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文档简介

摘要 歼发功能往食品或新药用以增强机体的免疫功能懋近年来食品生亿领域的 研究重点,当前的免疫调节制剂多从植物和由乳动物的血液中提取,成本高且 安全毪雅以徐障,工程媾疆 乍为具有躐大免疫功能的资源琵虫,兵寄养殖篱单, 繁殖迅速等特点,有望成为低廉且安全的免疫制剂来源。 本论文采鲻家筑律为工程蝇静,对于家撬免疫活蠖物痿一凝集素瓣缝纯耨 生理活性进行了系统的研究,荫次采用戊二醛固定化红细胞吸附法粗撮凝集素, 以及磷究了家魏凝集素数抗蘩鞠免疫溺苇功笺,为嚣发家蠛凝集素这耘羹兔 疫制剂提供了理论依据。同时,为了保证资源的综合利用,研究了家蝇中所含 熬舅一类免疫瀵牲兹矮甲壳襄与壳聚蕤匏提墩工艺。 采用戊二醚固定化组细胞吸附法结合s e p h a r o s e 4 b 亲和层析纯化凝集素。 戊二醛狻定位红缀照啜爨法为筵步粮提,爨缓魏浓震为1 5 ,将红镪瑰与巍 淋巴混合吸附,离心厝得到红细胞一凝集素混台物,科用半乳糖解吸附,所得 糖提携盘凝比活力掇麓了5 3 3 嫠,哥用予其洼震熬餐步磷究。避步嗣 s e p h a r o s e 一4 b 亲和层析柱( 1 1 c m 3 0 c m ) 纯他,加样魑2 m l ,样品浓度1 l , 所缛缝化产物比活力掇褰到盘淤巴的1 0 6 6 结。 亲和层析厝的家蛹凝集素电泳表现为单一糖蛋白,其分子爨为8 4 k d ,s d s 浆丙燎黻黢凝胶电泳 配铡反应液将p h 值调至8 0 。沸水浴 1 5 r a i n n 加入酶p r o t a m e x 0 2 5 l ( 占反应液中蛋& 量的露分比) ,反皮温度为 5 5 v ,反应时间为2 4 4 8 h ,再掰沸水浴加热1 5 m i n ,冷却过滤。 2 t 2 1 1 3 利嬲经外光谱测定甲竞褰的食餐 采用压片法,将提取的蝇螅及虾浅甲壳索1 2 m g 烘干与玛瑙研钵中研成 2 譬1 1 1 左右蕊甥羚e 按l ;1 0 0 2 0 0 ( 样菇:k b r ) 在于澡环境下辑瘩溱台。取 样品k b r 混合粉末约2 0 0 m g 于压片机的模具中,铺平并加1 0 9 c m 2 的压力,保 持5 m i n ,压成矗径1 3 r a m ,厚2 r a m 静透明薄片,并以纯k b r 片作为补偿片, 放入红外光谱仪中进行测定。 2 2 i i 4 除色素的方法 - 2 3 , 方法一:将除去灰分和蛋白质的样品1 9 ,用1 2 0 m l9 5 的乙醇洗涤除去色 素,进一步用2 0 m l 丙酮,5 0 m l9 5 彬3 乙醇和1 0 n a l 乙醚依次洗涤,然后十燥 至恒重,即为产品甲壳素。 方法二:用1 k m n 0 4 溶液浸泡,氧化除色素,用n a s 0 3 溶液还原过量的 k m n o 。反复洗涤、抽滤,然后用1 :4 0 的稀h c i 煮沸,抽滤,然后干燥至恒重, 即为产品甲壳索。 2 2 1 1 5 原料水分的测定 准确称量样品1 0 9 ( 精确至o o l g ) ,放入己知重量的容器中,放入1 0 0 。c 的 干燥箱中,干燥到恒重,冷却,称重。 2 2 1 2 壳聚糖的制备与研究 22 1 2 1 壳聚糖的制备 方法一:按1 :5 0 ( 质量体积比) 的比例将甲壳素与4 0 的n a o h 混合,在 水浴锅内,在沸水浴下反应3 h ,过滤,再按上比例,加入4 0 的n a o h ,在沸 水浴卜再反应3 h ,过滤,水洗至中性。再以l :5 0 的比例溶于l o 醋酸溶液 中,搅拌浴解1 h 后,过滤,取过滤清液调其p h 值到7 ,出现絮状沉淀即壳聚 糖,离心分离,在8 0 。c 下干燥,即得固体壳聚糖。此方法的反应温度为1 1 8 。c ( 4 0 n a o h 沸腾温度) 方法:二:按1 :5 0 ( 质量体积比) 的比例将甲壳素与4 0 的n a o h 混合,在 高压灭菌锅内,控制压力为0 1 3 0 1 4 m p a ,反应6h 。再按上述分离提取的方法 提取壳聚糖,此方法的反应温度为1 3 0 。c 。 221 2 2 壳聚糖游离氨基及脱乙酰率的测定( 酸碱滴定法) 用分析天平准确称取0 , 5 9 壳聚糖( 精确至o 0 0 0 1 9 ) ,用移液管移取2 0 m l 0 3 m o l l 标准h c l 溶液,溶解壳聚糖。用标定好的酸度计电极插入溶液中,放 入转子,丌动搅拌器,用0 1 m o l l 标准n a o h 溶液滴定,每滴0 5 m l n a o h ,记 录一次p h 值,一直滴到p h 为1 2 ,利用v n 。o h p h 值关系绘出滴定曲线。 221 2 3 壳聚糖粘度的测定 称取脱乙酰壳聚糖o 8 1 9 溶于1 0 的醋酸溶液中,定容到1 0 0 m l ,用n d j 一9 1 型旋转粘度汁测定其相对粘度( n ,) qr = r l no n 和n 0 分别是稀溶液和纯溶剂的粘度,因而nr 是无因次量。 天津辩投大学硕” ? 学位论甏 3 结果与讨论 3 1 戊二醚固定兔血红细胞吸附法纯化凝集素 在以往凝集索酶糕提一般是采耀羧掇,然鹾褥遂 予屡捉等操馋,慧凝屠 的灏白质纯度低,无法用于凝集素性质的初步研究,本论文采用了红细胞吸 辫法凝提窳撬凝集素,取褥了摄好游效果。 3 i 1 戊二醚固定兔血红细胞法纯化凝集素的原理 盘缩艇酌表面含有各种各祥鹤耱链结构,从而可以和多种凝集索发生结 合。在前人的研究中,已知家蝇凝集素特黪性结合d 半现糖,丽兔纽细胞表 面含有d 半乳耱结构,因此采用兔衄红细胞吸附凝集素。由于吸附过程需要 攫搀,盘漤巴中还含骞离子,这些都可能零羲红缨魅骏薅溶蠹,瑟萎,经绥 胞的存放时间短+ 所以本实验采用戊二醛固定化红细胞进行吸附操作。戊二 醛怒一静双功糍试裁,绫捣式势c h o - - ( c h 2 ) ,- - c h o ,两个反成活瞧的醛基, 可与红细胞表面的自由氨基或胍基结合,从而使红细胞之间相连,反应式为: r b c - - n h 2 + c h o - - ( c h 2 ) - c h o + r b c - - n b 监r b c - - n = c n 一( c h 2 ) 3 一c h = _ n - r b c ( i ) 相连聪的红细胞机城强度增加,不易破薅溶照,曝嚣时阉长,不爨每次 采m ,而鼠戊二麟不破坏红细胞表面的糖链结构,不影响红细胞的吸附性能, 羁瑟霹醴瘸戊二醛曩定纯题绥蕤进行汲辫帮以后豹鑫凝实验【秘】。 3 1 2 提取工艺参数的确定 本实验采焉缎缩魏扶盘辩既中i 毅辩凝集索,褥翔凝檠索一红细胞溉台物, 再崩d - 半乳糖解吸附。因此,红细胞与家蝇血、湛殿在吸嫩时的比例、吸臻时 问以及半乳精解嗷附的浓度和时间成为提取中的重委参数,本实验对这几个 参数进行了枣刀步伐忧。 ( 1 ) 1 5 红细胞与血淋巴得率的影响 o 0 0 8 00 0 6 00 0 4 o0 0 2 0 厂 、 024 6 鼓舞 麓,斑辩墨 图3 1 1 5 c 细胞与觑淋巴比例对得率的影响 图3 - - 1 是红纲麓与斑济跫珑镶对得率静影响,觚中可以看出,红细胞与血 淋巴k e n n * ,凝集素得率越离。在比例达到3 :1 之后,褥率的野赢已趋予 平缓。为了采周最经济、效率最高的提取方法,所以选用遮一比例进行吸附。 ! 丝墨生塑堡一 ( 2 ) 红细胞与血淋巴吸附时问对得率的影响 。0 0 。: 戮| | o 02qb 吸附时问( h ) 图3 2 吸附时间对得率的影响 图3 2 表示吸附时间对得率的影响,从中可以看出,吸附时间越长,凝 集素得率越高,但在2 5 h 后,得率不再有明显变化,因此,吸附时间选用2 5 h 。 ( 3 ) 半乳糖解吸附时间对得率的影响 0 0 l 00 0 8 芝00 0 6 _ b 0 ,0 0 4 姑00 0 2 0 0246 牛乳精旬 ! 吸附时问( h ) 图3 3 半乳糖解吸附时间对得率的影响 图3 3 表示半乳糖解吸附时间对得率的影响,从图中可以看出,解吸附 时间越长,凝集素得率越高,但在2 5 h 后,得率不再有明显变化,因此,解 吸附时剧选用2 5 h 。 固定化兔血红细胞吸附法纯化样品古有一定量的杂蛋白。据报道这些杂 蛋白可能为血蓝蛋白,脂蛋白,纤维蛋白原和酚氧化酶,纤维蛋白原等聚合 成大的凝块,陷入固定化血红细胞中,酚氧化酶会和其它蛋白质作用形成聚 合体,陷入固定化血红细胞中。如果增加吸附后血红细胞一凝集素混合物的 离心洗涤次数,将有助于进一步减少杂蛋白。此种分离纯化万法需要进一步 改善,或者可以与其它纯化方法连用,达到纯化目的。 3 1 3 红细胞吸附法的应用意义 研究凝集索的提取与性质,首先要确定其糖结合专一性,知道了糖结合 专一性才能确定亲和层析的介质。在兔红细胞吸附血淋巴中的凝集素形成凝 集素红细胞混合物后,采用不同的单糖进行解吸附实验,再测定解吸附得 到物质的血凝活力,如果某种单糖解吸附的物质经检测证明为凝集素,说明 凝集素对此单糖具有结合特性。虽然在本实验中,家蝇凝集素的糖结合性质 已知,但当遇到一种糖结合特性未知的凝集素时,本方法就显示出相对于只 - 2 6 厂 厂 天津科技大学硕十学位论文 用亲和屠析法毯大的优越性。由于对样品的粗提物检测血凝往质具有很大的 误麓,研究凝爨素的盎凝性质往往需要纯化。在这秽悸 兄下,逐个试用亲粒 层析的配体成本很高,操作也很繁琐,而红细胞的成本很低;实验所需红细 照雏量只嚣强少( 死十毫秀左右) ,跌瑟捺俘也较为麓孳。晕l 鲻这一方法磷究 提取凝集索在国内属首次报邋,对搬集素的开发研究具有重要意义。 3 2 亲帮鬣褥法缝讫凝集素 02 5 0 2 麟o 1 5 絮 督0 1 00 5 d g a l a c t o s e 0 “9 “一一一一一。 0 2 0 04 0 06 0 0 就脱体积( 1 ) 图3 4 血细胞吸附的凝集素亲秘层析图 01 0 02 0 03 0 0 1 0 05 0 0 珧脱休糨( m 1 ) 题3 5 。盎漤巴亲耧垂辑鬣 图3 - - 4 是血细胞吸附的凝榘素亲和层析图。在亲和层析中,加样厝先用 琵虫生理黧永浇瓣,噩艺对凝集豢与s e p h a r o s e 4 b 结台,杂蛋自被洗虢,第一 个峰为杂蛋白,然后用d - 半乳糖洗脱,出于d 半乳糖与凝集素结合能力大于 s e p h a r o s e 4 b ,因藏凝集豢被解激附,所以出现的第二个峰是凝集素。从图3 4 可以看出,血细胞吸辫质毂凝集豢仍然客凑少量熬杂溪鑫,为了确囊鑫绥 胞吸附纯化的效果,将家蝇血淋巴直接进行索和层析,如图3 - - 5 ,第一个峰 躯霹稷远大予第二个峰懿嚣积,说明杂蛋蠢含量运远离子凝集素,这说明血 细胞吸附有效的纯化凝集索,所得的样品具荫一定的纯度。当然,要确切知 遵盎缀麓皲辫静绝纯簸栗,还需要通避后面的凝血宓验来判断。 3 。3 电泳图谱 jflijfjfff ! ! 塑皇坐l 一 图3 6 电泳图谱 带1 ( g r b c 吸附的家蝇凝集素) 和l 带4 ( 纯化的家蝇凝集素) :含b - 巯基乙醇的s d s - p a g e 带2 ( g r b c 吸附的家蝇凝集素) 和带5 ( 纯化的家蝇凝集素) :含b - 巯基乙醇的 s d s p a g e ,刚s c h i f f s 试剂染色 带3 ( g r b c 吸附的家蝇凝集素) 和带6 ( 纯化的家蝇凝集素) :非变性p a g e 在非变性p a g e 中,蛋白质不发生变性,二硫键不会被打开,蛋白质不 会解聚为亚基,6 号带表明,纯化的凝集素为单一蛋白,说明本实验采用的纯 化方法成功分离出了电泳纯的家蝇凝集素。s d s p a g e 中,蛋白质解聚为几 个弧基,亚基的分子量之和即为蛋白质的分子量。纯化凝集素在s d s p a g e 中出现3 条带,分子量为1 6 0 0 0 d a ,1 8 0 0 0d a 和5 0 0 0 0d a ,因此,电泳测得 家蝇凝集素分子量即为8 4 0 0 0 d a 。糖蛋白染色表明,分子量为1 6 0 0 0 d a 和 1 8 0 0 0d a 的两个亚基具有糖链结构,分子量为5 0 0 0 0 d a 的蛋白不含糖结构。 而红细胞吸附的凝集素粗提物含有杂蛋白,p a g e 表明,凝集素粗提物中的 杂蛋白可能只有一种,结合s d s p a g e 可知,这种杂蛋白含有三个亚基,其 中有两个亚基含有糖结构。 3 4 凝胶过滤( 凝胶色谱) 3 4 1 基本原理、优点和适用范围 凝胶过滤( g e l t r a t i o n ) 又称凝胶色谱、分子筛色谱、排阻色谱。一般多采用 交联葡聚糖凝胶。它含多羟基,具亲水性,经过交联,呈三维空间网状,不 溶于水。当干凝胶颗粒吸水后就成为多孔胶粒。当蛋白质溶液( 如血清) 加在 凝胶柱上,然后加洗脱液沈脱,大分子蛋白质不能穿过凝胶网孔进入胶粒内, 它们就留在胶粒外间隙的溶液申,随洗脱液最先流出。小分子蛋白质可以穿 过凝胶网7 l 进入胶粒内而受阻留,行程长,向下移动较慢,洗脱出较慢。这 样蛋白质根据分子大小不同依次洗脱出来而得到分离。 交联葡聚链凝胶( s e p h a d e x ) 是由线性结构的葡聚糖( 右旋糖酐) 经交联剂 最律稠控人学硕l :学位论文 f 3 。氯t ,2 一环氯雨靛) 交联而成。它是其有海绵样网状多孔酌珠形徽粒,控 制交联刘的比例,即可控制交联度,从丽得到不同孔径( 化网鼹片) 的凝胶璩。 交联度愈商,网状结构愈密,网眼愈小( 吸水量愈小) ,适用于分离小分子量物 矮。反之交联度愈低,网状结构愈松,鼹黢愈大( 暇承量愈大) ,遥翅子分离分 子量大的物质。常用葡槊糖凝胶的型号有八种,o 1 0 直到g 一2 0 0 ,常见性 囊觅表3 一妒“。 表3 1 各型葡聚糖凝胶的性质 g 一5 0 l5 0 0 3 0 ,0 0 0 g 7 53 0 0 0 7 0 ,0 0 0 g 1 0 04 0 0 0 j5 0 ,0 0 0 g l5 05 0 0 0 3 0 0 ,0 0 0 59 一l l 7 51 2 1 5 1 01 5 - - 2 0 l52 0 - - 3 0 g 一2 0 05 0 0 0 2 03 0 - - 4 07 2 5 5 0 0 0 0 0 由于电泳表鞠凝集豢分子激为8 4 ,0 0 0 d a ,而杂蛋白分子鬣与其接近, 因此,本实验采用

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