（生物化学与分子生物学专业论文）有机磷农药降解菌的筛选及其降解特性研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 有机磷类农药具有高效、低毒、低残留等特点，在保证农作物增产保丰的同时， 长期大量使用所造成的环境污染已不容忽视。环境微生物降解具有高效率、低成本、 无二次污染、降解彻底等优点，是修复有机磷农药污染土壤的有效途径之一 本研究分别从湖北沙隆达农药厂、黄冈棉田、荆州农田等不同污染环境土壤中 取样，以甲胺磷( m a p ) 、甲基对硫磷( m p ) 农药作为受试农药，通过富集培养， 筛选分离到多株降解菌。选取甲胺磷降解菌h s a 3 2 、甲基对硫磷降解菌h s d 3 8 为实验菌株，对其进行了生理生化及1 6 sr d n a 鉴定，并对降解特性进行了研究。 研究表明，h s - a 3 2 能以甲胺磷为唯一的碳源和氮源生长。通过薄层色谱( ，n ) 及高效液相色谱( h p l c ) 对m a p 降解进行了定性和定量研究。结果表明，h s - a 3 2 菌能以m a p 作为唯一的碳源和氮源生长。接种该菌于5 0 0m g l 的m a p 无机盐液 体培养基中，3 5 、1 5 0r p m 振荡培养3 d ，对甲胺磷降解率可达8 6 ，是一株甲胺 磷高效降解菌。外加易利用的碳、氮源能促进该菌对甲胺磷的降解。薄层色谱结果 表明，h s - a 3 2 降解m a p 过程中有n h 4 + 生成，说明该菌产生的降解酶能切断p n 键而获得生长所需的n 源。提取h s - a 3 2 基因组d n a ，设计特异性引物，p c r 扩 增出1 6 sr d n a 片断。测序并进行b l a s t 检索，c l u s t a lw - 敬件进行序列比对， p h y l i p 软件构建系统进化树。结果表明h s - a 3 2 菌株与不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 的同源性为9 8 。结合生理生化鉴定结果，确定h s - a 3 2 菌属不动杆菌属 ( a c i n e t o b a c t e r ) ，命名为a c i n e t o b a c t e rs p h s - a 3 2 。降解广谱性实验表明，h s a 3 2 对三唑磷、甲基对硫磷、辛硫磷、敌敌畏均有不同程度的降解，是一株有机磷广谱 降解菌。 降解菌h s d 3 8 降解甲基对硫磷的最适温度为3 5 c ，最适p h 值为7 0 ，m p 的最 适降解浓度为2 0 0m g n , 。降解动态研究表明，h s d 3 8 降解m p 的同时，也能降解 中间产物对硝基酚( p n p ) ，可能具有矿化m p 的能力。生理生化及1 6 sr d n a 鉴定 结果表明，h s d 3 8 与铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 的同源性为9 8 o ， 初步鉴定h s d 3 8 菌为铜绿假单胞菌属( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 夕，命名为 p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s as p h s d 3 8 。底物利用实验表明，h s d 3 8 具有广泛的底物 适应性，能利用多种碳、氮源生长，且能降解二苯胺、对苯二酚等芳香族化合物。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 分别以不同浓度的s d s 和吖啶橙( a o ) 进行质粒消除，以确定降解酶编码部位。结 果表明，适宜浓度的s d s 和吖啶橙( a o ) 均能得到h s - d 3 8 质粒消除子。降解实验证 实，质粒消除菌不能降解m p 和p n p ，推测编码降解酶基因与质粒有关。 关键词：有机磷农药：微生物降解；1 6 sr d n a 鉴定；降解特性；质粒消除； 薄层色谱 n 顽士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t o r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s f i eh i g h e re f f i c i e n c y , l o w e rr e s i d u e ，a n dt h e ye n s u r e dt o i n c r e a s ep r o d u c t i o nw h e nl o n g - t e r ma n dw i d e l yu s e d w h i l ea st h ee n v i r o n m e n tp o l l u t i o n c a u s e db yt h e mc o u l dn o tb en e g l e c t e d d e g r a d a t i o nb ym i c r o o r g a n i s mh a v em a n y a d v a n t a g e ss u c ha sh i g h e re f f i c i e n c y , l o w e rc o s t , n os e c o n d a r yp o l l u t i o na n dc o m p l e t e d e g r a d a t i o n ，a n di ti so n eo ft h eb e s tw a y t ob i o r e m e d i a t et h ep o l l u t i o ns o i l s i nt h i ss t u d ys o m es t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h ep o l l u t e ds o i l ss a m p l e d r e s p e c t i v e l y f r o ms a n o n d ap e s t i c i d ef a c t o r yi ns h a s h i ，c o t t o nf i e l d s i nh u a n g g a n ga n df a r m l a n di n j i n g z h o u t h e s e s t r a i n sc o u l d d e g r a d eo r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s s u c ha s m e t h a m i d o p h o sa n dm e t h y lp a r a t h i o n t h e s t r a i nh s a 3 2c a p a b l eo fd e g r a d i n g m e t h a m i d o p h o sa n dh s - d 3 8c a p a b l eo fd e g r a d i n gm e t h y lp a r a t h i o nw e r es e l e c t e da n d t h ep r e l i m i n a r ys t u d yi n c l u d i n gp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s ，1 6 sr d n a i d e n t i f i c a t i o n , t h e i rd e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sw e r ec a r r i e do u t t h eq u a n t i t i v ea n d q u a l i t a t i v er e s e a r c ho fm a pd e g r a d a t i o nb yh s - a 3 2s t r a i nw e r ep r o c e s s e db yt h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y w i t hd n s - c ia n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 凹旧t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th s - a 3 2c o u l du s em e t h a m i d o p h o sa st h es o l ec a r b o n a n dn i t r o g e ns o u r c e t h er a t eo fd e g r a d i n gm a pw a su pt 08 6 w i t h i n3d a y si nt h e c o n d i t i o n so f3 0 ，1 5 0r p ms h a k i n g , a n d5 0 0m g l 眦t h ee f f i c i e n c yo fm a p d e g r a d a t i o nw a s i n c r e a s e db ya d d i n ga v a i l a b l ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e n h 4 + c a nb e d e t e c t e db yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y w i t hd n s - c i t h i sr e s u l ts h o w e dt h e d e g r a d a t i o ne n z y m eh o m e db yh s - a 3 2c o u l db r e a kt h ep - nc h e m i c a lb o n da n dg a i n e d n i t r o g e ns o u r c ef o rg r o w t h t h ec h a r a c t e r i s t i c so fh s - a 3 2w e r ei n v e s t i g a t e di n c l u d i n g 1 6 sr d n aa m p l i f i c a t i o n , s e q u e n c i n g , a n db l a s ta n a l y s i s t h ep h y l o g e n e t i ct r e eo f h s - a 3 2w a sc o n s t r u c t e db yp h y l i ps o f t w a r e t h e s er e s u l t so fp h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lt e s t si n d i c a t e dt h a th s - a 3 2b e l o n g st oa c i n e t o b a c t e r h s - a 3 2s t r a i nc o u l d a l s od e g r a d eo t h e ro r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e ss u c ha st r i a z o p h o s ，m e t h y lp a r a t h i o n ， p h o x i m e ，d i c h l o v o ，a n di ti sab a c t e r i u mw i t hh i 【g he f f i c i e n c ya n db r o a d s p e c t r u ma b i l i t y o fd e g r a d a t i o no r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s t h eb a c t e r i u mh s d 3 8c o u l du s em e t h y lp a r a t h i o na st h es o l ec a r b o na n dn i t r o g e n s o u r c e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rh s d 3 8g r o w t hw e r e3 5 1 2o ft e m p e r a t u r e ，p h7 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 0 0m g lm pc o n c e n t r a t i o n ，a n dm pt o l e r a n c ec o n c e n t r a t i o nw a su pt o8 0 0m g 儿t h e r e s u l t so fd y n a m i cs c a n n i n ga n dt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h yw i t hd n s - c ii n d i c a t e dt h a t h s - d 3 8c o u l dd e g r a d ep - n i t r o p h e n o li nt h ec o u r s eo fd e g r a d i n gm e t h y lp a r a t h i o n ，a n di t c o u l da b s o l u t e l yd e g r a d em e t h y lp a r a t h i o n t h ec h a r a c t e r i s t i c si n c l u d i n gb i o c h e m i s t r y c h a r a c t e r i s t i ca n d1 6 sr d n ap h y l o g e n v t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a th s d 3 8b e l o n g e dt o p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a s u b s t a n c ea p p l i e dt e s t ss h o w e ds e v e r a lk i n d so fc a r b o na n d n i t r o g e ns o u r c ec o u l db eu s e db yh s d 3 8 ，a n dp - n i t r o p h e n o lc o u l db eu s e da st h es o l e c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e t h es t r a i nc o u l dd e g r a d ea r o m a t i cc o m p o u n ds u c ha sp h e n o l a n d p b e n z e n e d i o l b u tc o u l dn o t d e g r a d e t o b e n z e n e ，1 , 3 - b e n z e n e d i o l a n d 2 ，4 - d i n i t r o p h e n 0 1 p l a s m i do fh s - d 3 8w a sc u r e dt r e a t e db yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f s d sa n da c r i d i n eo r a n g e ( a o ) i no r d e rt od e t e r m i n et h ec o d i n g - s i t eo fd e g r a d a t i o n e n z y m e p l a s m i d c u r e ds t r a i no fh s d 3 8c o u l dn o td e g r a d em pa n dp n ps h o w e dt h a t d e g r a d a t i o ne n z y m e sw e r eb o m e d i np l a s m i d k e yw o r d s ：o r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s ；b i o d e g r a d a t i o n ；1 6 sr d n ai d e n t i f i c a t i o n ； d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ；p l a s m i dc u r e d ；t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 项士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 储摊：粕 日期：矽鳞f 月肜日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名：躺 日期：妒c 7 年1 箩月歹。日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程一，同意将本人的 学位论文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并明安“章程一中的 规定享受相关权益。回童诠塞握奎卮溢厦! 旦坐生；旦= 生；丝生筮查： 懈名：洳承移 日期：纱b 年5 月归 辨阮匆绣乏 日期：矽年乡月刀日 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 1 综述 农药，尤其是化学农药的使用，仍然是目前世界各国防治粮食和其它农作物病 虫害的主要和有效手段。而大量化学农药的使用，特别是高毒、高残留、难降解农 药的使用，是造成环境污染的主要“杀手 。统计资料表明n 1 ，全国受农药污染的农 田约1 6 0 0 万公顷，主要农产品的农药残留超标率为2 0 。如果停止使用农药，估计 作物产量将减少3 0 。农药污染范围广、面积大、时间长，不仅污染农作物和土壤， 而且还进一步污染地下水。农药在杀死靶标生物的同时，也或多或少地杀死非靶标 生物。对周围环境乃至整个生态环境造成严重的破坏，甚至直接危害人类健康，威 胁着人类的生存，严重制约着人类社会可持续发展。要解决这一矛盾，一方面要积 极开发高效、低毒、低残留的化学农药，以高效、广谱、安全的生物农药替代化学 农药；另一方面，必须通过自然的或人工方式加速土壤残留农药的降解，实现受污 染土壤的微生物修复。经过半个多世纪的研究，目前已分离到很多能降解或转化某 种或几种农药的微生物类群阶圳。通过从自然界分离和筛选具有高效降解特性的微 生物，并以现代生物技术为手段构建遗传工程菌，进行残留农药的高效降解，已成 为当今相关领域研究的热点 1 1 常用化学农药的种类及特点 化学农药按其功能不同，主要分为杀虫剂( i n s e c t i c i d e ) 、除草剂( h e r b i c i d e ) 和杀菌剂( f u n g i c i d e ) 三大类依据化学结构不同，可分为有机氯类、有机磷类、 拟除虫菊脂类、氨基甲酸脂类和无机农药等多种类型。这些化学农药的共同特点是： 有毒性，且靶向性差；残留性，一般分为高残留、中残留和低残留等；迁移 性和累积性，可通过空气、土壤或地下水发生迁移，甚至在生物体内累积 有机氯类杀虫剂是最早使用的化学农药，如滴滴涕( d d t ) 、六六六等此类农 药残留性强，容易造成积累，不易被微生物降解。因此，许多国家先后禁止使用， 我国也于1 9 8 3 年起停止生产有报道全世界d d t 使用了约2 0 0 万吨，近1 0 0 万吨 仍残留在环境中。有机磷类杀虫剂是目前使用量最大的农药之一，多属于高效农药， 有一定的残留期。常见的有对硫磷( p a r a t i o n ) 、甲基对硫磷( m e t h y lp a r a t h i o n ) 、 甲胺磷( m e t h a m i d o p h o s ) 和敌敌畏( d i c h l o v o ) 等。拟除虫菊脂类杀虫剂属高效、低 毒、低残留农药，易被多种微生物降解，如氰戊菊脂( f e n v a l e r a t e ) 、顺式戊氰菊 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 酯( e s f e n v a l e r a t e ) 、醚菊酯( e t h o f e n p r o x ) 等。氨基甲酸酯类农药属高效、低毒、 低残留的新农药，易被多种微生物降解，如拉维因( t h i o d i c a r b ) 、抗蚜威 ( p i r i m i c a r b ) 、叶蝉散( i s o p r o c a r b ) 、呋哺丹( c a r b o f u r a n ) 等。除草剂常见的有三 氮苯类，如阿特拉津( a t r a z i n e ) 、赛克津( m e t r i b u z i n ) 等。这类农药残留期长，在 土壤中降解缓慢。磺酰脲类除草剂如氯磺隆( c h l o r s u l f u r o n ) ，能有效地防除多种 阔叶杂草和部份禾本科杂草，但在土壤中残效期长达2 - 3 年b 1 。其它如2 ，4 一d ( 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d ，苯氧羧酸类) 、除草醚( n i t r o f e n ，二苯醚 类) 、敌稗( p r o p a n i l ，酰胺类) 、氟乐灵( t r i f l u r a l i n ，二硝基苯胺类) 等也是 较常用的除草剂。大多数除草剂对人畜的急性毒性低，但在土壤中的残留期相对较 长，较难降解。杀菌剂是对各种病源微生物有杀灭和抑制作用的一类化学药剂，如 稻瘟净( k i t a z i n ) 是1 9 6 5 年日本首先使用的有机磷杀菌剂。常见品种还有百菌清 ( c h l o r o t h a l o n i l ) 、敌克松( f e n a m i n o s u l f ) 、托布津( t h i o p h a n a t e ) 、多菌灵 ( c a r b e n d a z i m ) 、井岗霉素( v a l i d a m y c i n ) 等。目前，杀菌剂已发展到2 0 0 余种。近 十几年，由于农用抗菌素类有较快发展，淘汰了有机汞、有机砷、有机氯类毒性大、 易污染、难降解的杀菌剂。 1 2 降解农药的微生物种类 土壤微生物是土壤环境生态系统中的重要成员，包括细菌、真菌、放线菌、藻 类和原生动物等。土壤残留农药，除一部分通过热分解、光分解和化学分解外，大 部分可通过环境微生物的降解或转化作用，使有毒的农药转化为无毒或低毒的其它 化合物。一些从自然界中分离出的能降解农药的微生物卜酬，包括细菌、真菌、放 线菌等( 见表1 ) 表1 降解农药微生物类别 降解微生物农药 细菌类 假单孢菌p s e u d o m o n a $ 芽胞杆菌b a c i l l u s 产碱杆菌a l c a l i g e n e s 乐果六六六2 ，4 一d 阿特拉津单甲咪狄氏剂 敌敌畏甲胺磷甲拌磷 六六六d d t 阿特拉津狄氏剂对硫磷甲胺磷 乐果七氯涕灭威 敌杀死d d t 对硫磷甲基对硫磷氯氰菊酯氰 戊菊酯杀螟松溴氰菊酯 2 硕士擎住论文 m a s t e r st h e s i s 无色杆菌a c h r o m o b a c t e r 黄杆菌f l a v o b a c t e r i u m 棒状杆菌c o r y n e b a c t e r i u m 埃希氏菌e s c h e r i c h i a 大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i 地衣芽孢杆菌 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 梭状芽胞杆菌c l o s t r i d i u m 节杆菌a r t h r o b a c t e r 链球菌s t r e p t o c o c c u s 气杆菌a e r o b a c t ) 枝动杆菌m y c o p i a n ) 硫杆菌t h i o b a c i l l u s 真菌类 白腐真菌w h i t e - r o t f u n g u s 根霉r h i z o p u s 青霉p e n i c i l l i u m 曲霉a s p e r g i l l u s 焦曲霉a s p e r g i l l u su s t u s 镰孢霉菌n e u r o s p o r a 链格孢菌a l t e r n a r i as p 毛霉m u c o r 木霉t r i c h o d e r m a 瓶型酵母n e p l a n o c i n 芽枝霉属c l a d o s p o r i u m 烟曲霉 a s p e r g i l l u sf u m i g a n t u s 放线菌类 诺卡氏菌n o c a r d i a 小单胞菌m i c r o m o n o s p o r a 2 ，4 ，5 一t2 ，4 一dd d t 阿特拉津六六六 2 4 一d 对硫磷甲基对硫磷杀螟松水胺硫磷 2 ，4 一dd d t d d t 丙体六六六 对硫磷 敌敌畏对硫磷甲胺磷 丙体六六六 2 ，4 一d d d t 七氯 d d t 2 ，4 ，6 一t 甲拌磷 d d t 阿特拉津丙体六六六 七氯幼脲3 号阿特拉津 阿特拉津艾氏剂氯磺隆幼脲3 号 甲胺磷乐果2 4 一d 敌百虫七氯 阿特拉津 艾氏剂七氯d d t 敌百虫 甲基对硫磷 幼脲3 号 甲基对硫磷 阿特拉津甲胺磷 幼脲3 号 阿特拉津 2 ，4 一dd d t 七氯 七氯 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 从表中可以看出，土壤微生物对残留农药的降解，以细菌和真菌为主，细菌多 于真菌。放线菌作为土壤中一大类微生物，所发现的降解微生物较少。有的微生物 专一降解某种农药，表现出降解惰性，如节杆菌和气杆菌等，有的能同时降解多种 农药，比较典型的有假单胞菌和芽胞杆菌等，有的不直接降解农药，而是通过共代 谢完成降解过程7 1 。细菌中降解优势菌主要为假单胞菌、芽胞杆菌、产碱杆菌、 无色杆菌、黄杆菌等真菌主要是霉菌。这些环境微生物对农药降解具有广谱活性， 可降解同类农药的多种品种m 1 或不同类型农药品种n 町，是构建工程菌较好的微生物 种源。具有降解专一性的微生物对农药选择性强，与这些微生物所产生的酶基因和 农药的化学结构有关。此外，可以看出，微生物降解与农药特性有关。高毒高残留 农药，所发现的降解微生物相对较多，如有机氯类和有机磷类，而近几年开发并已 投入使用较多的拟除虫菊酯类和氨基甲酸脂类农药，其降解微生物的研究和报道相 对较少，这可能与其高效低残留性有关。 自然界中微生物生态多样性决定了微生物物种的多样性，据 国际微生物学会 联盟通讯( i u m sn e w s ) 有关专家估计，全球约有5 0 万6 0 万种微生物，而今已 被研究和记载的还不到5 ，在如此丰富的微生物资源库中，由于自然环境及其它理 化条件的差异，尤其是长期受农药协迫的环境中，相信仍有很多降解农药的微生物 未被发现。 1 3 降解农药微生物的降解特性 环境微生物降解农药是比较复杂的生理生化过程。土壤微生物的种类、数量、 理化特性以及降解效率等与所在土壤类型、土壤物理性质、土壤形成过程、农药种 类、农药的化学性质以及外部环境因子等均有密切关系。概括起来，环境微生物农 药降解特性主要表现在以下几个方面： 1 3 1 酶促降解 微生物降解农药的途径有酶促作用和非酶促作用。非酶促作用是微生物通过其 活动改交了化学和物理环境，如p h 值及土壤胶体对农药的吸附作用等而间接作用 于农药。微生物降解农药实质是酶促催化反应m q 嘲。m u n n e c k e 等分离得到的有 机磷农药降解酶对甲基对硫磷、二嗪农、毒死蜱等7 种有机磷农药均能有效降解， 在2 2 c 时降解效率比化学降解快，且该酶不被农药及农药制剂中溶剂所抑制，对环 境条件有较宽的忍受范围。微生物降解酶主要有加氧酶、脱氢酶、过氧化物酶、裂 解酶等，这些酶既有胞内酶也有胞外酶。依据对农药降解和转化的形式，可以将各 4 项士学位论文 m a s t e r st h e s i s 类酶促反应分为氧化、还原、脱羧、脱氨基、脱烷基、脱氯、脱氢、水解、酯化、 脱水、缩合、氨化、乙酰化、环开裂等类型。 1 3 2 环境因子对生物降解的影响 环境因子如土壤的p h 值、温度、含水量、溶氧量、盐度、有机质含量、粘度 及气候条件等均影响微生物对农药的降解。其中，土壤p h 值对降解影响相对较大， 不仅影响微生物降解酶的活性，同时也影响农药的化学降解。b r a j e s h 等嘲研究了 p h 值对苯线磷和毒死蜱农药降解的影响，在p h 为4 7 - 6 7 ( 酸性) 时，毒死蜱降 解的半衰期由2 5 6 天降至3 5 天，然而，在p h 值为7 7 8 4 ( 碱性) 范围内，半衰 期降至1 6 天。而苯线磷降解菌在p h 值为6 7 - - 6 8 降解最快。王军等n 铂研究了二 甲戊乐灵在7 5 f c ( 土壤含水量) 和1 2 0 f c 下比在3 0 f c 下的微生物降解快，其原因 可能是高f c 下土壤微生物的相对活性较高。温度影响酶反应动力学、微生物生长 速度等。有些营养元素，尤其是生长因子必须从环境有机质中摄取，这些环境因子 对微生物的生命活动及降解特性起着至关重要的作用。综合各类文献，实验室条件 下微生物降解的最适条件为：温度2 8 - - 3 5 ，p h 值为6 8 7 5 ，以及其它适宜 条件 1 3 3 农药的化学结构与生物降解 农药的基团和分子结构决定其在微生物环境中的降解行为。农药的化学结构决 定了其溶解性、分子排列和空间结构、化学官能团、分子间的吸引和排斥等特征， 并因此影响农药能否被微生物所摄取。与生命物质的分子结构越相似，这类物质越 容易被微生物所降解。目前从自然中分离的很多广谱降解菌，对同类农药具有降解 作用是由于这些农药具有相同或相似的结构。刘玉焕等n 3 1 分离出有机磷农药广谱降 解菌对乐果、甲胺磷、氧化乐果、马拉硫磷等有较好的降解效果，是由于有机磷农 药具有类似的结构，只是取代基不同。农药化学结构中所含的卤素、氮、氢等原子， 会降低有机物的生物降解性，这类基团的数目越多，生物降解性越差。而羟基和羧 基的存在，则有利于生物降解性。农药的化学结构决定了它被微生物降解的速度。 i ) e f r a n k 等n 明从一株嗜盐细菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，该酶可被m 9 2 + 和 c c 激活，对含磷氟键的有机磷化合物作用效果较好，对含磷氧键的有机磷化合物作 用效果较差。对于芳香族化合物，苯环上取代氯的数目越多，降解越困难。苯环上 间位取代类型最难降解。因此2 ，4 ，5 - - t 的生物降解比2 ，4 d 要难得多。在2 0 天内，2 ，4 ，5 - - t 几乎未被降解，但2 ，4 - d 在2 0 天内降解9 0 以上哺5 农药的 其它理化特性，如水溶性、吸附性等也影响微生物的降解性。 ， 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 3 4 降解菌代谢类型多样性 从微生物的营养类型来说，有的微生物以某种农药为其生长的唯一的碳源、氮 源、磷源或能源，有的则通过共代谢的方式降解农药。此外，有的微生物不从农药 中获取营养或能源，而是发展了为保护自身生存的解毒作用，称为去毒代谢作用。 目前分离到的农药降解菌，以农药作为碳、氮源或能源的相对较多。s i n g h 等嗍分 离到一株不动杆菌a c i n e t o b a c t e rs p ，该菌能降解阿特拉津，并能以其作为唯一的 碳源但不能作为唯一的氮源生长。而w a c k e t t 等嘲1 从土壤中分离出一株p s e u d o m o n a s s p 能降解除草剂阿特拉津，并能以阿特拉津为唯一氮源生长。王永杰等人皿1 从污泥 中分离到以共代谢方式广谱降解有机磷农药的地衣芽胞杆菌，其降解酶系经诱导后 可降解甲胺磷、敌敌畏、对硫磷等，外加易利用碳源影响其降解活性。王保军等n 刀 研究认为，多门萨单孢菌d r 8 不能以单甲脒为唯一的碳源和氮源生长，只能在添加 其它有机营养基质的条件下生长，且降解产物未完全矿化，因此该农药的降解代谢 也属于共代谢。实际上，共代谢在对难降解农药的微生物降解过程中占主导作用。 农药降解微生物的降解特性是多方面的，混合微生物的降解效率比纯培养单株 菌株的降解率更高，降解更彻底。单一微生物对农药的生物降解往往产生有毒的代 谢物。这种代谢物对微生物的生长有抑制作用，需要其它微生物群落来消除。另外， 在微生物生态系统中，微生物对降解也产生很大影响，长期使用单一品种或同一类 农药会导致微生物抗性的产生，同时也会引起降解微生物的富集。a n d e r s o n 发现， 克菌丹能使真菌数量大减，而细菌数量不变。魉个月后，微生物又恢复到对照水平。 因此在降解微生物的分离中，这类土壤是最好的样品来源。土壤中的多种具降解特 性的微生物，随着各项研究的深入，其降解特性及降解机理正逐步被人们所发现和 认识 1 4 有机磷农药降解研究进展 有机磷农药一般为磷酸、膦酸或氨基磷酸的酯或硫醇衍生物，结构通式为： r l x 广z r 2 式中r 、r 2 为甲氧基( c h 3 0 ) 或乙氧基( c ：h 5 0 ) 等取代基，x 为氧( o ) 或硫( s ) 原子， 6 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s z 为烷氧基、苯氧基或其他更为复杂的取代基团。由于有机磷农药结构相似，因此， 降解有机磷农药的微生物所产生的降解酶系能作用不同农药的相同结构，切断某种 化学键，从而达到广谱降解多种有机磷农药的目的。 1 4 1 降解有机磷农药微生物的种类 目前，已经分离的降解有机磷农药的微生物，包括细菌、真菌、放线菌、藻类 等。其中，细菌由于其生理生化上的多种适应能力以及易诱发突变菌株，在降解微 生物中占重要地位。表2 列出了几种主要有机磷农药的降解微生物。从表2 可看出， 某些有机磷农药同时有多种降解菌，同一种菌也会对多种有机磷农药具有降解作 用，体现了微生物种类的多样性以及某些微生物功能的多样性，同时提示某些微生 物可以应用于一种或多种农药的降解，而另一些则只能用于特定种类农药的降解。 表2 降解有机磷农药的微生物 有机磷农药降解微生物 甲基对硫磷邻单胞菌属p l e s i o m o n a ss p d l l - 1 假单胞菌p s e u d o m o n a ss p a 3 黄杆菌属f l a v o b a c t e r i u ms p a t c c 2 7 5 5 1 大比目鱼黄杆菌e b a l u s t i n u m 假单胞茵p s e u d o m o n a ss p w b c - 3 微藻m i c r o a l g a e 藻青菌c y a n o b a c t e r i a 产碱菌属a l c a l i g e n e ss p 芽孢杆菌b a c i l l u ss p 甲胺磷 鲁氏酵母s a c c h a r o m y c e s r o u x i iw y - 3 假单胞菌p s e u d o m o n a ss p w b - 1 瓶形酵母菌p i t y r o s p o r u m 芽孢杆菌b a c i l l u ss p n m - j 5 对硫磷青霉p e n i c i l l i u mw a k s m a n i 黄杆菌属f l a v o b a c t e r i u ms p a t c c 2 7 5 5 1 假单胞菌p s e u d o m o n a ss p a t c c 2 9 3 5 3 芽孢杆菌b a c i l l u ss p 节杆菌a r t h r o b a c t e rs p 不动杆菌属a c i n e t o b a c t e rs p 7 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 毒死蜱 久效磷 辛硫磷 三唑磷 乐果 氧乐果 蝇毒磷 草甘膦 二嗪磷 微球菌m i c r o c o c c u ss p m 3 6 和a g 4 3 假单胞菌p s e u d o m o n a ss p a 3 黑蓝节杆菌a r t h r o b a c t e ra t r o c y a n e u sm c m b - 4 2 5 巨大芽孢杆菌b m e g a t e r i u m 铜绿假单胞菌r a e r u g i n o s af 1 0 1 3 邻单胞菌p l e s i o m o n a ss p 苍白杆菌属o c h r o b a c t r u ms p 铜绿假单胞菌p a e r u g i n o s am c m b d 2 黄曲霉a s p e r g i l l u sf l a v u s 聚多曲霉a s p e r g i l l u ss y d o w i i 假单胞菌p s e u d o m o n a ss p n m 1 3 巨大芽孢杆菌b m e g a t e r i u m 放射形土壤杆菌a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e rp 2 3 0 诺卡氏菌n o c a r d i as p b 1 ，b 2 ，b 3 假单胞菌r m o n t e i l l i 假单胞菌属p s e u d o m o n a ss p 4 a s w 无色菌属a c h r o m o b a c t e r 青霉属p e n i c i l l i u mn o t a t u m 曲霉a s p e g i l l u sb 2 1 嗜热菌属g e o b a c i l l u sc a l d o x y l o s i l y t i c u st 2 0 黄杆菌属f l a v o b a c t e r i u ms p a t c c 2 7 5 5 1 假单胞菌p s e u d o m o n a ss p a 3 假单胞菌p s e u d o m o n a ss p a t c c 2 9 3 5 3 1 4 2 有机磷农药降解酶及其编码基因 生物体内存在多种不同的有机磷降解酶，如有机磷水解酶，有机磷酸脱水酶等， 其中最常见的有机磷降解酶是磷酸三酯酶( p h o s p h o t r i e s t e r a s e s ，p t p ) 。p t p 作为 一类重要的有机磷水解酶已从许多生物体中得到鉴定。研究表明，自然环境中的多 种微生物可以单独或通过协同作用降解有机磷农药。在土壤微生物中，许多农药降 解基因存在于质粒上。研究人员从不同的微生物中分离到各种有机磷降解酶基因， 不同的基因序列对有机磷类农药的降解效果不同。近年来国内外报道的有机磷降解 基因类型及其基因库编号、名称、来源及特性等泓盯见表3 。从表3 可以看出，磷 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 酸酯水解酶类( o p h ) 是一类广谱降解酶，是有机磷农药微生物降解的主要酶种。 表3 有机磷降解酶基因类型 基因库 代号名称来源长度同源性 编号 对硫磷水解酶 f 趾v o b a c t e r i u m o p d m 2 9 5 9 3 s p ( s t r a i na t c c 1 6 9 3 b p 基因 2 7 5 5 1 ) 质粒p c m s i o p d m 2 0 3 9 2磷酸二酯酶基 质粒p c m s i 中的 同源基因 d n a 1 3 2 2 b p 因 磷酸酯水解酶 a g r o h a c t e r i u m o p d a斟0 4 3 2 4 51 2 4 0 b p 基因 t u m e f a c i e n s 甲基对硫磷水 p l e s i o n o m a s s p m p d躺3 8 7 2 99 9 8 b p 解酶基因s t r a i nm 6 同源基因 甲基对硫磷水 p s e u d o m o n a ss p m p h a y 2 5 1 5 5 4 9 9 8 b p 解酶基因 s t m i nw r b c 3 有机磷降解酶 a g r o b a c t e r i u m o p d a1 1 5 5 b p 基因r a d i o b a c t e r 有机磷降解酶 b u r k h o l d e r i as p o p