采用x 射线法和中子衍射法来鉴定。 1 1 2 3 蛋白质的定量分析方法 蛋白质定量分析是蛋白质组学研究的基础。蛋白质纯度越高，蛋白质组学研 究的结论越可靠。因此，蛋白质的许多新型定量分析方法研究正在引起许多生命 有机分析试剂与蛋白质的显色反应及其应用研究 科学工作者的关注。 1 经典方法 在蛋白质的含量测定中常用的经典方法归纳如下。 ( 1 ) 凯氏定氮法【7 8 】 该方法是丹麦化学家凯道尔提出的，其依据是蛋白质中含氮量大体上一致 ( 1 4 1 9 ) 。将蛋白质样品与硫酸强热，蛋白质中的氮元素全部形成氨离子，便 用酸碱滴定法测定n 的含量而得到蛋白质的含量。该方法特别适用于构造及其组 成比较复杂的样品中蛋白质含量的测定。可惜该方法在测定前必须除去与待测物 共存的非蛋白态氮化合物，同时，在构成蛋白质的氨基酸有偏差的情况下，特别 是含有大量碱性氨基酸、酰氨和小分子量氨基酸时，测量误差大，操作繁杂8 1 。随 后，对此方法进行了改进。陆浇滨等1 9 1 用硒粉作催化剂消化蛋白质，提高了觊氏定 氮法的分析测定速度。黄建春1 0 1 应用甲醛定氮法测定食品中蛋白质的含量，省去 了蒸馏过程，直接滴定，结果较为满意。 ( 2 ) l o w r y 检测法【7 i l o w r y 法又称f o l i n 酚试剂法。蛋白质或多肽大分子中含有的酪氨酸或色氨酸 等芳香氨基酸能与f o l i n 酚试剂发生氧化一还原反应形成兰色复合物，它在7 4 5 7 5 0n m 处有最大吸收，其吸光度值与蛋白质浓度成正比，可根据7 5 0n l l 吸光度值 来计算蛋白质的含量。该法灵敏度高，操作简便，但选择不强，易受共存物影响。 l a r s o n 等【l l 】对f o l i n 酚试剂法进行了改进。利用还原n - 硫苏糖醇( d t t ) 加 快f o l i n 一酚试剂还原速度，缩短了分析周期，提高了测定的灵敏度。康建等1 2 1 也 对该法进行了改进，改进后的l o w r y 法被广泛应用于蛋白质的测定，可惜在该法 中使用的d t t 价格昂贵。石磊等【1 3 1 用连二亚硫酸钠代替d t t ，可促使四元复合物 中结合的f o l i n 酚试剂充分还原，使反应迅速完成，比d t t 法有更高的显色稳定 性，且试剂价格低廉。 ( 3 ) 双缩脲法 双缩脲法也是早期使用的蛋白质定量分析方法【l ”。在强碱性溶液中，双缩脲 与c u 2 + 形成稳定的紫红色配合物，可用分光光度法测定蛋白质含量。该法灵敏度 不高，选择性不强。 陶健等”j 对双缩脲法的试剂和测定条件进行了优化，从而使双缩脲法灵敏度 提高，准确度和精密度也显著提高。 ( 4 ) 紫外分光光度法【7 j 蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸等芳香族化合物氨基酸，在紫外光区有 强吸收，最大吸收波长在2 8 0n m 左右，其吸光度值与蛋白质浓度成正比，可用来 测定蛋白质含量。 蛋白质中存在肽键，当照射光波长在2 4 0n m 以下时吸光度值急剧地增加，在 4 硕士学位论文 2 1 5n m 的吸光度值是2 8 0n m 处的吸光度值的数倍。而两个波长处吸光度值之差与 蛋白质浓度成正比，利用此可进行蛋白质的含量测定。 ( 5 ) 考马斯亮蓝法( b r a d f o r d 检测法) 【1 6 】 考马斯亮蓝能与蛋白质分子中的疏水微区相结合，形成兰色复合物。考马斯 亮蓝g 2 5 0 随溶液酸度不同而呈现不同颜色。在酸性条件下，用乙醇配成橙黄色 的溶液，a 。，为4 6 5n m ，当与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，a 。，为5 9 5n m ， 反应迅速而稳定。在5 9 5r i m 处的吸光度值与蛋白质浓度成正比，可用来测定蛋白 质的含量。考马斯亮蓝法用于测定蛋白质灵敏度高，耗时短。 杨晋【”1 等对这个方法进行了研究，推荐用此法测定蛋白质的适宜条件为温度 不低2 4 ，反应时间不少于3m i n 。 ( 6 ) 4 一喹啉甲酸法( b c a 法) i l 副 b c a 检测法由l o w r y 于1 8 9 5 年提出，它是一种l o w r y 检测法的改进方法。 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与c u 2 + 络合生成络合物，同时将c u z + 还 原成c u + 。而b c a 可特异地与c u + 结合，形成稳定的红紫色复合物，最大吸收波 长在5 6 2n m ，其吸光度值与蛋白质浓度成正比，可用来测定蛋白质的含量。此法 灵敏度高，选择性好，与l o w r y 检测法相比几乎没有干扰物质的影响。 除了上述方法以外，还有很多其他方法，如折射率法、放射法、同位素法、 比浊法、茚三酮法等。 2 分子光谱法测定蛋白质的新进展 随着蛋白质组学研究的启动，蛋白质的定量分析方法研究日趋活跃，用紫外一 可见分光光度法测定蛋白质含量的报道越来越多。许多新型蛋白质显色剂在不断 出现，究其原因是由于紫外可见分光光度法不需特别装置，操作简便，快速准确， 测定成本低。而紫外可见分光光度法选择性较差，寻找蛋白质专一的显色齐n 是生 物化学工作者追求的目标。 ( 1 ) 溴甲酚绿( b g g ) 法 魏永巨等【1 9 】研究b g g 与b s a 的反应。在p h 为4 2 时，b g g 溶液呈黄色，l 。 为4 4 5n m ；b s a b g g 复合物为绿色，最大吸波长在6 2 8n m ，b s a 浓度在3 o x l 0 4 t o o l - l 3 o 1 0 m o l l j 范围内复合物的吸光度与蛋白质浓度成正比。该方法简 便快捷，灵敏度和精确度高。 ( 2 ) 溴酚蓝( b r o m p h e n o lb l u e ，b p b ) 法 s c h o s i n a k y 等利用b p b 与白蛋白的结合反应创立了b p b 法测定蛋白质，该反 应速度快，稳定性好。孙明洪【2 0 1 根据“蛋白质误差”原理在b p b 中加人一定量的 有机溶剂以改变球蛋白的氨基酸残基结构，使b p b 与球蛋白和自蛋自的反应基本 一致，可用于尿中总蛋白的测定。 ( 3 ) 藻g e ( e r y t l u m i nb ，e b ) 法 e 有机分析试剂与蛋白质的显色反应及其应用研究 s o e d j a k 等【2 1 】报道，在p h3 左右的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液中，e b 显橙红 色，最大吸收波长在4 9 8n m 左右，与蛋白质形成的复合物呈红色，最大吸收波长 在5 4 5n n 处。显色反应可在室温下完成，而在9 0 9 5 反应速度更快，灵敏度更 高。 ( 4 ) 羟基葸醌类化合物法 杨晓波等【2 2 】研究发现，在酸性条件下，茜素红与蛋白质的反应产物在5 4 0n m 处有最大吸收，蛋白质含量在0 1 4 0g l 。1 范围内吸光度与蛋白质浓度成正比。反 应可在5m i n 内完成，颜色稳定1h 以上。迟燕华等【2 3 】研究了蛋白质与茜素红s 的显色反应。在p h4 3 的b r i t t o n r o b i n 缓冲溶液中，茜素红s 与h s a 结合生成 红色复合物，试剂的最大吸收波长在4 2 0n m ，h s a a r s 复合物的最大吸收波长在 5 3 0n m ，复合物的吸收峰比茜素红s 的吸收峰红移1 1 0n m ，为1 o 1 0 4 l m o l - ic m 。表面活性剂可使复合物的吸光度值增加5 0 。h s a 浓度在1 0 9 0 0 m g l 。1 范围内，复合物的吸光度值与h s a 浓度成线性关系，最低检出限为3 m g l 一。 茜素络合腙( a l c ) 是另一种蒽醌类化合物，与稀土元素形成配合物，具有优良 的电分析化学特性【2 4 1 。a l c 与蛋白质呈灵敏显色反应2 5 1 。在p h3 7 的b r 缓冲 溶液中，a l c 与b s a 形成红色复合物，a 。为5 4 0n m ，为7 5 1 0 4 l - m o l - 1c m ， b s a 浓度在5 0m g l 。1 7 0 0m g l 1 范围内，服从b e e r 定律。迟燕华等2 6 1 研究了 3 - 【二( 羧甲基) 氨甲基】1 ，2 一二羟基葸醌( a f b ) 与牛血清蛋白结合反应，在p h4 1 的缓冲溶液中，生成紫色的复合物。此复合物的吸收峰值在5 1 0n l t i ，与试剂本身 相比较，红移9 0n l t l ，该反应符合s c a t c h a r d 模型。所提出的方法可直接用于血清 中白蛋白含量测定。 ( 5 ) 变色酸双偶氮类化合物法 变色酸双偶氮类化合物用于蛋白质测定的报道很多，如偶氮胂i i i 、偶氮磺、 埃铬蓝、羟基偶氮砷i i i t 2 、溴偶氮磺i i i 及氯磺酚s t 2 9 1 等均是蛋白质的优良显色 剂，灵敏度高，与b c b 法相近【3 “。 郑洪等 3 1 1 采用自己合成的水溶性近红外试剂七次甲基花菁，在近红外区测定 血清蛋白质，具有背景干扰小、灵敏度高等优点，检出限为5 0 1 0 4 9 m l ，在1 0 0 1 9 0 0g g l 。范围内线性关系良好。 胡庆红等利用变色酸2 b 3 2 1 和变色酸2 c 3 3 1 等一系列变色酸单偶氮染料，在p h 1 o 2 0 的c l a r k l u b s 缓冲溶液中与蛋白质反应形成复合物使染料褪色，可用于 测定多种蛋白质，不同蛋白质在0 3 0l a g m l 。至0 5 0l a g m l 。范围内服从比尔 定律。胡庆红等【3 4 1 发现，使用铬蓝s e ( c b s e ) 可使线性范围增至0 8 0l a g m l 一， 可用于人血清中总蛋白质量的测定。 胡秋娈、李娜等用氯磺酚s t 2 9 1 、偶氮胂k t 3 引、硝基磺酚c 和硝基磺酚s t 3 7 1 与蛋白质反应，灵敏度高，线性范围宽，各种蛋白质线性范围在2 个数量级以上， 6 硕士学位论文 可测定不同蛋白质，用于实际人血清样品中蛋白质总量的测定，回收率和重现性 都较好，当改用偶氮月, i i i t 孙3 9 l 时线性范围宽可达2 3 1m g l 一。 杨平华等m 谰偶氮胂i 在p h3 2 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液中与蛋白质反应 形成红色复合物，此体系可不经任何预处理直接测定生物样品中的蛋白质含量， 线性范围可达1 3 2 2 3 1m g l 。张正奇等f 4 i 】用偶氮胂m 在p h2 5 缓冲溶液中与 蛋白质反应，测量蛋白质的线性范围为3 3 2 5 4m g l ，可直接用于血清、花生 等生物样品中蛋白质含量测定。 曹秋娥等【42 】用偶氮胭脂红b ( a b x ) 在室温下与蛋白质反应形成红色复合物来 测定蛋白质，蛋白质浓度在2 5 1 2 0m g l 。1 范围内，复合物吸光度与蛋白质浓度 成正比，除阴、阳离子表面活性剂外，大部分物质都不干扰蛋白质的测定，可用 于尿液及人体血清样品中总蛋白的测定。 ( 6 ) 溴连苯三酚红法 陈颖等【4 3 】发现，在酸性介质中，蛋白质能和溴连苯三酚红结合成为超分子化 合物，用硝化纤维素滤膜富集蛋白质溴连苯三酚红复合物，其最大吸收波长为4 2 5 n m ，当富集倍数为5 0 时，本方法的检测限为7 g l ，蛋白质在5m l 溶剂中的 含量为o 3 5 0g g 时符合朗伯比尔定律。 ( 7 ) 曙红类试剂法 乙基曙红的吸收或褪色作用均可用于蛋白质的分光光度测定【4 4 】，褪色光度法 灵敏度更高。李华岑等【4 5 l 研究了用曙红b 测定人血清白蛋白并求得最大结台数为 2 0 0 ，在浓度5 5 0 m g l 1 范围内呈良好线性关系，检出限达0 6 9 m g l 一。 ( 8 ) 固绿f c f 法 马卫兴等( 4 6 l 研究了固绿f c f 与血清蛋白质作用，找到了该结合反应的最佳条 件，并在此基础上建立了测定蛋白质的新方法，用于测定牛血清白蛋白、人血清 白蛋白及球蛋白，所得结果与考马斯亮蓝g 2 5 0 法基本一致。 ( 9 ) 酸性品红法 罗宗铭等【4 7 】研究了用酸性品红与蛋白质的结合反应，所提出的方法用于奶粉 和麦片中蛋白质含量测定，结果满意。 ( 1 0 ) 刚果红法 詹国庆等【48 】研究了刚果红与蛋白质显色反应的条件，建立了以刚果红测定蛋 白质的分光光度分析法，用于人血清样品中总蛋白质的测定，取得了满意的结果。 ( 1 1 ) 荧光素法 张威等h 9 1 采用3 ，6 - 二氯荧光素测定蛋白质，蛋白质在3 1 0 8 3 1 0 7g - l 1 范 围内符合比尔定律，回收率在9 0 1 0 1 之间。庄惠生等 s o l 使用四溴荧光素( t b f s ) 作为蛋白质的显色剂，用于b s a 的测定，b s a 浓度在0 1 1 6 0 0l a g - m l 1 范围符 合比耳定律，结果满意。王海人等【5 1 l 利用荧光素与牛血清蛋白相互作用，提出了 有机分析试剂与蛋白质的显色反应及其应用研究 b s a 的分析方法，该法线性范围宽，灵敏度高，方法简便，快速，干扰少，应用 于合成样品中蛋白质测定，测定结果令人满意。 ( 1 2 ) 锌试剂法 迟燕华等【5 2 3 1 研究了锌试剂与蛋白质反应，建立了以锌试剂测定蛋白质的分 光光度分析方法，应用于人血清中总蛋白质量测定，在检测限内符合比耳定律【5 3 。 ”】。他们还研究锌试剂与p e p s i n 相互作用的机理，锌试剂与牛血清白蛋白在弱酸 性溶液中反应，符合s c a t c h a r d 模型。 ( 1 3 ) 铍试剂法 胡秋娈等【5 5 】研究了铍试剂i i 与牛血清白蛋白显色反应的适宜条件，制定了几 种蛋白质的工作曲线，并测定了人血清样品中总蛋白质。 ( 1 4 ) 水溶苯胺蓝法 刘希东等【5 6 1 研究了水溶苯胺蓝( a n b ) 与牛血清白蛋白在b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲 介质中的结合反应，提出了测定蛋白质的新方法，该方法具有灵敏度高、选择性 好等特点，用于人血清样品中蛋白质的测定与溴甲酚绿法结果一致。 陈莲惠等5 7 1 研究了在p h1 0 2 3 的酸性介质中，水溶性苯胺蓝与牛血清蛋白、 人血清蛋白、卵白蛋白、旺糜蛋白酶作用，形成的产物在6 3 4n m 附近吸光度增强， 且吸光度差值与蛋白质浓度成正比，不同蛋白质分别在o 5 0m g l 4 或2 0 8 0 m g l 。1 范围内符合比耳定律。据此，建立了一种光度法测定蛋白质的新方法。 马卫兴等1 5 8 1 在p h = 2 3 6 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲介质中，研究了水溶苯胺蓝与 蛋白质的反应，制定了4 种蛋白质的标准曲线，用于人血清样品中总蛋白的测定， 结果与溴甲酚绿法一致。 ( 1 5 ) 酸性铬蓝k 法 朱铿等研究了不同酸度下，酸性铬蓝k 与牛血清白蛋白的作用情况，求出 了不同条件下酸性铬蓝k 与牛血清白蛋白的结合个数或结合常数，并用三种不周 的方法相互进行对照，证明酸性铬蓝k 在牛血清白蛋白上有两类不同结合部位。 卢业玉等6 。1 发现在p h1 3 0 的氯乙酸缓冲溶液中，在t r i t o n x 1 0 0 存在下，酸 性铬蓝k 用于测定卵蛋白，结果比较理想。并将该方法用于豆粕浸提液中蛋白质 的测定，分析结果满意，还探讨了卵白蛋白与酸性铬蓝k 形成复合物的反应机理。 ( 1 6 ) 水扬酸法 龚仁敏等6 1 】提出了一种测定蛋白质新方法，样品与浓硫酸共热，蛋白质中的 氨基氮转为氨，氨由水扬酸盐光度法测定，本法中有色化合物的最大吸收波长在 7 0 0n l n ，以氮计，表观摩尔吸光系数6 7 0 0 = 1 4 1 0 4 l m o l - 1e m ，测定蛋白质的线性 范围o 5g g - m l ，最低检出限为6 9n g - l 一。石允生等 6 2 1 以水杨酸为显色剂测定 乳制品中蛋白质的含量。 近年利用金属离子一染料一蛋白质多元体系测定蛋白质的报道迅猛增加1 6 3 “引。 r 硕士学位论文 ( 1 ) 邻苯三酚红钼法 f u j i t a 等【6 3 1 ，w a t a n a b e 6 4 】报道，当蛋白质加入邻苯三酚红钼络合体系中时， 吸收波长发生移动，且吸光度值与蛋白质的加入量在一定范围内呈线性关系，据 此可测定蛋白质。 g u i l l a u m e 等【6 6 l 考察了邻苯三酚红钼、邻苯三酚红s d s 钼、邻苯二酚紫钼三 种体系对尿中总蛋白测定的影响，分别以白蛋白球蛋白混合体系及骨髓瘤液为试 样，通过比较回收率，发现邻苯三酚红s d s 。钼为测定肾病患者尿总蛋白的最佳体 系。 t h o m a s 6 7 1 ，w i l l i a m 等6 8 1 以邻苯三酚红钼( p r m ) 体系测定了尿样中的蛋白质， 重复性好。k o s a k a 6 9 1 ，c a s t e t a l 7 0 1 ，h i r o k a n e 等7 1 1 也报道过一系列苯酚磺酞酸类染 料金属离子络合体系测定蛋白质的方法。 ( 2 ) 3 ，4 ，5 ，6 四氯茜索紫- 钼( t c 1 g a l l - m o ) 法 f u j i t a 等【7 2 1 发现在t r i t o nx 1 0 0 和p v a 存在下，t c 1 g a l l m o 络合物与h s a 的反应导致溶液在6 4 0n m 处有一最大吸收峰，吸光度值与h s a 在o 1 5m g l 。 范围内成正比。f u j i t a 等【7 3 1 提出3 ，4 ，5 ，6 - 四氯茜素紫m o ( v i ) ，加入表面活 性剂t r i t o n x 1 0 0 + p v a 。该体系用于蛋白质的测定，线性范围为o 1 5p g m l ， 加入尿样后在2 m , = = 6 4 0 n l l l 处可定量测定蛋白质。f u j i t a 等7 4 1 f 1 5 开发了新体系，即 3 ，4 ，5 ，6 - 四氯茜素紫m o ( v i ) j 1 1 表面活性剂t r i t o n 4 0 5 p v a 体系，与蛋白质 形成的络合物a 。为6 4 0n m 。 ( 3 ) 4 ，5 - 二溴苯基荧光酮- 钛( ) 法 汤桂娜等7 5 1 研究发现：在p h2 7 3 7 的柠檬酸钠盐酸缓冲溶液中，在t w e e n 8 0 存在下，4 ，5 一二溴苯基荧光酮t i ( ) 络合物与蛋白质发生结合反应，最大 吸收峰位于6 0 5n m 处，在一定条件下，溶液吸光度值与蛋白质浓度成正比。线性 范围为0 6m g l 一，干扰小，操作简便、稳定性好，可不经分离直接用于尿液中 自蛋白的测定。 ( 4 ) 铬天青s a 1 ( ) ( c a s - a 1 ) 法 s a t i o 等7 6 1 发现在p h3 7 的醋酸缓冲介质中，c a s 与a 1 ( i i i ) 及人血清白蛋 白( h s a ) 形成三元络合物，最大吸收峰位于6 3 0n l n 处，并与h s a 浓度成正比。方 法简便快速，线性范围宽( 1 2 5 2 5m g l 1 ) ，灵敏度比b c g 法高8 倍。魏永巨等7 7 1 研究了铬天青s ( c a s ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 在酸性溶液中反应前后的吸收光谱， 认为c a s 与b s a 主要通过静电引力而结合。发现这一探针反应不符合s e a t c h a r d 模型，提出了处理此类体系溶液平衡的一个新的线性回归方程，由此方程可以求 算结合常数、最大结合数以及吸光系数等参数。 ( 5 ) 铬天青s ( c a s ) 。铁( 1 i i ) 法 魏永巨等1 7 8 1 发现p h3 0 时铬天青s 在4 9 0n m 处有最大吸收，与铁( i i i ) 结合后 9 有机分析试剂与蛋白质的显色反应及其应用研究 最大吸收移至5 7 0n n l 处，蛋白质加入后5 7 0n n l 处吸收降低，并在6 6 0n n l 处出现 新的吸收峰，且随蛋白质的增加吸光度值增大；而p h6 0 时铬天青s ( c a s ) 在4 3 4 n m 处有最大吸收，与铁( 1 1 1 ) 结合后5 7 0n m 处吸收峰消失，但三元络合物仍有强吸 收，两种条件都可用于蛋白质测定，前者灵敏度高且稳定时间长，后者与空白溶 液颜色区别明显。对b s a 桑德尔灵敏度前者是o 0 4g g c m ，后者是0 0 6g g c n l 。 ( 6 ) 偶氮胂镱( i i i ) 法 俞英等7 9 1 采用偶氮胂一镱( i i i ) 体系测定蛋白质，发现随蛋白质的加入，偶氮胂 与镱( i i i ) 结合后出现的6 0 0n m 和6 5 0n m 两个峰吸光度降低，以6 5 0n m 为测量波 长，吸光度的降低与蛋白质的含量成正比，反应速度快，1r a i n 可达平衡，可稳定 2 5h ，对牛血清白蛋白的线性范围为o 3 5m g l 。 ( 7 ) 铁二甲苯酚橙法 c r a i g 等【8 0 】用铁二甲苯酚橙法测定人体血清中蛋白质，效果良好。 ( 8 ) b a 。偶氮氯膦i i i 法 刘典梅【8 l 】发现在p h1 0 1 5 的酸性介质中，蛋白质与b a 一偶氮