（食品科学专业论文）戊糖乳杆菌C506细菌素的纯化和特性研究.pdf

四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 摘要 摘要 为了获取广谱、高效的乳酸菌细菌素产生菌，本文对分离自四川传统发酵肉 制品( 香肠、腊肉) 中的9 1 株乳酸菌，以大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) a t c c2 5 9 2 2 、 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) a t c c2 5 9 2 3 、藤黄微球菌( m i c r o c o c c u s l u t e u s ) 1 0 2 0 9 、铜绿假单胞杆菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) a t c c2 7 8 5 3 、枯 草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 为指示菌，采用打孔法初筛，进一步通过排除有 机酸、过氧化氢干扰及发酵液的蛋白酶降解实验复筛，得到1 株产广谱( 能抑制 g + 菌和g 。菌) 细菌素的菌株c 5 0 6 ，经表型特征和1 6 sr d n a 系统发育特征鉴定为 戊糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s ) 。 采用单因素实验，对戊糖乳杆菌c 5 0 6 产细菌素的培养时间、温度、起始p h 条件进行优化，结果表明：将菌株c 5 0 6 种子液按2 接种量接入起始p h 6 0 的m r s 肉汤，经3 0 培养3 6 h 能获得较高的细菌素产量，其发酵液效价可达1 1 5 1 叫m l ， 是原培养条件细菌素产量的3 6 倍。 分别采用硫酸铵盐析、有机溶剂沉淀、正丙醇提取、p h 吸附几种方法对戊 糖乳杆菌c 5 0 6 细菌素进行粗分级分离，综合分析后选取效果最好的硫酸铵盐析 法。该细菌素的纯化步骤依次为：首先取发酵液离心得去菌体细胞的上清液，再 向其中加入硫酸铵固体粉末至饱和度7 0 ，静置过夜，离心取沉淀溶于p h 4 5 的 柠檬酸缓冲液得到细菌素粗提液，用相同的缓冲液进行过夜透析脱盐，再经过 s p t o y o p e a l 6 5 0 m 阳离子交换色谱纯化，采用含0 1 m o l ln a c l l 拘p h 4 4 的柠檬酸 缓冲液洗脱可得细菌素的活性峰，最终细菌素比活提高了3 9 倍，得率为2 1 8 。 经t r i c i n e s d s p a g e 检测该细菌素的分子量约为2 5 0 0 d a ，抑菌实验表明该蛋白 条带具有很强的抑菌活性，证实该电泳条带即是细菌素。 对细菌素的发酵液和粗提液的特性进行对比研究，发现发酵液在p h 2 o 一5 0 、 粗提液在p h 2 0 - 6 0 时显示活性；发酵液1 0 0 。c 耐受2 0 m i n ，粗提液具有更高的热 稳定性，1 2 1 加热2 0 m i n 后活性无损失；发酵液和粗提液都被木瓜蛋白酶和胰蛋 白酶失活，被蛋白酶k 部分失活，不被胃蛋白酶失活；发酵液和粗提液具有较一 致的抑菌谱，二者均能有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等g + 和g 。细菌、能抑 制戊糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s ) g 2 1 1 0 和植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 摘要 p l a n t a r u m ) c 2 1 6 等近源乳酸菌、对红酵母( r h o d o t o r u l as p ) 和青霉( p e n i c i l l i u m s p ) 也有微弱的抑制作用，细菌素粗提液的效价明显提高，经过排除有机酸干 扰后粗提液对g + 菌抑制作用更为显著。总之，戊糖乳杆菌c 5 0 6 所产细菌素在酸 性和中性环境下稳定、对热稳定、能被部分蛋白酶失活、抑菌谱较广，具有作为 食品生物防腐剂的潜在应用价值。 关键词：细菌素戊糖乳杆菌纯化特性乳酸菌 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 p u r i f i c a t i o na n dp a r t i a lc h a r a c t e r i z a t i o no fab a c t e r i o c i n p r o d u c e db yl a c t o b a c i l l u s p e n t o s u sc 5 0 6 a ol i n g ( f o o ds c i e n c e ) d i r e c t e db yl i us h u l i a n g ( a s s o c i a t ep r o f e s s o r ) a b s t r a c t n i n e t y - o n es t r a i n so fl a c t i c a c i db a c t e r i a ( l a b ) i s o l a t e df r o mt r a d i t i o n a l s i c h u a nf e r m e n t e ds a u s a g ea n dc u r e dm e a t w e r et e s t e df o ra n t a g o n i s t i ca c t i v i t i e sb y p u n c hm e t h o d c e l l f r e es u p e m a t a n t sf r o ms e v e no ft h e s es t r a i n sw e r es h o w nt o i n h i b i tt h eg r o w t ho ff o u ri n d i c a t o r s ( e s c h e r i c h i ac o l ia t c c2 5 9 2 2 、- 女印h y l o c o c c u s a u r e u sa t c c2 59 2 3 、m i c r o c o c c u sl u t e u s10 2 0 9 、p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aa t c c 2 7 8 5 3 、b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，w h i c hc o n t a i n e db o t hg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i aa n d g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ，a f t e re l i m i n a t i n gt h ei n t e r f e r e n c e so fo r g a n i ca c i da n dh 2 0 2 s t r a i nc 5 0 6p r o v i d e dt h em o s te f f e c t i v eo fi n h i b i t o r ya c t i v i t ya n dw a ss e l e c t e df o r f u r t h e rs t u d y t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fc e l l f r e es u p e m a t a n tf r o ms t r a i nc 5 0 - 6 d e c r e a s e ds h a r p l ya f t e rt h et r e a t m e n tw i t ht r y p s i na n dp e p s i n i tc o n f i r m e dt h a tt h i s i n h i b i t o r y m a t e r i a lw a sak i n d o fp r o t e i na n dc 5 0 - 6w a sab r o a d - s p e c t r u m b a c t e r i o c i n p r o d u c i n gs t r a i n i t sp h e n o t y p ec h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr d n as e q u e n c e a n a l y s i ss h o w e dh i g h l yh o m o l o g yt ol a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s s i n g l ef a c t o rl e v e lt e s tw a sa d o p t e d t oo p t i m i z et h ei n c u b a t i o nc o n d i t i o no ft h i s b a c t e r i o c i n a sar e s u l t ，t h eh i g h e s tp r o d u c t i o nw o u l db eo b t a i n e da ta d d i n g2 o f s e e d si n t om r sb r o t h ( p h 6 o ) ，c u l t i v a t i n g3 6 ha t3 0 c t h ep o t e n c yo fc e l l f r e e s u p e m a t a n tf r o ml p e n t o s u sc 5 0 6u n d e rt h eo p t i m a l i n c u b a t i o nc o n d i t i o nw a s 1151i u m l ，r e s u l t e di n3 6 - f o l di n c r e a s et ot h ep r i m a li n c u b a t i o nc o n d i t i o n c o n t r a s t i n g t h er e s u l t so f r o u g h f r a c t i o n a t i o nb ya m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，o r g a n i c s o l v e n t s p r e c i p i t a t i o n ，n p r o p a n o l e x t r a c t i o na n d p h a d s o r p t i o n ，a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n w a s f i n a l l y c h o s e nf o r r o u g h i i i 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 a b s t r a c t f r a c t i o n a t i o no ft h eb a c t e r i o c i n t h eb a c t e r i o c i nw a sp u r i f i e d s e q u e n t i a l l yf r o m c u l t u r es u p e r n a t a n t ，f i r s tp r e c i p i t a t e dw i t h7 0 s a t u r a t i o no fs o l i da m m o n i u ms u l f a t e ， t h e n p u r i f i e db ys p - - t o y o p e a l - 6 5 0 m c a t i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , u s i n g g r a d i e n tn a c ic o n c e n t r t i o ns t e p w i s ee l u t i o nw i t hc i t r a t eb u f f e r ( p h 4 4 ) t h ee n t i r e p u r i f a t i o np r o t o c o ll e dt oa3 9 - f o l di n c r e a s ei nt h es p e c i f i ca c t i v i t yo ft h eb a c t e r i o c i n ， a n d y i e l do f2 1 8 t h ep u r i f i e db a c t e r i o c i nw a si d e n t i f i e da sac a 2 5 0 0 d ap e p t i d e b yt r i c i n e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( t r i c i n e - s d s p a g e ) ，a n dt h ep r o t e i nb a n dh a ds t r o n g l ya n t i b a c t e r i a la c t i v i t y t h ec u l t u r e s u p e r n a t a n ta n dc r u d ee x t r a c tw e r ec h a r a c t e r i z e d t h ef o r m e r s h o w e da c t i v i t ya tp h2 - 5 ，a n dt h el a t t e rs h o w e da c t i v i t ya tp h2 - 6 t h ef o r m e r m a i n t a i n e dt h em o s ta c t i v i t yw h e nh e a t e d2 0 m i na ti0 0 * c ，a n dt h el a t t e rw a ss t a b l e w h e nh e a t e d2 0 m i na t1 21 b o t ho ft h e mw e r ei n a c t i v a t e db yp a p a i na n d t r y p s i n ， a n dp a r t - i n a c t i v a t e db yp r o t e i n a s ek ，b u tr e m a i n e da c t i v i t ya f t e rt r e a t i n gb yp e p s i n t h et w oh a da l m o s tt h es a m ei n h i b i t i o ns p e c t r u m b o t ho ft h e mc o u l de f f e c t i v e l y i n h i b i tg r a m p o s i t i v eb a c t e r i aa n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ，c o u l di n h i b i tt h eg r o w t h o fl a c t o b a c i l l u sp e n t o s u sg 21 10a n dl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mc 21 - 6 ，a n dw e a k l y i n h i b i tt h eg r o w t ho fr h o d o t o r u l as p a n dp e n i c i l l i u ms p t h ep o t e n c yo fc r u d e e x t r a c ti n c r e a s e dr e m a r k a b l y , a n di th a dm o r ee f f e c t i v e l yi n h i b i t i o nt og r a m - p o s i t i v e b a c t e r i at h a nt h ec u l t u r es u p e r n a t a n t i naw o r d ，t h eb a c t e r i o c i np r o d u c e db y 厶 p e n t o s u sc 5 0 6i sh e a ts t a b l e ，a c i da n dn e u t r a ls t a b l e ，p r o t e i n a c e o u s ，a n dh a dab r o a d s p e c t r u m ，s e e nt oh a v et h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o nv a l u ea sak i n do ff o o db i o l o g i c a l p r e s e r v a t i v e k e yw o r d s ：b a c t e r i o c i n ，l a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n ， l a c t i ca c i db a c t e r i a 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：赦友瑚8 年6 月沙e t 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名： 散灵 朗韦勿 2 , r o l l 年g 月冲e l 泖罗年易月湖 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 第一章 第一章前言 1 1 文献综述 1 1 1 乳酸菌细菌素定义及分类 1 1 1 1 乳酸菌细菌素的定义 1 9 8 2 年，k o n i s l y 提出细菌素( b a c t e r i o c i n ) 较完整的定义：细菌素是由某 些细菌通过基因编码、核糖体合成的具有抗菌生物活性的蛋白质，抑茵范围不 仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性【l 】。细菌素的来源 很广，既可由革兰氏阳性细菌( g + 菌) 产生也可由革兰氏阴性细菌( g 一菌) 产 生【2 】，如大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l d 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 3 - 5 】、变 异链球菌( m u t a n ss t r e p t o c o c c i ) 6 1 、血链球菌( s t r e p t o c o c c u ss a n g u i s ) 【7 1 、青枯 菌( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 【引、土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u m ) 9 】、金黄色葡萄球 菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 以及乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ) 等。其中乳酸菌 是食品安全级微生物，在食品、医药行业中应用广泛，因此其产生的细菌素也 倍受关注。 乳酸菌细菌素是指乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的一类具有抑菌活性 的多肽或前体多肽。它们通常不仅抑制与其亲缘关系相近的乳酸菌，对非乳酸 菌的g + 菌也具有一定的抑制作用。自1 9 2 8 年r o g e r s 发现n i s i n ，到2 0 0 3 年已 有7 0 余种乳酸菌产生的细菌素被陆续发现【1 0 1 。 1 1 1 2 乳酸菌细菌素的分类 1 1 1 2 1 根据结构和特性分类 根据乳酸菌细菌素的基本结构、稳定性及分子量，1 9 9 3 年k l a e n h a m m e r 及 其合作者将其分为4 类【2 ，1 1 1 4 】( 表1 1 ) 。其中i i 、类细菌素因其不含有 羊毛硫氨酸( l a n t h i o n i n e ) 基团，又被称为非羊毛硫细菌素。目前，对i 、i i 类细菌素的生化特征，作用模式以及遗传学等方面研究较成熟，而对、类 细菌素的研究则较少。一般来说，羊毛硫抗生素( l a n t i b i o t i c s ) 的抑菌谱比非 羊毛硫细菌素的要广。 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 第一章 i 含有稀有氨基酸残基n i s i n ，c a r n o c i n 羊毛硫抗生素l a n 、m e l a n 、d h a 、d h bu 1 4 9 ，l a c t i c i n ( l a n t i b i o t i c s )等，具有膜活性的小肽4 8 1 ，l a c t o c i ns 等 3 0 余种 乳球菌、广 乳杆菌、 肉食杆菌 等属 一般 5 k d a i i小的、热稳定的多肽，较广一般 热敏感的大分j , v - 1 8 2 9 ， 属仅对同3 0 k d a 子蛋白质 a c i d o p h i l u c i na ， 源菌株 (lhlp)lactocin a b 等 包含脂类或炭水化合物p l a n t a r i c i ns ， 乳杆菌、窄 复合型细菌素部分，其活性也要依赖l e u c o n o c i ns ，明串珠菌 该部分才能实现l a c t o c i n2 7 ， 片球菌等 p e d i o c i ns j 1 等 属 2 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文第一章 1 1 1 2 2 根据产生菌分类 目前乳酸菌多个属均有发现产细菌素菌株的报道，但它们产细菌素的比例、 特性和抑菌谱都因种甚至因菌株而异，g e i s 等报道在乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 只有5 的菌株产生细菌素，而6 0 的乳杆菌( l a c t o b a c i l l i ) 产生细菌素。根据 乳酸菌的种属不同而将其所产的细菌素分为7 类 1 5 ，1 6 】：( 1 ) 乳球菌属细菌素，如 乳链菌肽( n i s i n ) 、乳链菌素( 1 a c t i c i n ) 、双球菌素( d i p l o c o c c i n ) 、乳球菌素 ( 1 a c t o c o c c i n ) ( 2 ) 乳杆菌细菌素，有p l a n t a r i c i n 、p e n t o c i n 、l a c t o c i n 、s a k a c i n 、 h e l v e t i c i n 、a c i d o p h i l u c i n 、和c a s e i c i n 等；( 3 ) 片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 细菌素， 如p e d i o c i na c h 、p a 1 、a 、p 0 2 、a c m ；( 4 ) 明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 细菌 素，如m e s e n t e r o c i n5 2 a & 5 2 b 、l e u c o c i na 、l e u c i n o c i ns 和c a m o c i n ；( 5 ) 肉食 杆菌属( c a r n o b a c t e r i u m ) 细菌素，如c a m o b a c t e r i o c i na l 、a 2 、a 3 、b l 、b 2 及 c a m o c i nu 1 4 9 ；( 6 ) 肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) 细菌素，如e n t e r o c i n a 、b 、l 5 0 、 e j 9 7 、a s 4 8 、p 、e f s 2 、p 2 1 、o n 1 5 7 、8 1 、4 ；( 7 ) 其他乳酸菌属细菌素，如 链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 和利斯特氏菌属 ( l i s t e r i a ) 均有报道发现产细菌素菌株。 这些细菌素根据其不同的性质分别属于不同的细菌素类别中，其分子量大 小、理化性质、抑菌谱等均有很大差异。本文对乳杆菌属部分菌株产生的细菌 素作了小结( 表1 2 ) 。 乳杆菌属产生细菌素的菌种较多，如植物乳杆菌( p l a n t a r u m ) 、清酒乳 杆菌( s a k e ) 、瑞士乳杆菌( 三h e l v e t i c u ) 、嗜酸乳杆菌( 三a c i d o p h i l u s ) 、干 酪乳杆菌( c a s e i ) 、戊糖乳杆菌( p e n t o s u s ) 等都报道有产细菌素的菌株。 到目前为止，仅植物乳杆菌素就已经发现了2 0 余种，其产生菌多源于不同发酵 食品。乳杆菌属细菌素所属分类范围较广，目前发现的4 类细菌素中均报道有 其产生菌，其中最多的是i i 类细菌素，如p l a n t a r i c i n a 、p l a n t a r i c i n t 、s a k a c i np 、 l a c t a c i nf 等；而p l a n t a r i c i nc 和l a c t o c i ns 则是i 类细菌素的典型代表；所发现 的两个瑞士乳杆菌素h e l v e t i c i nj 和h e l v e t i c i nv - 18 2 9 都是对热不稳定的大分子 蛋白类细菌素，他们具有i i i 类细菌素的典型特征；由三p l a n t a r u ml p c 0 1 0 产生 的p l a n t a r i c i ns 由于具有对蛋白酶、糖酵解酶和脂解酶多种酶敏感的典型特征， 我们将其归为类，但也有学者根据其双多肽的结构特征将其归为i ib 类。 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 第一章 植物乳杆菌素 p l a n t a r i c i na ，e f , j k t l 7 1 8 】 p l a n t a r i c i nc t l 9 - 2 2 】 p l a n t a r i c i ns 2 3 2 6 】 p l a n t a r i c i nt 【2 3 - 2 6 p l a n t a r i c i n4 2 3 2 7 】 p l a n t a r i c i nn c 8 1 2 s l p e d i v c i na c h 戊糖乳杆菌素 p l a n t a r i c i ns t 2 9 】 p e n t o c i n 31 i t 3 0 3 1 】 清酒乳杆菌素 l a c t o c i ns t 3 2 】 s a k a c i np 1 3 3 3 4 嗜酸乳杆菌素 l a c t a c i nf t 3 5 】 l a c t a c i nb 3 6 1 未命名册 a c i d o p h i l u c i na t 3 8 1 瑞士乳杆菌素 h e l v e t i c i nj 3 9 h e l v e t i c i nv - 18 2 9 1 4 0 】 其他乳杆菌素 c u r v a t i c i nf s 4 7 4 1 】 c a s e i c i n8 0 【4 2 】 b r e v i c i n2 7 6 4 3 】 l p l a n t a r u mc 1 1 l p l a n t a r u ml l 4 4 1 l p l a n t a r u ml p c o 10 l p l a n t a r u ml p c o 10 l p l a n t a r u m4 2 3 三p l a n t a r u mn c 8 l p l a n t a r u mw h e 9 2 i i b 类 i 类 类 i i a 类 i i b 类 i i a 类 三p e n t o s u s31 - 1 工s a k e1 4 5 厶s a k el b 6 7 4 ，l t h 6 7 3 工h e l v e t i c u s4 8l i 类 i i b 类 i i 类 i i 类 i i a 类 类 35 0 0 25 0 0 q 5 0 0 75 8 7 46 0 0 25 0 0 1 42 0 0 37 6 9 44 3 7 25 0 0 60 0 0 35 0 0 类 3 70 0 0 i 类 三c a s e ib8 0 b r e v i ss b 2 7 40 7 0 4 00 0 0 - 4 20 0 0 1 00 0 0 3 00 0 0 4 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 第一章 有些不同的细菌素由同一菌株产生，如p l a n t a r i c i ns 和p l a n t a r i c i nt 均由三 p l a n t a r u ml p c o 10 产生【2 抛6 - 1 、p l a n t a r i c i na 、p l a n t a r i c i ne f 和p l a n t a r i c i nj k 均由 l p l a n t a r u mc l l 产生 1 7 1 引。但不同菌株产生的细菌素也可能具有相同的一级结 构，如l p l a n t a r u mw h e 9 2 产生的p e d i v c i na c h 与p e d i o c o c c u sa c i d i l a c t i c ih 分泌的p e d i c i na c h ，以及l p e n t o s u sb 9 6 产生的细菌素和l p l a n t a r u m l p c 0 1 0 产生的p l a n t a r i c i ns t 2 9 1 ，但这种情况较为少见。 1 1 2 细菌素活性检测及其产生菌的筛选 1 1 2 1 乳酸菌细菌素的活性检测 用于细菌素活性的检测方法较多，通常有：琼脂扩散法、液体检测法和分 子检测法m 】。目前琼脂扩散法应用最为广泛，其中最常见的有管碟法( w e l l t e s t ) 、滤纸片法( d i s cd i f f u s i o n ) 、点种法( s p o ti n c u l a t i o n ) 和交叉划线法， 管碟法是目前国内外常用的方法，也是生物测定中最准确、最简便的方法【4 5 】； 液体检测法主要包括梯度稀释法、比浊法和生长延滞期法等；分子检测法基于 免疫和p c r 技术，与传统的检测方法不同，它着眼于细菌素的蛋白质或基因水 平。每种检测方法各有优缺点，通常根据实验的需要来选取适宜的方法。 1 1 2 2 细菌素产生菌的筛选 乳酸菌生境广阔，数量众多，而且不同生境中乳酸菌的特性差异也较大， 因此选取筛选菌株的样品来源，要充分考虑所获得菌株的目的性质。已报道的 来源有：食品源的鲜乳【4 6 1 、发酵乳品【4 7 1 、蔬菜 4 8 1 、发酵蔬菜 4 9 , 5 0 】、发酵肉类【1 2 】、 发酵酒品 5 1 ，5 2 1 等；另外有青贮饲料 5 3 5 4 1 、阴道【5 5 1 、动物肠道【5 6 】、动物粪便硎 及蜂蜜【5 3 】、石油等。 乳酸菌的代谢产物除细菌素外，乳酸、过氧化物酶、双乙酰、过氧化氢等 也会产生部分抑菌效果。因此在确定某乳酸菌的抑菌作用是否由细菌素引起时， 必须从待测样品中排除上述几种抑制化合物的干扰。另外细菌素是按照核糖体 合成机制指导其合成，具有蛋白质的特性，绝大部分已发现的细菌素对蛋白酶 敏感，在实际研究中，通常以细菌素是否被蛋白酶降解来作为判定的标准 1 , 5 8 】。 细菌素产生菌的常规筛选方法费时、费力，工作量大，同时带有很大的盲 目性。近年来，基于对细菌素分子生物学研究的深入，诞生了一种新的细菌素 筛选法一分子筛选法【5 9 】，它着眼于细菌素的蛋白质或基因水平。还连栋等将 5 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文第一章 常规筛选方法与细菌素分子生物学的研究结果相结合，利用编码n i s i n 前体的结 构基因( n i p + ) 与乳链菌肽抗性基因( 行) 和蔗糖发酵基因( s u c + ) 紧密连锁 的原理，采用以高浓度蔗糖为碳源并适当添加n i s i n 的m 1 7 培养基，配以溴甲 酚紫作指示剂，可以快速、定向地筛选n i s i n 产生菌，并筛选到一株新的n i s i n 产生菌l 1 a c t i s1 4 0 9 4 6 ，6 0 1 。 1 1 3 细菌素的发酵条件 1 1 3 1 细菌素效价分析 在细菌素的活力测定中，普遍参考抗生素效价的测定方法【4 5 1 。其中管碟法 是国际通用方法，我国药典微生物检定法也一直采用该法，效价标准曲线的制 作一般采用一剂量法( 标准曲线法) 、二剂量法( 四点法) 和三剂量法( 六点法) ， 其原理都是通过抑菌圈直径的大小来定量反映细菌素活性的大小。梯度稀释法 也常用于抗菌活性的定量测定，其单位用最低抑菌浓度( m i c ) 表示，具有抑 菌活性的最高稀释倍数的倒数即是被测样品效价。 管碟法虽被广泛应用，但由于抑菌圈的大小受细菌素扩散系数、扩散时间、 抗菌物质的总量、培养基的厚度及最低抑菌浓度等多个因素的影响【4 5 1 ，所以在 使用这种方法对细菌素活性的定量检测时，必须严格控制各种操作条件【6 1 1 。就 扩散系数而言 6 2 1 ，如果细菌素是疏水性的而不易扩散，就难以获得正确的结果。 为了解决这些问题，许多改良的方法都在探索中，w o l f 等对琼脂扩散法涉及到 的指示菌、琼脂的深度和浓度、t w e e n 2 0 的浓度、培养基中所加的缓冲剂等参 数进行优化【6 3 1 。p o n g t h a r a n g k u l 还考察了3 株不同n i s i n 敏感菌及平板预扩散 ( p r e d i f f u s i o n ) 时间对n i s i n 定量检测的影响【6 4 j 。 1 1 3 2 细菌素产生菌培养条件 1 1 3 2 1 环境条件 培养时间、温度、p h 、生物量、供氧量等外界因素对细菌素的产率都有影 响。细菌素产量一般在对数生长后期或稳定期达到最大值，随培养时间的延长， 细菌素的活力和产量都有一定程度的降低6 5 1 。细菌素产生的最适培养温度一般 在产生菌所在属的最适生长温度之内。以n i s i n 为例，其产生的最适温度为3 0 。 细菌素最适p h 依赖于菌株和培养基种类。n i s i n 产率的最适p h 通常低于最佳 生长p h ，通常为p h 5 8 6 0 ，但也有高达p h 6 8 的菌株。c a b o 等研究发现用n a o h 6 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文第一章 反复碱化培养液至最初设定p h ，可提高n i s i n 产量达4 倍嘲。d ev u y s t 等提出， 一般n i s i n 生产需要隔绝氧气，但适当的溶氧对n i s i n 的生产有利，这也说明n i s i n 生产是一个有氧代谢的过程。 1 1 3 2 1 培养方式 应用膜技术进行细胞循环的连续化发酵其产率稍高于分批发酵或无细胞循 环的连续发酵，细胞循环时膜的选择则是至关重要的( 如聚烯烃中空纤维膜、 陶瓷膜会吸附细菌素) 。研究表明，连续发酵比分批发酵生产n i s i n ，可获得更 大的n i s i n 产率。 对于固定细胞与游离细胞发酵生产细菌素的研究发现，固定细胞发酵的细 菌素产率虽然有所降低，但是固定细胞生产细菌素具有稳定性好和易于纯化等 诸多优点。固定细胞生产n i s i n 的时间推迟，生产能力也有所下降，但这种情况 可以通过连续化发酵改善，提高了生产效率，并且发酵液中游离细胞少，有利 于n i s i n 的分离纯化【6 7 1 。焦中高等采用固定化乳酸乳球菌d l 2 0 3 连续发酵生产 n i s i n ，虽然不能达到游离细胞的发酵水平，但缩短了发酵时间，避免了频繁接 种可能带来的杂菌污染，并且易于自动化控制，节约时间【6 8 】。田宇等对瑞士乳 杆菌hf 0 8 菌株经固定化后发酵产物的抑菌活性降低，但稳定性稍有提高 4 9 】。 1 1 3 3 培养基组成 目前用于乳酸菌的常用培养基有m 1 7 、a p t 、c m 和m r s 等 6 9 1 。细菌素的 发酵生产主要是在乳酸茵基础培养基中添加碳源( 葡萄糖、蔗糖等) 、氮源( 蛋 白胨、酵母粉等) 、无机盐类和吐温等得到。发酵的效果主要受到碳源和氮源的 影响，磷酸盐、阳离子、表面活性剂和抑制剂的种类和含量对生产也有较大影 响【2 6 ，7 0 ，7 1 1 。 1 1 3 3 1 营养成分 ( 1 ) 碳源细菌素生产常用的碳源有蔗糖、葡萄糖等。 ( 2 ) 氮源乳酸菌菌体生长及其细菌素的生产，在更多的时候是受到有机氮 的限制而不是碳源，一般细菌素产量随着氮源量的增加而增加。 1 1 3 3 2 无机离子 ( 1 ) 无机磷酸根磷酸根能促进细菌素生产。 ( 2 ) 金属离子培养基中的无机盐及其浓度对细菌素的产生也有重要影响， 7 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文第一章 一般m n 2 + 和c a 2 + 对细菌素的生产有促进作用，而c u 2 + 则有抑制作用。 1 1 3 3 3 吐温等刺激因子 吐温8 0 作为一种表面活性剂，可促进细菌素的产生。有实验证明不加吐温 的培养基中尽管菌体生长很好，但细菌素产率很低，加入吐温之后会促进一些 包括n i s i n 在内的细菌素的生产【7 2 1 。另外，t w e e n8 0 常用于防止细菌素黏附于 细胞和玻璃器皿表面，阻止n i s i n 和e n t e r o c i n 吸附于聚丙烯表面。但g a r n e a u 等考虑到它会干扰多肽的纯化、影响质谱仪分析结果，在优化后培养基中则减 少其加量【7 3 】。 加入酒精1 ( 体积比) ，可改善类似b a c t e r i o c i ns t 硎和a m y l n o v o r i ni a 7 1 的生产，但这种作用在n i s i n 生产上尚未得到确认。 1 1 3 3 发酵条件优化结果 以n i s i n 为例，蔗糖被证明是生产n i s i n 最好的碳源，间歇补充碳源也有利 于提高产量。n i s i n 产量随着氮源量的增加而增加，其种类对n i s i n 的生产也有 较大的影响，v a f i th u l 发现乳酸链球菌乳酸亚种( 三1 a c t i s s u b s p 1 a c t i c ) a t c c 1 1 4 5 4 在一种未加工的氮源比在l t b 肉汤中培养n i s i n 产量多1 5 倍，此外，在 基本的培养基中添加n i s i n 前体氨基酸有助于发酵液中n i s i n 效价的提高。 k h 2 p 0 4 被证明是n i s i n 产生的最好磷源【7 5 】。陈秀珠等的研究表明，m n 2 + 、c a 2 + 对n i s i n 的产生有促进作用，而c u 2 + 则有强烈的抑制作用。但也有报道，m n 2 + 和m 孑+ 对n i s i n 的产生有促进作用，而c a 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 、f e 2 + 、c u 2 + 均对n i s i n 的产率有不同程度的抑制作用，其中c u 2 + 的抑制作用最为严重。 一般采用正交组合设计或结合响应面法进行试验设计和分析从而对细菌素 发酵条件优化，优化后细菌素的产量均能有效的提高几倍到几十倍7 0 ，7 1 ，份7 钔， 甚至上万倍 掬。 1 1 4 细菌素的纯化 1 1 4 1 细菌素的理化特性 细菌素一般都表现出高度的疏水性和阳离子性，细菌素对热和酸的稳定性 却因种类的不同而有较大差异，而且随着纯度的增加细菌素的稳定性降低。 目前发现的细菌素多为i 、i i 类，他们的一个主要特征即是对热稳定，其 范围很广，从6 0 - 1 0 0 超过3 0 m i n ( 如l a c t o c i n2 7 、s ，c a m o b a c r o e r i o c i n sa 、 8 四川农业大学2 0 0 5 级硕士学位论文 第一章 b 等) 到高压1 2 1 灭菌1 5 - 2 0 m i n ( 如l a c t a c i nb 、f ，n i s i n 等) 。这种热稳定性 可能是由于其分子量小、结构简单，以及高度疏水性区域的存在( 如l a c t a c i nf ， l a c t o c o c c i n a ，n i s i n ) 、稳定的交联结构( 如n i s i n 、l a