（应用化学专业论文）五倍子多糖的提取及其抗氧化和抑菌特性研究.pdf

摘要 五倍子多糖的提取及其抗氧化和抑茵特性研究 作者简介：秦文玲，性别：女，1 9 8 1 年1 0 月生，师从成都理工大学唐善 虎教授，2 0 0 8 年7 月毕业于成都理工大学应用化学专业，获得工学硕士学位。 摘要 多糖是动、植物体内重要的生物活性物质。由于多糖具有各种生物活性功 能以及在保健食品与医药上的广泛应用，多糖的丌发利用和研究越来越受到人 们的关注。五倍子具有多种保健和疗效作用，但五倍子多糖尚未见报道。本研 究的主要目的是考察各单因素对血倍子多糖提取率的影响，依据单因素试验结 果对提取工艺进行优化，并对五倍子多糖抗氧化性和抑菌活性进行测定。该研 究共进行了四部分试验。 试验一，在超声波为辅助萃取条件下，考察温度、时间、料液比、粉碎度 和功率五个单因素对五倍子多糖提取率的影响。结果表明：随着提取时间的延 长，多糖提取率也不断升高，在3 0m i n 时达到最大，此后反而迅速下降；多糖 提取率随料液比的增大而升高，但当料液比大于1 ：2 0 时，提取率下降；随着超 声功率的增大，多糖提取率随之增加，当超声功率为3 0 0w 时，提取率达到最 大，随后降低；多糖提取率始终随温度和粉碎度的升高而增加。依据单因素试 验结果，运用三元二次回归正交旋转组合设计考察时间、料液比和功率三因素 对五倍子多糖提取率的交互影响，优化提取工艺，得出五倍子多糖的最佳提取 工艺为：时间3 3 7m i n ，料液比l ：1 8 6 ，超声功率2 5 0w 。通过建立回归方程 及方差分析，验证了数学模型的合理性。 试验二，在破碎法为辅助萃取条件下，考察转速、时间、料液比和粉碎度 四个单因素对五倍子多糖提取率的影响。结果表明：随着转速的逐渐增大，多 糖提取率不断升高，在1 3 ，0 0 0r p m 时达到最大，此后随着转速的增大提取率反 而下降；随着时间的延长，多糖提取率不断升高，在2 0m i n 时达到最大，此后 提取率下降；随着料液比的增大，多糖提取率不段升高，在1 ：3 0 时达到最大， 此后随着料液比的增大，多糖提取率不断下降；多糖提取率始终随粉碎度的增 大而增加。依据单因素试验结果，采用j 下交试验设计考察转速、时间和料液比 三因素对五倍子多糖提取率的影响，优化提取工艺，并进行方差分析。得到最 佳工艺条件为：转速1 3 ，0 0 0r p m 、时间为2 0m i n 、料液比为1 ：4 0 。影响顺序为： 转速 时间 料液比。 试验三，考察了不同浓度水平的五倍子多糖溶液对羟基自由基和超氧阴离 成都理工人学硕十学位论文 子自由基的清除效果。试验结果表明：超声波法多糖溶液和破碎法多糖溶液对 羟基自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，且随着多糖溶液浓度的 增大清除率也不断升高，其中破碎法多糖溶液对两种自由基的清除能力大于超 声波法多糖溶液。 试验四，考察了五倍子多糖溶液对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌 的抑菌效果。试验结果表明：超声波法多糖溶液和破碲法多糖溶液对大肠杆菌 和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制能力，对沙门氏菌抑制效果不明显。 关键词：五倍子多糖超声波破碎法二次回归正交旋转组合设计 a b s t r a c t 一一 e x t r a c t i o nt e c h n o l o g ya n dc h a r a c t e r i s t i c so f a n t i o x i d a n ta n d a n t i m i c r o b i a ia c t i v i t i e so f p o i y s a c c h a r i d ei ng 口z 胁c 厅觑p 厅s 豇 i n t r o d u c t i o no ft h ea u t h o r ： q i nw e n l i n g ，f e m a l e ，w a sb o mi no c t o b e r ，l9 8l ， w h o s es u p e r v i s o rw a sp r o f e s s o rt a n gs h a n h u s h eg r a d u a t e df o mc h e n g d u u n i v e r s i t yo ft e c h n o l o g yi na p p l i e dc h e m i s 仃ym 旬o ra n dw a sg r a n t e dt h em a s t e r d e g r e ei nj u n e ，2 0 0 8 a b s t r a c t p o l y s a c c h 撕d ei sv e r yi m p o n a n ts u b s t a n c ei nl i v i n gc r e a t u r eo rp l a n t s b e c a u s e o fi t sv a r i o u sb i o a c t i v i t i e s a n de x t e n s i v e u s a g e si nf u n c t i o n a lf o o d sa n d p h a h n o c e u t i c a l s ，r e s e a r c ho np 0 1 y s a c c h a r i d eh a sg a i n e di n c r e a s i n ga t t e n t i o n g 口，肠 f 厅加p 瑚凼h a sb e e nu s e df o rv a r i o u sp u 叩o s e si nh e a l t h c a r ea n dd i s e a s et r e a t m e n t s b u tr e s e a r c ho np o l y s a c c h a r i d ei ng a 朋口c 办f 船p 胛j 西h a sn o tb e e n r e p o r t e d t h eo b j e c t i v e so ft h i sr e s e a r c hw e r et oo b t a i no p t i m a lt e c h n i q u e st o e x t r a c t m a x i m a ly i e k lo fp 0 1 y s a c c h a “d e ，a n dt od e t e n n i n es c a v e n g i n ga c t i v i t i e s t o 矗e e r a d i c a l sa n da n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fp o l y s a c c h a “d ef r o m g 口，肠c 庇f 门p 门s 括f o u r e x p e r l m e n t sw e r ep e o r n l e d i n e x p e r i m e n t1 ， t h ee f j f e c t so fe x t r a c t i o nt i m e t e m p e r a t u r e ，s 0 1 i d - s 0 1 v e n tr a t i o ，p a n i c l es i z eo fm a t e r i a la n du l t r a s o n i cp o w e ro n e x t r a c t i o n y i e l d s o f p o l y s a c c h a r i d e 矗o mg 口，肠 c 乃砌p 玎s 忝w e r ed e t e n n i n e d i n d i v i d u a l l y b a s e do nt h e s er e s u l t s ，aq u a d r a t i cr e g r e s s i o nr o t a t i o n a lc o m b i n a t i o n a l d e s i g nw a sa p p l i e dt oe s t a b l i s har e g r e s s i o nm o d e la n dt oe s t i m a t et h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rm a x i m a le x t r a c t i o n y i e l d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a l e x t r a c t l o nc o n d i t i o n sw e r e1 ：18 6o fs o l i d - s o l v e n tr a t i o a n d2 5 0 wo fu l t r a s o n i c p o w e rf o r3 3 7 m i n i ne x p e r i m e n t2 ，t h ee f r e c t so fr o t a t i o ns p e e d ，e x t r a c t i o nt i m e ， s 0 1 i d s o l v e n tr a t i oa n d p a r t i c l e s i z eo fm a t e r i a lo ne x t r a c t i o n v i e l d so f p 0 1 y s a c c h a r i d ef o mg 订，亿c 厅砌p ，坫括w e r ed e t e n n i n e di n d i v i d u a l l v b a s e do nt h e s e r e s u l t s ，a i lo n h o g o n a le x p e r i m e n td e s i g nw a sa p p l i e dt oe s t a b l i s ha r e g r e s s i o nm o d e l a n dt oe s t i m a t et h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rm a x i m a le x t r a c t i o nv i e l d t h e r e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ，e r el ：4 0o fs o l i d s o l v e n tr a t i oa n d 13 ，0 0 0 印mo fr o t a t i o ns p e e df o r2 0m i n i ne x p e r i m e n t 3 ，t h ec a p a c i t i e so f p o l y s a c c h a r i d ef r o mg 口朋白c 办f ”p 玎s 括f o r s c a v e n g i n g o ff r e er a d i c a l sw e r e l n v e s t l g a t e d f e n t o nr e a c t i o nt op r o d u c e 。o ha n dp y r o g a l l 0 1t op r o d u c e0 2 。厂a s u s e d 1 1 1 er e s u l t ss t a t e dt h a tp o l y s a c c h 耐d eo fu l t r a s o n i cw a v em e t h o da i l dc r u s h i n g 成都理：。i ：大学硕+ 学位论文 m e t h o dh a sm eb e s ts c a v e n g i n gr a t et o o ha n d0 2 。i nt h e6 n a le x p e r i m e n t ，t h e e 骶c t i v e n e s so fp o l y s a c c h a r i d ef o ra n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e sw a se v a l u a t e d t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tp o l y s a c c h a r i d ei ng 口，励c 办f 聆p ，2 s 括h a di n h i b i t o r ye h e c t st o j 囊c 办p r z c 办f 口c d z fa n d & 印矗) ，z d c d c c 甜j 口“，“j ，a n dd i d n th a v ei n h i b i t o r ye f j e c t st o s a l m o n e l l a t h i sr e s e a r c hs u g g e s t e dt h a te x t r a c t i o no fp o l y s a c c h a “d ef r o mg 口，肠c 乃f 胛p ，z s 括 b ef e a s i b l ea n di t se x t r a c t e dp o l y s a c c h a r i d e sh a v el a r g ep o t e n t i a l si na p p l i c a t i o ni n 6l n c t io n a lf b o d s k e y w o r d s ：g 口z ，口c 乃f ，2 p ，2 s f s p o l y s a c c h a r i d e u l t r a s o n i cv ，a l v e c m s h i n gm e t h o d q u a d r a t i cr e g r e s s i o nr o t a t i o n a ld e s i g n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盛酆理王太堂或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：条炙诠 伽子年j 月 站同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盛都堡王太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权盛壑理王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：条曼、诠 学位敝作者剔醛名：屠雪毳 ? 嘟年 j 月丛日 第1 章引言 1 1 五倍子研究概况 1 1 1 五倍子的药材性状 第1 章引言 五倍子( g a l l ac h i n e n s i s ) ，别名文蛤、百虫仓、木附子等。性酸、涩，寒。 归肺、大肠、肾经。作为传统中药始载于开宝本草，具有敛肺降火、涩肠 止泻、敛汗止血、收湿敛疮等多种临床功效【2 】。 五倍子是我国的森林特产物，目前已报道的有十多种，商品五倍子有角倍 类、肚倍类、倍花类。1 9 8 5 年出版的中华人民共和国药典列出了常见的角 倍和肚倍两种，均为不同的瘿棉蚜科的一种蚜虫在其寄生植物上特定部位形成 的虫瘿。形成虫瘿的各种瘿棉蚜科的蚜虫的头部触角均为五节，因此人们形象 地称此类虫瘿为五倍子【3 1 。 五倍子适宜生长在温暖湿润的山区和丘陵地带。我国是五倍子主产国，产 量约占世界总产量的9 5 ，其中四川、贵州、湖南、湖北、陕西和云南6 省的 产量占全国总产量的8 0 左右1 4 j 。 五倍子不仅是一种重要的中药，而且是生产单宁酸、没食子酸和焦性没食 子酸等化工产品的主要原料，在医药、纺织、化工、食品、环保和农业等行业 用途广泛，在国内、国际市场享有盛誉。 1 1 2 五倍子的化学成分 五倍子中的主要有效成分为鞣质及没食子酸。t h h b e a s l y 等用高效液相 色谱( h p l c ) 法测定和鉴定五倍子单宁【引，m v e r z e l e 和p d e l a j l v e 先后报道了 二倍酸和三倍酸在甲醇、水等溶液中分别出现了2 个异构体和4 个异构体，丰 富了五倍子鞣质的成分【孓丌。m a k o t on i s h i z a w a 等【8 】运用s e p h a d e x l h 2 0 和正相 h p l c 以及反相h p l c 对五倍子鞣质中成分做了细致的研究，并列表给出了其 中主要成分的含量。陈祥等咿j 针对中国五倍子的不同种类，从1 9 8 1 年起进行了 中国五倍子单宁化学变异性的研究，对角倍单宁酸、五倍子单宁醇解产物中低 分子量组分作了分离鉴定，研究了h p l c 在五倍子单宁和没食子酸中的应用， 结果显示：中国五倍子单宁的组成和结构，随五倍子的品种不同存在明显的差 异；通过从角倍和肚倍制备的五倍子单宁的液相色谱图对比发现，二者不但某 些组分量有差异，更重要的是组成上也有差异；与以往文献道中国五倍子单宁 的液相色谱图比较，均多出1 0 个以上的组分；而其中角倍的谱图上两组峰之间 成都理上人学硕十学位论文 还有明显的肩峰；因此中国五倍子单宁的化学组分可能比过去文献所报道的复 杂的多。 易盛国等【l0 】将药用五倍子粉碎处理后在索氏提取器中用正己烷抽提，经分 析确定五倍子油的化学成分为癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油 酸、亚油酸、亚麻酸。姚俊等l l l 】采用富氧乙炔吸收光谱法对盘倍子中矿物微量 元素作了测定，认为五倍子中含有多种金属矿物质微量元素，包括铜、锌、铁、 镁、钠、钙等的化合物。此外五倍子中还含纤维素、木质素、淀粉、树胶、树 脂等。 1 1 3 五倍子的药理作用 1 1 3 1 抗茵作用 五倍子具有抗菌作用，五倍子粉，五倍子浸液等体外实验对金黄色葡萄球 菌、链球菌、肺炎球菌以及伤寒、副伤寒、痢疾、炭疽、白喉、绿脓杆菌等均 有明显的抑菌或杀菌作用。于瑞花等1 12 】采用自制的复方五倍子粉治疗中、重度 褥疮4 6 例，取得了良好效果，在该病的创面致病药敏实验3 7 例中，五倍子浸 液有效的为3 5 例，有效率达到9 4 2 。临床研究还表明五倍子能增强庆大霉 素、甲硝哗的抗菌效果，对铜绿假单孢菌、厌氧菌的作用尤为显著。周玉生等 【1 3 】取五倍子( 炒黄) 、吴茱萸、花椒、丁香、苍术( 炒黄) 、鸡内金等研细术，按一 定的比例混匀后，用酒精调敷脐部治疗小儿肠炎4 7 例，总有效率9 5 7 0 。 1 1 3 2 抗病毒作用 李加坤等报道五倍子、乌梅、枯矾、雄黄、大黄等按一定比例与食醋混合 可用于治疗传染性软疣，临床应用于9 3 例，平均7 5 天全部治愈。实验表明五 倍子煎剂对接种于鸡胚的流感一甲型p r 3 株病毒有抑制作用。近年来五倍子单 宁被发现有很强的抑制h i v i 盯活性，很有可能发展成为抗艾滋病药物。 1 1 3 3 清除自由基和抗氧化作用 五倍子在生物体内具有较强的清除超氧自由基的作用，具有抗衰老作用。 同时由于自由基被清除，避免自由基诱发的生物大分子损伤，维护细胞膜的流 动和蛋白质的构象，防止辐射诱发的d n a 断裂，从而又具有抑制脂质过氧化、 心血管病、抗突变、抗癌、抗白内障等方面的独特作用。此外，李怀荆掣”】报 告了五倍子水煎剂对老鼠抗衰老的作用；谢道刚等【l6 j 报道了五倍子提取物抑制 突变作用的初步研究；傅乃武等【1 7 峙艮道了五倍子鞣酸抑制体内亚硝胺生成和对 抗活性氧的作用。 2 第l 章引言 1 1 3 4 毒性 小鼠腹腔注射1 0 0 五倍子煎剂o 2 5m l ，均于1 2h 内死亡，将用量减少为 1 1 0 时则未见异常。豚鼠口服煎剂2 0g l ( g 体重未见异常；皮下注射后，局部 发生腐烂、坏死，动物表现为不安、行动迟钝、萎靡、食欲差，呼吸急促。2 4h 后死亡。其可能原因是鞣酸进入机体后几乎全部被分解为倍酸与焦倍酸，从而 可能引起灶性肝细胞坏死。 1 1 3 5 收敛作用 五倍子中的鞣质以及没食子酸等成分对蛋白质有沉淀作用。皮肤、黏膜、 溃疡与之接触后，组织蛋白质即被凝固，形成一层被膜。同时小血管也被压迫 收缩，血液凝结，产生止血功效。鞣酸的收敛作用使腺细胞的蛋白质凝固引起 分泌抑制，可使黏膜干燥。神经末梢蛋白质的沉淀可产生微弱的局部麻醉作用。 因此，本药应用后可促使创面结痂，保护仓u 面，避免外界刺激，减少疼痛及体 液丧失。于瑞花等临床采用五倍子治疗中、重度褥疮就是利用了五倍子的这 一活性。 1 1 3 6 其他作用 有文献报道五倍子油对糖尿病也有一定疗效，但未见相关机理的阐述。五 倍子还可用来治疗烧烫伤、久咳、脱肛等多种病症，在临床上均有较好的疗效。 从目前五倍子的临床应用来看，五倍子的疗效往往是五倍子鞣质及五倍子各种 化学成分、药理活性综合作用的结果。陈静岚等【他1 认为用五倍子注射液治疗早 期宫颈癌是五倍子各种药理活性的综合体现。鉴于五倍子应用于临床确有效果， 国家药品监督管理局已于2 0 0 0 年8 月批准了临床研究的新中药五倍子油及五倍 子油软胶囊，可用于治疗多种疾病。盘倍子临床药用取得可喜进展。 1 2 多糖的研究概况 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) ，又称多聚糖，是指分子中含有l o 个以上的一种或 多种单糖单元聚合而成的一类生物大分子。多糖是自然界含量最丰富的物质之 一，也是与人类生活紧密相关的一类生物高分子。 糖类生物化学的形成与发展，在分子生物学范畴远远落后于蛋白质和核酸， 但它作为有机化学开展的研究，甚至比核酸和蛋白质还要早【l 她们。人们对多糖 的初始研究可追溯到1 9 3 6 年s h e a r 对多糖抗肿瘤活性的发现。至上世纪5 0 年 代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。7 0 年代以来， 科学家们发现多糖及糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调节，特别是 成都理上人学硕+ 学位论文 免疫功能的调节，多糖尤其是中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药 理作用，而且几乎没有毒性并可通过化学手段控制其质量，愈来愈引起国内外 药理学家、生物学家和化学家们的兴趣，成为当前的研究热点【2 1 | 。8 0 年代又发 现多糖的糖链在分子生物学中具有决定作用，能控制细胞分裂和分化，调节细 胞的生长和衰老【2 2 1 。8 0 年代末形成新型学科“糖生物学( g l y c o b i o l o g y ) ”和“糖 工程学( g l y c o t e c h n o l o g y ) ”，发展极其迅速，并将成为二十一世纪的重大前沿学 科之一f 2 3 1 。近年来，糖科学( g l y c o s c i e n c e ) 和糖技术( g l y c o t e c h n o l o g y ) 的飞速发展 令人瞩目。糖技术医药产品不断推出，糖技术公司的诞生如雨后春笋。人们把 糖生物学( g l y c o b i o l o g y ) 称做是继蛋白质、核酸之后，生物化学最后一个“伟大 的战线”【2 4 1 。近年来，多糖结构与功能的关系以及多糖复合物疫苗等的研究在 国际上受到了较多的关注。2 0 0 1 年3 月2 3 日出版的美国科学杂志汇编7 篇综 述和6 篇简介组成了一个专辑“糖和糖生物学”，介绍了糖类药物在治疗炎症、 用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面的最新进展；寡糖和糖蛋白合成的进展；质谱在 分析糖蛋白结构方面的进展等。 我国对多糖的研究起步较晚，始于2 0 世纪7 0 年代，但近年来发展迅速。 研究的对象涉及真菌类、地衣类、植物以及花粉、动物等；研究的范围包括多 糖的分离纯化、结构分析、理化性质、免疫学、药理学以及治疗应用等，对其 免疫增强作用机理的研究已深入到分子、受体水平；研究的方法涉及化学、生 物学、医药学等诸多领域1 2 引。 如今国内外研究的主要目标是一方面进一步寻找活性更高，特别是对肿瘤， 艾滋病更有效的多糖；另一方面正在着重进行构效关系的研究。构效关系阐述 清楚，将对发现新的多糖起指导作用，并对药物学、分子生物学的理论作出新 贡献【2 6 - 2 7 1 。 1 2 1 多糖的来源 多糖按其来源可分为四大类：植物多糖、动物多糖、藻类多糖和微生物多 糖。它们又可被分为胞内多糖和胞外多糖。其中研究的较多的是植物和微生物 多糖。 植物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花。从各种中草药和其他 植物中都可以提取分离出多糖，其中研究比较深入的有稻草多糖、麦秸多糖、 竹黄多糖、刺五加多糖等。我国近年来对植物多糖，特别是具有中国特色的中 草药多糖的药物活性已有广泛研究报道1 2 引。 动物组织中也存在着有用的多糖，其中含硫的多糖尤其以肝素最著名，是 生物学上重要的多聚物，目前开发利用的主要有以下四种【2 州： 1 素：常从新鲜的猪肠膜或牛肺中提取的一种含硫的粘多糖。它广泛分布 4 第1 章引言 在哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠黏膜、肌肉和血液里，多与蛋白 质结合成无抗凝血活性的复合体，具有促进脂蛋白脂肪酶分泌、澄清血脂、降 低红细胞和血小板的聚集以及舒通血管的作用。 2 硫酸软骨素：常从新鲜或干燥的猪喉( 鼻) 软骨中提取的酸性粘多糖。它 广泛存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨等组织中，具有增强脂肪酶的活性，加速 乳糜微粒中甘油三酯分解，还具有抗凝血和抗血栓的作用。 3 透明质酸：常从鸡冠、人脐带、兔皮、羊眼球等中提取的由葡萄糖醛酸 和氨基葡萄糖双糖重复单位所组成的酸性多糖。它广泛存在于动物的各种组织 中，其中以哺乳动物的玻璃体、脐带和关节滑液中含量最高，具有润滑骨关节， 调节细胞表面及周围c a ，m g ，k ，n a 离子运动，促进物质在皮肤中的扩散和 保护皮肤的作用。 4 甲壳质：常从虾壳、蟹壳中提取的多糖，其化学结构是( 1 ，4 ) 2 乙酰氨 基2 脱氧d 葡聚糖，广泛存在于低等植物、菌类、虾、蟹、昆虫等节肢动物 的体表及高等植物的细胞壁，具有降胆固醇、降血脂的作用，同时由于其无毒、 无味、耐碱、耐热和耐腐蚀的特性，医药上常用作药物的良好载体。 微生物多糖是至今研究得比较详细的一类多糖，如细菌产生的荚膜多糖和 黄原胶，前者在医药上作为疫苗应用已有很长时间，后者则是一种具有高粘度 和适当流动性、耐热、耐酸的水溶性多糖。又如真菌多糖中的香菇多糖、云芝 多糖和茯苓多糖，作为免疫调节剂已在临床上f 式应用，此外像虫草多糖，灵 芝多糖，和银耳多糖，也正在进行研制或非正式的临床应用。 全世界的藻类约有3 万多种，迄今为止被人们广泛利用的主要是红藻、绿 藻和褐藻三大类，约1 0 0 多种，对蓝藻的利用较少。海藻细胞问富含粘质多糖、 醛酸多糖和含硫多糖，细胞内也有，如螺旋藻。虽然对海藻多糖至今研究得不 多，但已发现这些多糖除了具有免疫促进作用及抗肿瘤作用，还具有抗病毒作 用，如从红藻中分得一种多糖，对治疗感冒具有良好的作用。国外治疗艾滋病 的权威预言，从海藻中可以获得有价值的抗艾滋病的多糖药物。我国海藻资源 丰富且类别很多，从中开发有价值的多糖前途很大，目前已有人从海藻中开发 具有降胆固醇、降血脂的多糖保健品。 1 2 2 多糖的生物活性 研究表明，糖类在生物体内的功能不仅仅是提供能量和参与结构组织，同 时还具有多种生物功能。它存在于生物体中，能促进和加强机体健康，具有控 制细胞分化，调节细胞生长的作用；它广泛参与细胞识别、细胞生长、分化、 代谢、胚胎发育、细胞癌变、病毒感染、免疫答应等各项生命活动。另外一些 多糖分别或同时具有增强机体的细胞和体外免疫功能，诱导细胞因子产生以及 成都理工人学硕+ 学位论文 抗感染、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗凝血、降血脂、降血糖等活性，可作为 药物和功能食品用于临床治疗和保健【3 0 。3 1 】。许多中草药的活性与糖及其衍生物 有着密切的关系，尤其是糖与非糖物质结合的苷( g l y c o s i d e ) ，不少具有生理活性。 同样在动物、微生物机体内的一些内源性多糖亦被证明具有多种活性【3 2 】。 s o r i v a s t a v ar 等【j j j 对不同来源的多糖的结构以及构效方面的研究比较分析后 认为：一般来说，真菌多糖具有较高的抗肿瘤功能；而高等植物多糖的增强免 疫调节作用较好；藻类多糖都具有硫酸基而具有较好的抗凝血和抗病毒作用。 1 2 2 1 免疫调节功能 现代医学、细胞生物学及分子生物学的发展，使人们认识到免疫系统的紊 乱不仅会产生多种疾病，而且与人体衰老及老年人多发病有关。多糖的最重要 的药理作用为免疫促进作用。其免疫调节作用主要通过激活巨噬细胞，t 和b 淋巴细胞，网状内皮系统和补体来完成。海带多糖作为免疫增强剂，有预防和 治疗造血组织损伤，刺激造血恢复及增强癌症患者的免疫功能【3 4 1 。l e i l s 等【3 5 】 对灵芝多糖研究发现，灵芝多糖可通过问接激活淋巴细胞中d n a 多聚酶，而 促进d n a 合成及t 细胞增殖，促进i l 2 产生，而影响t 细胞亚群的数量和 功能。 1 2 2 2 抗氧化、抗衰老作用 衰老自由基学说是现代衰老理论中具有代表性的学说之一。人体衰老及其 某些生理，病理过程与体内脂质过氧化反应关系密切。随着年龄增长，人体内 抗氧化酶，s o d 和g 8 h - p x 活性下降，自由基积累过多，与生物膜中不饱和 脂肪酸形成氧化脂质( l p o ) ，进而引起细胞膜损伤，导致疾病和衰老。研究发 现，许多多糖对物理的、化学的及生物来源的多种活性氧具有清除作用，能减 少脂质过氧化产物丙二醛的生成量，增加s o d 、g 8 h - p x 活性等，在中药药理 中发挥着重要作用。黄芪多糖能有效地被皮肤细胞吸收利用，从而达到促进皮 肤组织的血液循环，增强细胞自身内部s o d 活力的作用【3 6 】。芦荟多糖有清除 体内0 2 、o h 及h 2 0 2 的自由基功能，间接地达到抗衰老作用【3 7 】。 1 2 2 3 抗肿瘤作用 多糖是生物反应调节剂的重要组成部分，能激活免疫细胞，诱导多种细胞 因子和细胞因子受体基因的表达，增强机体抗肿瘤免疫功能，从而间接抑制或 杀死肿瘤细胞【3 8 _ 3 9 1 。一些具有细胞毒性的中药植物可以直接杀死肿瘤细胞，如 猕猴桃多糖。许爱华等【4 0 1 研究表明，从新鲜的银杏外种皮中提取的多糖对多种 动物肿瘤以及人肝癌、胃癌和肺癌细胞具有较好的抑制作用。多糖作为抗癌剂 6 第l 章引言 的最大优点是毒副作用少，与化疗联合应用有协同作用，还可对抗化疗药物的 骨髓抑制等不良反应，所以有人认为多糖应用于肿瘤治疗将是一个新的迷人的 领域。 1 2 2 4 降血脂、降血糖作用 正常情况下，人体内脂质的合成与分解保持一个动态平衡，一旦平衡遭到 破坏，血脂含量的增高将使动脉内膜受到损伤而导致动脉粥样硬化，从而诱发 心脑血管疾病。降低血脂含量对于防治心血管疾病具有重要的意义。类肝素能 促进脂蛋白脂肪酶的释放，使血液中大分子的脂质分解成小分子，对因血脂过 多引起的血清混浊有澄清作用，也能明显降低血胆固醇【4 2 1 。t a d a s h ik i h o 等4 3 4 4 】 从培养的冬虫夏草菌丝体中提取两种杂多糖c s f 1 0 和c s f 3 0 二者能显著降 低f 常小鼠和链脲佐菌素、肾上腺素所致的糖尿病小鼠的血糖，显著增加肝脏 葡萄糖激酶的活性，降低肝脏葡萄糖输出，显著降低促葡萄糖转化同工酶- 2 ( g i u t 2 1 。 1 3 中药有效成分提取方法 中药的提取，就是将植物中化学成分提出的过程，它是进行中药化学成分 和中药制药研究的第一步。选择适当的提取方法不仅可以保证所需中药化学成 分被提出，还可以尽量避免不需要的杂质干扰。传统提取方法主要包括溶剂提 取法、水蒸气蒸馏法、升华法等，方法简便，但效率低下，提取时间长，对不 稳定、微量的化学成分的提取效果并不理想。近年来，随着科学技术的进步， 一些与高科技相结合的新提取方法，如超临界流体萃取、微波萃取、超声波萃 取、酶法提取、半仿生提取法、破碎提取法、空气爆破法等新技术已应用于中 药的提取，具有十分广阔的应用前景【4 孓4 引。 1 3 1 超声波萃取 超声波萃取( u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ) ，亦称为超声波辅助萃取、超声波提取， 是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、扰动效应、高加速度、击碎和搅 拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加 速目标成分进入溶剂，促进提取的进行1 4 7 。 超声波是指频率为2 0k h z 5 0m h z 的电磁波，它是一种机械波，需要能量 载体一介质来进行传播。其穿过介质时，会产生膨胀和压缩2 个过程。超声波 能产生并传递强大的能量，给予介质极大的加速度。这种能量作用于液体时， 7 成都理1 ：人学硕十学位论文 膨胀过程会形成负压。如果超声波能量足够强，膨胀过程就会在液体中生成气 泡或将液体撕裂成很小的空穴。这些空穴瞬问即闭合，闭合时产生高达3 0 0 0 m p a 的瞬间压力，称为空化作用。这样连续不断产生的高压就像一连串小爆炸 不断地冲击物质颗粒表面，使物质颗粒表面及缝隙中的可溶性活性成分迅速溶 出。同时在提取液中还可通过强烈空化，使细胞壁破裂而将细胞内溶物释放到 周围的提取液体中。另外，超声波的许多次级效应如热效应、溶化、扩散、击 碎，化学效应、生物效应、凝聚效应等也能加速中药有效成分在溶剂中的扩散 释放，促进中药有效成分与溶剂混和，有利于萃取【4 8 | 。 应用超声波技术己提取出植物中的生物碱、苷类、黄酮类、葸醌、有机酸、 多糖等多种有效成分。印度、美国等已对植物胡椒叶、金鸡纳等药用植物进行 了超声波提取的研究，并取得了良好的效果。江发寿等【4 9 】研究了超声提取法提 取沙枣多糖，结果表明超声法提取多糖有较大的优势。提取时间大大缩短，收 率提高近5 0 。李美琴等1 5o j 比较了超声波法与浸渍法对排毒养颜胶囊内容物提 出率的影响，结果用超声波提取1 0m i n 比浸渍法提取2h 的提取率还要高，并 且超声波对浸出成分无影响。 1 3 2 破碎提取法 破碎提取法是通过破碎提取器使植物材料在适当溶剂中重复破碎，通过机 械及液力剪切作用将物料撕裂和粉碎，成匀浆状而达到提取的目的。破碎提取 法提取快速、完全、且不需要加热，从而可以节约大量的时间、溶剂和能源。 袁珂等【5 l j 用不同方法从冬凌草中提取萜类成分，表明破碎提取法较其它提 取法的冬凌草甲素含量高，时间仅需2 分钟，杂质少，易脱色，单体易结晶。 胡润淮等【5 2 j 对忍冬叶不同提取工艺进行研究，以绿原酸含量为指标，研究表明， 破碎提取法所提取的绿原酸含量比较高，且杂质较少。 1 4 抗氧化作用的研究 1 4 1 自由基学说 自由基( f r e er a d i c a l ) 又称游离基，通常是指在原子的外层轨道上具有未配 对电子的原子、原子团或特殊状态的分子或离子的总称【5 3 1 。自由基是不稳定和 活跃的，具有易与邻近的其它分子发生反应的倾向。在大多数反应中，自由基 易发生连锁反应。一个自由基产生出另一个自由基，不配对电子从一个分子被 传递到另一个分子。只有当两个自由基相遇并结合成电子对时，这种连锁反应 8 第l 章引言 才停止1 5 4 j 。 自由基学说是英国学者h a 肌a n 于1 9 5 6 年首先提出的，其中心内容是“自 由基应普遍存在于生命有机体中，而且自由基是具有高度化活性的中间体，在 正常的生命过程中为维持生命所必需的，但自由基也是生物大分子、细胞和生 物组织的危险杀手”【55 1 。研究表明，与生物体有关的自由基主要有0 中心自由 基( 如超氧阴离子自由基0 2 一、羟自由基o h ) ，n 中心自由基( 如苯基二肼自由 基c 6 h 5 n = n ) ，s 中心自由基( 如烷硫自由基r s ) ，c 中心自由基( 如三氯甲基 自由基c c l 矿) ，h 中心自由基( 如h 原子等) ，过渡金属离子( 如f e ”厄e ”等) 。 人体内以氧形成的自由基最为重要，其来源有两个方面，一是人体自身产 生的，称内源性自由基，例如在机体正常的代谢过程中，细胞呼吸作用和线粒 体内的氧化过程均能产生超氧阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧等许多自 由基；另一种是从环境吸收的，称外源性自由基，各种电离辐射、紫外线辐射、 大气污染等物质、汽车尾气和媒燃烧等都可以产生大量的自由基【5 酬。 机体内清除自由基的途径有两条：一条是通过天然抗氧化酶系统，如超氧 化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 等一系列 以不同基质特异性组成的一个多水平的还原自由基及氢过氧化物系统，它们的 活性随着年龄的增长而下降，其活性可以比较全面的反映机体抗氧化能力；另 一条是通过天然抗氧化剂途径，如维生素e 、维生素c 、辅酶q 等，使自由基 变成不活泼的分子，而自身比较稳定5 3 1 。在正常生理情况下，机体自由基的产 生与清除维持在一个正常的生理水平上，处于动态平衡之中，不会造成危害。 由于某些生理作用或生化反应中需要0 2 一和o h 等参与，机体还要通过自由基 的产生与消除来维持有利无害的稳定平衡的自由基浓度。但在病理情况下，自 由基的产生与清除失去了平衡，不论其原因是自由基产生增加，还是机体清除 自由基的能力减弱，或者两者兼有之，其后果是大量自由基不能完全被防御系 统所清除会在体内积累，引起生物大分子如脂质、蛋白质、核酸的损伤，导致 细胞结构的破坏。0 2 一不仅本身是性质活泼自由基，而且是导致自由基连锁反 应的启动者，促使其它型自由基的生成。越来越多的实验和临床观察表明，自 由基是许多生理和病理过程的参与者，许多疾病的发生都直接或间接与自由基 有关。 9 成都理i ：人学硕+ 学位论文 1 4 2 自由基与中医药研究 中医药学经过长期的实践，几千年的发展，蕴藏着丰富的科学内涵。自由 基生物医学理论的兴起，赋予了中药研究新的内容。目前已发现，中药的有效 成分既可以发挥对超氧阴离子自由基的直接清除作用，即让其成为稳定的基团， 又可以通过调节机体内部的氧化一抗氧化系统，增强机体的抗氧化能力，提高 在氧化应激状态下保护机体的作用，达到防病治病的目的，并且对机体内产生 超氧阴离子的系统具有抑制作用【5 引。因此，中药对氧化一抗氧化系统的双向调 节作用，使中药在自由基生物医学研究领域中充满魅力。研究表明，许多中药 富含活性多糖成分，已经引起国内外研究人员的极大重视。黄芪多糖的免疫增 强作用，香菇、猪苓多糖的抗肿瘤作用，银耳多糖的保护肝细胞作用，芦荟多 糖的抗肿瘤和抗艾滋病毒作用等，都与其抗氧化作用密切相关。 1 4 3 抗氧化活性评价方法 不同的中药对不同的氧自由基清除效果各异，机理也各不相同，所以根据 不同的中药以及氧自由基建立其相应的检测方法来评价中药的抗氧自由基活 性。已报道的评价中药抗氧自由基活性的方法主要有p v ( 油脂过氧化值) 法、化 学发光法、分光光度法和电子顺磁共振法( e s r ) 等。 分光光度法是利用某体系在氧化或自氧化过程中生成自由基，自由基与某 些化合物作用，产生具有特定吸收的有色物质，用分光光度计进行测定，可间 接判断受试物对自由基的清除作用。包括：辣根过氧化物酶法( h r p ) 、h r p 一 莨菪亭法、h i 冲一高香草酸法( 检测h 2 0 2 能力) ；f e n t o n 反应产生o h 的水杨酸 法和铁氧化邻二氮菲法；邻苯三酚自氧化法、肾上腺素法、氯化硝基四氮唑蓝 法( n b t ) 法和细胞色素c 还原法( 检测0 2 一清除能力) 等。 l o 第l 章引言 1 5 选题的目的意义和研究内容 目前对五倍子的研究集中于其主要成分单宁酸的分离提取，及其化学和药 理研究，关于五倍子多糖的研究尚未见报道。尽管许多研究已充分证明了大量 植物多糖具有各种活性，但有些多糖的提取方法和工艺尚未成熟，基于效率、 成本多方面的考虑，各种方法的开发、比较、分析，仍是研究工作的焦点之一。 本研究旨在探讨超声波、破碎法辅助萃取五倍子多糖的工艺优化条件，通过二 次回归正交旋转组合设计、正交试验设计对其优化筛选，并对提取的粗多糖进 行抗氧化性及抗菌试验测定，为工业生产及科学研究等工艺操作提供参考。 成都理l ：人学硕七学位论文 第2 章超声波法提取五倍子多糖的工艺优化 2 1 前言 试验设计的主要作用是降低试验误差，提高试验精确度，使研究人员从试 验结果中获得无偏的处理效应及试验误差的估计，进行f 确而有效的比较。回 归设计要求以较少的试验点建立精度较高的回归方程，根据试验目的和数据分 析来选择设计试验点，使试验点在因子空间中合理地分布不仅使得每个试验点 上获得的数据含有最大的信息，减少试验次数，而且使数据的统计分析具有一 些良好的统计性质【5 7 | 。 所谓二次回归正交旋转组合设计是指安排试验点与试验中心点距离相等的 点上，使预测值的方差相等，其最大优点在于：( 1 ) 试验次数比较少；( 2 ) 计算简 便；( 3 ) 消除了回归系数间的相关性；( 4 ) 预测值的方差大小不易受到试验点在因 子空间中位置的影响。 在二次回归正交旋转设计中，采用组合设计方法，通过因子点、星号点、 中心点的组合，可以设计满足旋转性、正交性等不同试验计划，此类组合设计 主要在于变量参数p 、星号臂值y 以及各因素中心点数目m o 选择【5 8 】。 邢东旭等【5 9 j 应用二次回归正交旋转组合设计提取桑叶多糖，实验所得桑叶 多糖提取率较某些报道偏高，这反映出二次回归正交旋转组合设计能够