（林产化学加工工程专业论文）新型固定漆酶复合载体的合成及降解染料的研究.pdf

摘要 来自染料行业和印染行业的废水是最难处理的工业废水之一，污染非常严重。固定化 酶对染料废水的处理已成为人们研究的焦点。固定化漆酶由于其独特的酶降解机理及其广 泛的底物专一性，并且有着游离漆酶所不能比拟的不易失活和可重复利用等特点，因此在 染料废水的降解中有着独特的优势，具有广阔的应用前景。本论文的目的是合成一种性能 优良的新型固定漆酶的载体，它是一种活性炭与丙烯酸酯类树脂的复合型载体。研究了固 定化漆酶对a c i dv i o l e t4 3 降解效果，并对降解产物进行g c m s 分析，提出漆酶降解a c i d v i o l e t4 3 的可能途径。 首先用悬浮聚合法制各一种新型的复合有活性炭的丙烯酸酯类共聚物。制备中官能团 单体为g m a ( 甲基丙烯酸缩水甘油酯) ，含量为总单体量的4 0 ，m m a ( 甲基丙烯酸甲 酯) ，含量为总单体量的3 0 ，交联剂d v b ( 邻二乙烯基苯) ，含量为总单体量的3 0 ， 添加剂活性炭的量为总单体量的1 5 ，致孔剂正庚烷的用量为总单体质量的3 5 倍，水相 为c a c l 2 溶液，水油比( 体积比) 为3 5 ：1 。所制得的共聚物含有环氧基团，表面环氧基 含量为1 8 m m o l g ，表面多孔，其形态结构易于酶的固定化。 在对漆酶进行固定化的过程中，由大量实验得出固定化的最佳反应条件为：漆酶用量 1 0 0 u m l ，固定化温度3 0 ，固定化时间2 4 h ，固定化p h 6 5 。漆酶经固定化后，热稳定 性和p h 稳定性都比游离漆酶有了显著的提高，固定化漆酶的最适p h 值比游离漆酶升 高，适用p h 范围比游离漆酶变广。 制得固定化漆酶后，我们将其用于脱色降解染料a c i dv i o l e t4 3 。综合考虑固定化漆 酶作用的最适温度和热稳定性，确定5 0 。c 为实际应用的最佳温度。固定化漆酶用量增加， 对a c i dv i o l e t4 3 的脱色率增大，由实验确定固定化酶用量为o 5 9 ( 湿重) ，最适p h 为5 0 ， 反应时间为8 h ，脱色率最高可达9 8 6 ，最多可循环使用1 4 次，7 0 水浴中保温1 h 固 定化酶活力仅损失1 4 7 。通过比较不同材料对a c i dv i o l e t4 3 的脱色率和作用前后a c i d v i o l e t4 3 溶液的吸收谱图得出：添加潘胜炭的载体固定化漆酶后对染料的脱色降解并不是 单纯由活性炭的物理吸附所产生，而主要是由漆酶催化氧化还原反应降解a c i dv i o l e t4 3 所发生的：添加活性炭的共聚物作为载体的固定化漆酶有着其他材料所不能，比拟的优越性 能。 通过对降解后物质进行g c m s 分析，提出了固定化漆酶降解蒽醌类染料a c i dv i o l e t 4 3 可能的途径。 通过本文的研究，我们得到了性能出色的固定化漆酶，为应用固定化漆酶处理印染废 水提供了可靠的依据，在环境治理方面具有良好的应用前景。 关键词：悬浮聚合复合型载体活性炭固定化漆酶染料脱色率 a b s t r a c t t h ew a s t e w a t e rf r o md y ea n dp r i n t i n gi n d u s t r i e s ，l e a d i n gt os e r i o u sp o l l u t i o n ，i so n eo ft h e i n d u s t r i a lw a s t e w a t e rw h i c hi st h em o s td i f f i c u l tt ot r e a t m a n ys c h o l a r sf o c u so nt h es t u d yo f i m m o b i l i z e de n z y m eo nt r e a t i n gt h ed y ew a s t e w a t e r i m m o b i l i z e dl a c c a s eh a ss p e c i a l e n z y m e d e g r a d a t i o nm e c h a n i s ma n de x t e n s i v es u b s t r a t es p e c i f f c i t y ；b e s i d e s ，c o m p a r e dt of r e el a c c a s e ，i ti s n o te a s yt oi n a c t i v a t ea n di sa b l et or e u s e ，s oi m m o b i l i z e de n z y m eh a st h eu n o r d i n a r ya d v a n t a g ei n t h ed e g r a d a t i o no f t h ed y ea n dw a s t e w a t e r , s h o w i n gw i d ea p p l i c a t i o np r o s p e r i t y t h ep u r p o s eo f t h i s t h e s i si st os y n t h e s i z eak i n do fc o m p o s i t ec a r r i e rt oi m m o b i l i z el a c c a s e ，t oi n v e s t i g a t ed e g r a d a t i o n e f f e c to fi m m o b i l i z e dl a c c a s eo na c i dv i o l e t4 3 ，t oa n a l y z et h ed e g r a d a t i o np r o d u c tb ym e a n so f g c - m s ，a n dt og i v et h ep o s s i b l ew a yo f l a c c a s e sd e g r a d a t i o no na c i dv i o l e t4 3 an e wk i n do f a c r y l i cc o p o l y m e rw i t hc o m p o s i t ea c t i c a r b o nw a sp r e p a r e dw i t ht h es u s p e n s i o n p o l y m e r i z a t i o n t h eg r o u pm o n o m e r sw e r eg m a ( g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e ) a n dm m a ( m e t e r c r y l i c a c i dm e t h a n o a t e ) ，t h ec o n t e n to fw h i c hw e r e4 0 a n d3 0 o ft h et o t a lm o n o m e rq u a n t i t y ， r e s p e c t i v e l y t h ec r o s s l i n k i n ga g e n tw a sd v b ( o r t h o - d i v ；n y i b e n z e n e ) ，3 0 o ft h et o t a lm o n o m e r q u a n t i t y t h ec o n t e n to fa d d i t i v ea g e n t ，a c t i c a r b o n ，w a s15 o ft h et o t a lm o n o m e rq u a n t i t y t h e a q u e o u sp h a s ew a st h ec a c l 2s o l u t i o n ，a n dt h ev o l u m er a t i oo fa q u e o u sp h a s et oo i lw a s3 5 ：1 t h e c o p o l y m e r p r e p a r e dc o n t a i n e de p o x i d eg r o u p ，w i t ht h ec o n t e n to f s u r f a c ee p o x i d eg r o u p1 8 m m o l 僖， a n dp o r o u ss u r f a c e ，a n di t ss t r u c t u r em a k e si ts u i t a b l ef o r t h ei m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e f r o mah o s to fe x p e r i m e n t s ，i t c a nb ec o n c l u d e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o r i m m o b i l i z a t i o nw e r e ：t h el a c c a s e q u a n t i t y 1 0 0u m l ，i m m o b i l i z a t i o nt e m p e r a t u r e3 0 ， i m m o b i l i z a t i o nt i m e2 4h ，p h 6 5 a f t e rt h ei m m o b i l i z a t i o n ，t h et h e r m a ls t a b i l i t ya n dt h ep hs t a b i l i t y b o t ho b v i o u s l yi m p r o v e dc o m p a r e dt ot h ef r e el a c c a s e ，t h eo p t i m u mp hw a si n c r e a s e d ，a n dt h e p r o p e rp hr a n g ew a se n l a r g e d a f t e rp r e p a r i n gt h ei m m o b i l i z e dl a c c a s e ，i t sd e g r a d a t i o no na c i dv i o l e t4 3w a si n v e s t i g a t e d c o n s i d e r i n gb o t ho p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dt h e r m a ls t a b i l i t yo fi m m o b i l i z e dl a c c a s e ，5 0 。cw a st h e o p t i m u mt e m p e r a t u r e w i t ht h ei n c r e a s eo fi m m o b i l i z e dl a c c a s ea m o u n t ，t h ed e c o l o rr a t eo fa c i d v i o l e t4 3e n l a r g e d i tw a sd e t e r m i n e dt h a tt h ei m m o b i l i z e dl a c c a s ea m o u n tw a so 5 9 ( w e tw e i g h t ) ， w i t ht h eo p t i m u mp h5 0 ，a n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r e8h ，w h i c ht h ed e c o l o rr a t er e a c h e d9 8 6 ；t h e i m m o b i l i z e dl a c c a s ec a r lb er e u s e d 1 4t i m e s w h o s ea c t i v i t yo n l yl o s t1 4 7 a f t e ri n c u b a t i n gf o rl h a t7 0 c t h r o u g hi n v e s t i g a t i n gt h ee f f e c to ( d i f f e r e n tm a t e r i a l so nt h ed e c o l o r ( a t eo f a c i dv i o l e t4 3 a n dt h ed i f f e r e n ta b s o r p t i o ns p e c t r u mo ft h ea c i dv i o l e t4 3b e t w e e nt h ep r e r e a c t i o na n d p o s t r e a c t i o n i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h ed e c o l o r i z a t i o no fa c i dv i o l e t4 3w i t lt h ei m m o b i l i z e d l a c c a s ea d d e da c t i c a r b o nw a sn o to n l yd u et oa c t i c a r b o n sp h y s i c a la b s o r p t i o n ，b u tm a i n l yc a u s e db y o x i d a t i o n r e d u c t i o nw i t ht h ec a t a l y s to fe n z y m et o d e g r a d a t ea c i d v i o l e t4 3 t h el a c c a s e i m m o b i l i z e do nt h ec o p o l y m e r , a d d e da c t i c a r b o n ，h a d s u p e r i o rp r o p e r i t i e s t ot h e e n z y m e i m m o b i l i z e do nt h eo t h e rm a t e r i a l s t h ea n a l y s i so f d e g r a d a t i o np r o d u c tw a sp e r f o r m e do ng c m s ，a n dt h e ni tw a sd e m o n s t r a t e d t h a tt h ep o s s i b l ew a y so fi m m o b i l i z e d a c e a s e sd e g r a d a t i o no na n t h r a q u i n o n ed y e s ，a c i dv i o l e t4 3 t h r o u g ho u rs t u d y ，t h ei m m o b i l i z e d a c c a s ew i t he x c e l l e n tp r o p e r i t i e sw a sg a i n e d ，p r o v i d i n g r e l i a b l ee v i d e n c ef o ri t sa p p l i c a t i o no l lt r e a t i n gt h ed y ew a s t e w a t e r ，r e p r e s e n t i n gg o o da p p l i c a t i o n p r o s p e r i t yi ne n v i r o n m e n t a lt r e a t m e n t k e y w o r d ：s u s p e n s i o np o l y m e r i z a t i o n ，c o m p o s i t ec a r r i e r , a c t i c a r b o n ，i m m o b i l i z e dl a c c a s e ， d y e ，d e c o l o rr a t e ，g c m sa n a l y s i s 致谢 本论文是在导师季永新教授和赵林果副教授的严格要求和悉 心指导下完成的。导师渊博的知识，严谨的沼学态度、开阔的思维 方式，科研工作中勇亏创新，孜孜以求的进取精神、对学术前沿的 准确把握，生活中和蔼可亲、宽以待人的长者风范，将永远激励我。 使我终身受益。攻读硕士三年末，导师给予学生细心的捐导、热情 砖鼓励以及无私的帮助。在此，特向导师致以最诚挚的谢意 在论文的开题中林忠祥教授，朱新宝、朱凯，毛连山等老师 为论文提出了宝贵的意见。在课题的研究过程中，得到杨云老师的 大力支持和帮助。同时得到范旭、尹佳子、黄庆、季瑛、马丽，耿 红涛、胡伟、柳任飞、周潭澈、孟鹏、唐莹、到营、史旭霞等同学 的不同形式的帮助。在此，向诸位老师及同学们表示衷心的感谢， 在三年的硕士期间，得到蔡维维的热情鼓励和无微不至的关 怀，在我遇到困难时给我最大的支持，在此特向她表示我最衷心的 感谢徐莲老师给了我无私的帮助和关怀，在此表示最真诚的感谢? 同室好友黄韶承、梁有旺，孙占英与我一起渡过了许多开心的日日 夜夜，一起分享着学习和生活中的酸甜苦辣。现在我们就要各奔前 程，祝愿大家拥有一个更加美好的明天。 最后，特别感谢我的父母，从小到大他们一直是我最坚强的后 盾总是在我遇到困难时给予我支持和帮助，他们对我无私的爱始 络是我不断前进的动力。谨以此文献给他们，祝愿他们永远幸福快 乐 李强 2 0 0 6 年6 月 第一章绪论 引言 染料是在水溶液或介质中使纤维染上各种坚牢颜色的有色有机化合物。按化学结构 分，主要包括：偶氮染料、蒽醌染料、靛族染料、硫化染料、酞菁染料、次甲基染料、三 苯甲烷染料和杂环染料”。由于生产及使用要求，决定其属于高度稳定的有机分子，具有 耐光、耐热、难物理化学处理及耐生物腐蚀等特性。 近年来，环境污染日益严重，生态平衡遭到严重破坏，对人类自身的生存已构成威胁， 其中水污染是很重要的因素之一。工业生产排放的废水是水污染的主要来源，而在所有的 工业废水中，来自染料行业和印染行业的废水是最难处理的工业废水之一，污染非常严重， 这是因为染料是一种化学结构复杂的化合物，它含有人工合成的复杂的芳香烃分子结构， 很难被除去。据报道，商业染料的种类约有1 0 万种1 2 】，每年染料的总产量为7 1 0 5 吨， 我国年产量已达到1 5 万吨，这其中大约有1 0 1 5 的染料会直接随废水排放到环境当 中。染料具有高度的稳定性，难被生物降解，在自然环境种可以存留很长时间。染料的颜 色是造成印染和染料t _ 、l k 废水高色度的根本原因，它们产生视觉污染，使水体透明度下降， 微生物生长受阻，妨碍水体的自然净化，并且，许多染料是由一些致癌物质( 例如苯胺及 其它芳环物质) 合成，因此染料废水必须进行处理。 染料废水通常通过物理或化学方法处理，主要包括吸附法、混凝沉淀技术、化学氧化 法、离子交换技术、超滤膜技术，光催化技术等f 2 】，然而，这些技术对废水中色度的去除 效果不太明显，并且处理费用高，处理废水的范围较窄，所以众多学者都把研究焦点集中 在微生物及酶对染料废水的处理上。近年来，已有大量可以降解染料的酶的报道，这些酶 种类繁多，其中漆酶是研究比较早的酶类之一。而应用真菌降解染料的报道中，白腐菌是 最常用的一类。 酶的开发利用在2 0 世纪得到了巨大的发展，但由于酶一般必需在温和的条件下才有催 化作用，在实际运用中也就带来了很多问题，从而限制了酶制剂产品的使用和开发，固定化 酶就是在这种情况下产生的，固定化酶技术是在2 0 世纪6 0 年代开始发展起来的。所谓固 定化酶技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶，定位于限定的空间区域并使其保持活 性和可反复使用的一种基本技术【3 】。与其它应用游离酶的过程相比，固定化酶有许多优点 【4 l ： 1 酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高，对热、p h 等的稳定性提高，对抑制剂的 敏感性降低，有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性； 2 反应完成后经过简单的过滤或离心，酶就可以回收，而且酶活力降低较少，这样就降 低了生产成本： 3 固定化体系适合于连续化、自动化生产，催化过程容易控制，且产品中不会带进酶蛋 白或细胞，改善了后处理过程，提高了酶的利用效率，降低了生产成本。 本课题通过对固定化载体合成的研究与固定化漆酶对染料脱色降解的研究，找到了性 能优良的固定化漆酶载体，研究了固定化条件对固定化漆酶脱色降解染料能力的影响。 1 1 白腐菌酶系及白腐菌降解染料的研究 自然界中自腐真菌是一种重要的生物资源，它们对木质素具有良好的降解能力。白腐 真菌在次级代谢阶段产生的木质素过氧化物酶( l i p ) 、锰过氧化物酶( m n p ) 、漆酶( l a c c a s e ) 被认为是降解木质素和染料的特殊酶系i m 。 1 9 8 3 年g l e n n 5 1 等研究了用木质素降解酶降解p o l y b 一4 1 1 、p o l y r 一4 8 1 和p o l y y - 6 0 6 ， 从而首次证明黄孢原毛平格菌对一些聚合染料有降解作用。1 9 8 8 年b u m p u s 6 1 等研究证实， 黄孢原毛平格菌能对碱性紫5 b n 这种三苯甲烷染料进行脱色降解。1 9 9 0 年c r i p p s 7 1 等第 一次报道，黄孢原毛平格菌能降解偶氮染料和杂环染料。此后，用白腐真菌对染料及染料 工业废水进行脱色降解的研究变得积极、活跃起来。张朝晖( 8 等研究了黄孢原毛平格菌对 偶氮染料卡步龙红、弱酸大红、直接红、活性嫩黄和阳离子蓝的降解，结果表明，在染料 浓度( p = m g l _ 1 ) 分别为2 5 、5 0 、1 0 0 时，经过2 5 天的降解后，染料基本脱色。h e l e n n a p o d g o r n i k l 9 等研究了用黄孢原毛平格菌对靛蓝胭脂红进行脱色降解，结果表明，木质素过 氧化物酶和锰过氧化物酶都能成功的降解该染料，且锰过氧化物酶的降解速度比较快。 m a d o s i n d am m a r t i n s 【l 叫等研究了p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ，p l e u r o t u so s t r e a t u s 开口坍p 地sv e r s i c o l o r 和a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s 对含有羧基或含有磺酸基的偶氮染料的降 解，结果表明zv e r s w o b r 降解能力最为突出，并且其对其它可生物降解的染料也有着不 错的降解能力。除黄孢原毛平格菌外，还有其它许多白腐真菌也具有降解的能力，它们包 括：t r a m e 把sv e r s i c o l o ，c o r i o l u sv e i s i c o l o 和f u n a l i at r o g i i 。 在白腐菌的酶系中，漆酶( l a c c a s e ，p b e n z e n e d i o l ：o x y g e no x i d o r e d u c t a s e m ，e c 1 1 0 f 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶，广泛地存在于植物和微生物体中。它能够催化d 哥口 p 联苯酚、多酚、木质素、氨基苯酚、多胺、芳基二胺等和特定的无机离子的氧化反应， 而且形成的自由基可以继续引发高聚物的解聚、重聚、脱甲基等反应| 1 1 1 。对许多结构不 同、高度稳定、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力，并且有着对污染物浓度要 求不高和降解彻底的特点和优势。 1 2 真菌漆酶的性质【_ 。2 】 近些年来，约有2 0 种不同来源的真菌漆酶得到提纯，并对其性质作了进一步的研究。 尽管这些蛋白的表观分子量有很大的差异，但组成漆酶的数种同功酶均具有以下共同点： 皆为糖蛋白；都为单体酶，酶分子中一般都含有4 个铜原子；适宜反应温度较低，酸性 p h 催化效率较高：具有广泛的底物专一陆。不同漆酶之间的作用范围不尽相同，涉及的 底物主要包括单酚、邻一苯二酚、对苯二酚、甲氧基酚、抗坏血酸、二胺化合物( 如苯二 胺、多巴胺等) 、醌类化合物( 如葸醌化合物) 等多种芳香族化合物。但是，酶的些性 质的局限性如氧化还原电位和p h 等妨碍了它的有效作用，因此有必要对酶的空问结构进 行适当的改造。x uf e n g | 1 3j 等利用定点诱变的方法对真菌m y c e l i o p h t o r at h e r m o p h i l a 和 r h i s o c t o n i as o l a n i s 漆酶i 型铜原子位点附近的氨基酸残基进行了突变，结果导致了性质 的显著变化：和野生型相比，两种菌漆酶活性的最适p h 分别拓宽了两个单位；氧化还原 电位稍有变化。究其原因，可能是突变导致结构微扰，从而影响了酶与底物的识别能力和 电子从底物传递到i 型铜原子中心。 2 1 3 漆酶脱色降解染料的研究 1 3 1 漆酶催化氧化作用的底物及机理1 1 2 1 3 1 1 底物 漆酶是单电子氧化还原酶，初步统计它催化氧化不同类型的底物可按结构归纳为六大 类：( 1 ) 酚及其衍生物：约占漆酶底物总数的一半，主要是邻、对本二酚等多元酚及其衍 生物i l 。漆酶不能催化氧化苯酚，却能催化氧化a 奈酚及某些元酚的衍生物【1 5 叫”，后 者的取代基多在酚羟基的邻、对位，随着取代基的种类、数目和在芳环位置的不同，反应 活性也有差异；( 2 ) 芳胺及其衍生物：其结构特点与酚类底物相似，主要是多氨基苯及其 衍生物；( 3 ) 羧酸及其衍生物：一般是指在芳香酸底物中，芳环羧基的邻、对位连有羟基、 烷氧基或氨基；在非芳香羧酸中，碳链上连有酚或芳胺类基团。( 4 ) 甾体激素和生物色素： 在有机溶剂和磷酸盐缓冲液中，真菌漆酶可催化氧化雌甾二醇、雌激素三醇等；漆树漆酶 催化氧化胆红素、苏木色精、茜素蓝s 等生物色烈9 】；( 5 ) 金属有机化合物：如二茂铁( f e h ) 及其衍生物f e r ( r = c h 2 0 h ，c o o 一，c i - 1 2 f e 等) 2 0 1 ；( 6 ) 其他非酚底物：除了早期发现 的亚铁氰化钾、抗坏血酸等外，近年来还发现了1 苯基一2 ( 3 ，4 一二甲氧基苯基) 己二醇 和吲哚的衍生物等”“。 1 3 1 2 漆酶催化氧化反应机理 漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型底物氧化反应机理主要表现在底物自由基 的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同作用。底物结合于酶活性中一t l , 的i 型c u 2 + 位点， 该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子，使之还原成水。整个反应 过程需要连续的单电子氧化作用来满足漆酶的充分还原，还原态的酶分予再通过四电子转 移传递给分子氧。在此过程中，氧还原很可能分两步进行，两个电子转移产生过氧化氢中 间体，该中间体在另外两单电子作用下被还原成水。例如：漆酶降解偶氮染料的机理见图 】1 2 1 1 。 1 3 2 漆酶对染料脱色降解的广谱性 研究表明，漆酶对染料具有极其广谱的脱色降解能力。从染料结构看，包括偶氮染料、 杂环染料、三苯甲烷染料、蒽醌染料、酞菁染料、靛族染料和硫化染料等【2 2 】。 r c a m p o s l 2 刈等人用提取自t r a m e t e sh i r s u t a 和s c l e r o t i u mr o 肟i i ( s r l i ) 的漆酶降解 靛蓝，可以将其降解为吲哚一2 ，3 一二酮，进一步降解为邻氨基苯甲酸。他们还发现用提取 自s r l l 的漆酶和乙酰基丁香酮共同作用，能将降解率最大提高3 0 。g r a c em b s o a r e s f 2 4 j 等人研究了用一种小分子氧化还原介质h b t 与漆酶一起作用来脱色降解蒽醌类染料 p b b r ，发现在5 0 下，作用3 0 r a i n 和6 0 m i n ，脱色率将分别达到4 8 矛1 17 2 ，作用1 2 0 m i n 后，将完全降解。e l i a sa b a d u l l a z 5 增将漆酶用a 1 2 0 3 固定化，发现漆酶经固定化后 其热稳定性增强，并且对一些酶抑制剂的耐受能力提高，用固定化酶处理葸醌类染料后， 其毒性降低了8 0 。g r a c em b s o a r e s l 2 6 】等人合成了。系列的双偶氮类染料，这一系列的 染料在苯环与偶氨基相连的对位都有羟基。他们研究了漆酶对这五种染料的降解，并且发 现小分子氧化还原介质紫尿酸对漆酶降解这一系列染料有促进作用。 强审寸+ 扩 b 辟刮b 分黾； 屯。 强一雷洲 图1 1漆酶降解偶氮染料的可能的机理 f i g 1 - 1 p o s s i b l em e c h a n i s mo f d e g r a d a t i o no f a z od y e sb yl a c c a s e 4 1 3 3 染料结构与漆酶降解性之间的关系及染料结构的修饰 科学家们在试验各种染料分子对漆酶降解的敏感性研究中观察到，染料的脱色降解效 果、氧化速度及降解程度依赖于染料的分子结构，尤其决定于其芳环上的取代基的类型。 p a s z c z y n s k i 和c r a w f o r d l 2 7 1 等注意到含有甲氧基，羟基和脲取代基的染料对酶的进攻更有 敏感性。e l i a s a b a d u l l a 2 口等在研究固定化漆酶降解蒽醌类染料时发现，初始的降解 速率取决于染料苯环上的取代基团的种类。g r a c em b s o a r e s l 2 6 1 等人在研究漆酶脱色降解 他们所合成的一系列双偶氮类染料时，发现，在苯环上含有羧基不利于漆酶对染料的降解， 他们认为染料分子中，在末端和中段的苯环上的结构将直接影响反应动力。这些发现，启 发科学家们将有目的的按计划地对染料进行结构改造与分子修饰作为提高染料降解可能 性、研究开发新一代染料分子的新途径。 1 4 固定化酶技术的研究状况 经过近四十年的研究和发展，固定化技术已取得了长足的进步，先后开发了多种固定 化方法和性能多样的载体材料，取得了丰硕的成果。但是由于酶分子从游离态变成牢固地 结合于载体的状态，酶分子所处的微环境发生了改变，也就带来了一系列新的问题：( 1 ) 酶 固定化过程中发生的物理化学变化会使酶的活性受损；( 2 ) 酶连接于固相载体上后，酶蛋 白的构型和活性中心都会发生改变而且载体骨架和侧链可能造成空间位阻，从而影响了 底物接近酶分子；( 3 ) 固定化颗粒的机械性能较差：( 4 ) 固定化颗粒成型困难1 2 8 i 。另外，在 工业化应用方面，真正投入工业化应用的固定化酶却不多，主要原因是固定化使用的试剂 和载体成本高；其次是由于固定化效率低，稳定性差，连续操作使用的设备比较复杂。目 前，人们正在进一步开发更简便、更适用的固定化方法以及性能更加优异的载体材料，以 期有更多的固定化酶技术取得工业规模的应用。 从当前的研究进展来看，固定化酶技术研究主要有以下几个方面的发展动向。 1 4 1 载体材料的研究 可用于固定化微生物的材料有很多，常用的载体材料包括有机载体、高分子载体和无 机载体等。其中常用于固定化酶的高分子载体材料一般可分为两大类：天然高分予材料和 人工合成高分子材料。选择高分子载体时应该认真考虑以下关键因素j ： ( 1 ) 载体材料的稳定性及生物相容性； ( 2 ) 载体材料可结合酶的最大能力； ( 3 ) 载体材料与底物的竞争力： ( 4 ) 在加工过程中，载体材料必须保持稳定，以防止酶的大量流失和酶活力的下降。 一些天然的高分子材料有着好的机械性能并且毒性小，它们常被用于酶和微生物的固 定。这类材料有2 9 】：矿物质和其它无机载体，如高岭土、皂土、多孔玻璃、氧化铝、纤 维素粉等；离子交换荆，如羧甲基纤维素、d e a e - - 葡萄糖等；蛋白质载体，如胶原蛋白， 其它还有海藻酸盐、k 一角叉菜、琼脂等。 合成高分子树脂材料可以经受住微生物、酸碱环境中化学物质的作用，有着出色的机 械性能，因而倍受人们的重视。其中，聚丙烯酸类树脂因理化性质稳定、毒性小以及结构 参数易控制等优点，成为人们最常用的固定化载体之一【3 0 1 。q hh y e o n gk w o n 3 1 l 等进行了 将牛动脉内壁细胞固定到多孔的异丙基丙烯酰胺接枝聚合物膜上的研究，固定后，细胞的 渗透性得到了提高。l j u b i s a n i k o l i e 等口2 用甲基丙烯酸酯和丙烯酰胺的预聚物乳液在溶胶 凝胶状态下交联共聚成大孔的聚合物，可作为固定化微生物的载体。乌云高娃 3 0 l 等选 用反应性单体甲基丙烯酸缩水甘油酯，以n ，n 亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，甲酰胺为致 孔剂，用反相悬浮聚合法制得一系列珠状共聚物载体，用以固定化青霉素酰化酶。王书香 7 7 1 等按适当比例将b p o 、丙烯酸甲酯、二乙烯苯、正庚烷、乙酸乙酯、质量分数2 0 的 n a c i 和质量分数0 5 的明胶水溶液加入到四颈瓶中，合成了一系列大孔丙烯酸甲酯一二 乙烯苯交联共聚物，经酰肼化、叠氮化后固定青霉素酰化酶，所得到的固定化酶酶活较高， 为9 5 u g 。 聚丙烯酸酯类树脂在酶的固定化方面的研究很活跃，从已报道的聚丙烯酸酯类树脂在 酶的固定化方面的研究，我们可以知道，聚丙烯酸酯类树脂有着许多天然高分子材料所不 能比拟的突出优点，它们机械性能优越，颗粒度、孔径、比表面积等参数都可根据应用要 求在合成时进行调控，可以适应不同的固定化要求，而且毒性相对其它人工合成的载体较 小，费用也较低。但是从目前的研究情况来看，将漆酶固定化于丙烯酸酯类载体上的研究 还有待进一步开展，特别是将其应用于处理印染废水的研究，所以我们研究探讨用于漆酶 固定化的丙烯酸酯类树脂载体是很有意义的。 近年来，人们根据水溶性大分子间可通过次级键合力，如氢键，静电力和疏水相互作 用等形成水不溶性大分子复合物沉淀的性质，研究了利用这种大分子复合物作为酶的载 体，得到沉淀一溶解性可调节的同定化酶。f u j i m u r a 等p 列利用甲基丙烯酸酯甲基丙烯 酸甲酯一甲基丙烯酸三元共聚物作为载体材料来固定水解蛋白酶。这种载体可通过调节体 系的p h 值改变其沉淀，溶解状态。共聚物组成不同，转变的临界p h 值也不n ( p m - - 4 ) j 。 但是通过改变体系p h 值的沉淀一溶解可调节载体的晦界p h 值往往不在中性范围内， 这对于一些p h 十分敏感的酶就不大适用，于是人们开始谋求合成通过其他条件来改变沉 淀一溶解状态的载体材料。h o m n a l l n 删等用n 一异丙基丙烯酰胺共聚得到热可塑性凝胶 载体。通过载体上的琥珀酰亚胺活性酯将冬酰胺酶固定于该载体上，利用温度的变化可调 节固定化酶的膨胀与聚沉。这种载体被称为温度敏感性载体。 1 4 2 固定化方法的研究 1 4 2 1 常用固定化方法 一般来说，传统的微生物固定化方法有吸附法，包埋法，共价结合法和交联法等几种， 其优缺点比较见表1 1 。 吸附法和包埋法是研究中常用的方法，荚荣【3 6 1 等用海藻酸钙凝胶包埋法固定化白腐真 菌对多种染料进行脱色研究，结果表明，固定化菌不仅提高其脱色能力，而且在p h 值和 染料浓度变化的情况下，仍保持稳定的脱色率。 9 0 年代初期有人提出了用包络法固定微生物的新技术，其以人工合成的生物相容性 好的聚丙烯酸酯共聚物基体型多孔颗粒为载体，郑邦乾 ” 等用悬浮共聚随后碱解的方法 制得了部分水解聚( 丙烯酸甲酯一醋酸乙烯酯一甲基丙烯酸甲酯) 多孔载体，在静态化实 验中发现，该载体固定化微生物效果良好。共价结合法和交联法固定的微生物结合强度好， 稳定性高耐反应环境的变化能力强，但微生物活性有较大的损失。t b a h a r 年da t u n c e l 表1 - 1 几种固定化方法的比较 ! 垫：! ：! 兰! 翌2 型! ! 翌! ! 罂! 生! 生! ! ! ! 呈1 2 里! ! 翌翌! 竖! ! ! 塑! 呈 方法基本原理优点缺点 用对氯甲基苯乙烯作为聚合单体，p e i 作为聚合配体，戊二醛作为交联酶的激活剂在 平均颗粒度达到1 8 6 u m 的乳液中进行悬浮聚合，合成一种珠状聚合物作为固定b 呋喃 果糖苷酶的载体p 。 上述固定化方法中，交联法有着其突出的优点。借助功能试剂或载体上的功能性集团 使酶分子与载体分子之间发生交联作用而制成固定化酶的方法，称为交联法。交联法亦称 架桥法，游离酶的氨基酸残基与双官能团或多功能团交联剂反应而被固定化可得酶蛋白单 位浓度较高的固定化酶。用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时间使用，稳定性高耐 反应环境的变化能力强。但是，由于交联反应较激烈，酶活力较易损失，所以在一定程度 上限制了其应用。但囡其有着其它固定化方法所不可比拟的优点，只要解决提高固定化后 酶的活性的问题，其将有着很高的理论研究和实际应用价值。故我们在本实验中在采用传 统固定化方法的同时，研究交联法是很有意义的。 保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。 1 4 2 2 新型固定化方法 人们在对传统的固定化方法进行改进的同时，也在积极探索新的固定化方法。运用当 代高新技术设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。利用接枝共聚 法，磁化法，等离子体聚合法制得的载体和低温等离子体处理进行改性的载体，也能很好 地改善所得固定化酶的活性和稳定性。 利用超声波使高分子主链均裂产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体固 定化酶的结果表明口9 1 ，借助现代技术可使一般性聚合物经功能化改性成为新的酶固定化 载体。磁性体f e 3 0 4 与聚苯乙烯、含醛基聚合物一起溶解混合后，再除去溶齐n 可获得磁性 载体，其固定化葡萄糖氧化酶在适宜条件下的酶活力回收可高达7 0 1 4 0 。导电聚合物 ( c o n d u c t i n gp o l y m e r s ) 是固定酶的另一种新型载体材料，它具有重量轻，以及易于表面涂 7 覆的特性，而在导电性能方面则具有半导体、金属乃至超导体等优良特性，导电聚合物作 为酶固定化载体时特别有利于酶电极类生物传感器的制各h ”。近年来国内外许多研究人 员还利用等离子体技术对一些力学强度较好，但缺少活性基团( 如羟基、羧基、羰基、氨 基等官能团) 的材料进行处理，以得到更好的新型固定化酶载体。等离子体活化处理聚 丙烯膜接枝丙烯酸后可用于固定化胰蛋白酶m4 3 1 。 1 4 3 固定化酶的应用 随着酶固定化技术的发展，固定化酶的应用范围不断扩大。目前它已应用于化学及化工 领域、环境废水处理、食品、临床医药、生物传感器等方面。 1 固定化酶在化学及化工领域中的应用研究 水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的酶促合成，如硅藻土固定化木瓜蛋白酶 可在乙酸乙酯介质中催化合成l e u - 脑啡肽前体b o c p h e 1 e u o m e 、产率高达9 0 以上；固 定化嗜热菌蛋白酶可高产率及专一性催化合成高甜度低热量的二肽甜味剂a s p a r t a m e 的 前体z 1 _ a s p l p h e o m e 、并可同时实现天冬甜精的生物合成与d l 苯丙氨酸甲酯的光学 拆分【4 4 】。 2 固定化酶在环境科学中的应用 随着环境污染的日趋严重及其治理的日益迫切，固定化酶在环境科学领域将具有重要 用途，固定化漆酶对酚类化合物具有特异性催化功能，可用于废水中酚类物质的检测及除 去，已引起环境科学界的高度重视，这是一个值得注意的固定化酶应用领域。美国 h 。m c h a n g 发明的m y c o r 工艺将白腐菌p c h r y s o _ s p o r i u m 固定在旋转生物转盘上，使之 形成一层生物膜，利用其分泌m y c o r 工艺的酶系降解废水成分1 4 ”。s a m m a i a hp a l l e r l a 4 6 1 等人研究利用聚氨酯固定t v e r s i c o l o r 于流化床反应器系统对硫酸盐浆漂白废水脱色和脱 氯间歇处理每天脱色7 2 。连续处理，水力停留时间2 4 h 脱色率( 6 9 土5 ) ，连续处理 最长时间为3 2 d 。我国福建师范大学的马秀玲等1 47 j 对磁性固定化酶处理含酚废水的研究表 明：对于酚浓度为1 0 0 m l 的废水，磁性c s m ( 壳聚糖微球) 固定化酶( 辣根过氧化物 酶) 的降解率为9 2 8 。 废水处理中，由于废水组分复杂而且经常变化，利用单一的固定化酶，很难收到好的 处理效果。人们还在研究用多种单一的固定化酶组合处理，使有机物完全无机化和稳定化。 3 固定化酶在临床医药及生物传感器方面的应用1 4 8 - 5 2 】 壳聚糖固定化胰蛋白酶制各具有多种药用价值的高比活抑肽酶已显示出工业化应用 前景，微囊固定化过氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性，将在临床检测及卫生防疫方面 具有广泛用途。药用酶可通过固定化提高稳定性及缓释性、并可除去免疫原性，甚至葡聚 糖磁性毫微粒固定化l 一天冬酰胺酶具有通过血液注射治疗急性淋巴白虹病的医用前景。 这些研究将为现代医学的发展提供强有力支持。酶固定化技术的发展使生物传感器应运而 生，如利用活蚕液状丝素蛋白的变性作用制备的葡萄糖氧化酶传感器具有酶活性损