（发酵工程专业论文）葡萄及葡萄酒中有机酸和挥发性硫化物的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 利用高效液相色谱法( h p l c ) 测定葡萄酒中有机酸。通过对色谱分离条 件进行综合试验，选出了最佳色谱分离条件：流动相为用高氯酸调p h 为2 5 的0 7 譬；? = 流速0 6 m l m i n ，柱温5 5 ，检测波长2 1 0 n m ，进样量1 0 “l 。 通过酒样测试，各组分的相对标准偏差为1 8 4 5 ，回收率为 9 4 5 1 0 3 1 ，方法的准确性可以得到保证。 对长城和王朝葡萄酿酒公司的1 5 种原酒进行了1 0 0 0 0 转分钟高速离心 预处理后，利用高效液相色谱法( h p l c ) 测定其中有机酸。结果表明：葡萄 酒中主要有机酸成分是酒石酸、l 一苹果酸和l 一乳酸，柠檬酸、琥珀酸和乙酸 的含量很少；干白酒中几乎不含有l 一乳酸；干红酒中含有l 一乳酸，但l 一苹果 酸和柠檬酸含量相应减少，甚至为0 ：在所测酒样中，长城原酒中的总酸含量 比王朝原酒中的高，主要是酒石酸的含量高。 最后将2 0 0 3 年份，沙城、蓟县、汉沽、昌黎四个葡萄产地，不同葡萄品 种，生长过程中各种有机酸的变化进行了测定比较，结果为：葡萄在成熟过 程中各种有机酸含量的变化为：柠檬酸在葡萄中的含量很小，小于o 4 9 l ， 且在葡萄成熟过程中含量变化不大。葡萄中的酒石酸和l 苹果酸含量在葡萄 成熟过程中逐渐降低，其中l 苹果酸降低的趋势比酒石酸要大。 通过对ci ，c i i ，wi 和w i i 四株葡萄酿酒酵母性能的综合试验，选择 酵母菌ci 作为低产硫化氢，高产谷胱甘肽优良酵母诱变选育的出发菌株。 对出发菌株ci 进行紫外诱变后，通过醋酸铅显色平板，和分别以n a 2 s 和n a 2 s 0 3 为唯一硫源的两种鉴别平板，筛选出了一株低产h 2 s 的优良突变株 s 9 ：s 9 的基本发酵性能与出发菌株ci 相差不大，但h 2 s 的生成量比ci 降 低了4 0 0 。 使用e m s 对s 9 进行诱变，通过蛋氨酸抗性平板，筛选出了一株高产谷 胱甘肽的优良突变株m 6 ；m 6 的基本发酵性能与出发菌株s 9 相差不大，但 g s h 的生成量比s 9 提高了4 7 7 ，同时h 2 s 的生成量再次降低了3 0 o 。 m 6 与ci 相比，基本发酵性能相差不大，但h 2 s 生成量降低了4 6 1 ， g s h 的生成量提高了3 9 8 。突变株m 6 达到了预计的高产g s h ，低产h 2 s 目的，可以应用于葡萄酒生产，从而改善葡萄酒的风味。 关2 ：，= 萄酒；有机酸：高效液相色谱法；葡萄酒酵母；诱变；蛋氨酸 h 2 s ；谷胱甘肽 摘要 a b s t r a c t a nh p l cm e t h o dw a se m p l o y e dt od e t e r m i n e o r g a n i ca c i di nw i n e b y g e n e r a l t e s t so n c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i n gc o n d i t i o n s ，t h eo p t i m a l c h r o m a t o 乒a p h i cs e p a r a t i n gc o n d i t i o nw a se s t a b l i s h e d ：m o b i l ep h a s ew a sh c l 0 4 s o l u t i o no fp h2 5 ，m o b i l er a t ew a so 6 m l m i n ，c o l u m nt e m p e r a t u r ew a s5 5 。c ， d e t e c t i n gw a v e l e n g t hw a s2 1 0 n m ，i n j e c t i n gv o l u m ew a s1 0 1 2l s e v e r a lk i n d so f o r i g i n a l w i n e w e r e a n a l y z e d t h e r e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o - r ：“：4 f r o m1 8 t o4 5 ，a n dt h er e c o v e r yr a t e sw e r ef r o m9 4 5 t o 1 0 3 1 t h ea c c u r a c yo f t h i sm e t h o dw a s p r o v e d a f t e r b e i n gp r e t r e a t e db yc e n t r i f u g a l i z i n ga tah i g hs p e e d10 0 0 0r o t a t i o n m i n ， 15k i n d so fo r i g i n a lw i n ef r o mt h eg r e a tw a l la n d d y n a s t yw i n eb r e w i n g c o m p a n yw e _ r ed e t e r m i n e df o ro r g a n i ca c i db yh p l c r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e m o s tc o m p o n e n to f o r g a n i ca c i di nw i n ew a st a r t a r i c ，l m a l i ca n dl l a c t i ca c i d a n dt h ec o n t e n t so fc i t r i c ，s u c c i n i ca n da c e t i ca c i dw a sv e r yl i t t l e ；t h e r ew a s s e l d o ml 1 a c t i ci nd r yw h i t ew i n e ；t h e r ew a sl l a c t i ci nd r yr e dw i n e b u t * h e c o n t e n t so fl m a l i ca n dc i t r i cd e c r e a s er e l e v a n t l y , e v e nt o z e r o ；o fa l ls a m p l e s d e t e r m i n e d ，t h ec o n t e n t so ft o t a la c i di nt h eg r e a tw a l lo r i g i n a lw i n ew a sh i g h e r t h a nt l l a ti nd y n a s t yo r i g i n a lw i n e m a i n l yo nt a r t a r i ca c i d f i n a l l y , s e v e r a ls o r t so fo r g a n i ca c i di nd i f f e r e n tg r a p e sw e r ed e t e r m i n e d d u r i n gt h eg r a p e sg r o w i n gf r o ms h a c h e n g ，j i x i a n ，h a n g ua n dc h a n g l ii n2 0 0 3 r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n tv a r i e t yo fs e v e r a lo r g a n i ca c i d si ng r a p e sd u r i n g t h e i rm ”。：二! st h a tt h ec o n t e n t so fc i t r i cw a s v e r yl i t t l ei ng r a p e s ，l e s st h a n 0 4 班，a n d t h ec o n t e n tv a r i e dl i t t i e d u r i n gg r a p e sm a t u r i n g t h e c o n t e n t so f t a r t a r i ca n dl m a l i cd e c r e a s e dg r a d u a l l yd u r i n gg r a p em a t u r e s l m a l i cd e c r e a s e d m o f e q u i c k t h a nt a r t a r i c w i n ey e a s t sc i ，ci i ，wi ，w1 1w e r ea p p l i e df o rt e s t s ，a f t e rc o m p a r i n g t h e i rf e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s ，ciw a ss e l e c t e d a st h e p a r e n t s t r a i nf o r m u t a t i o nt oo b t a i naf i n ew i n e y e a s t w h i c h p r o d u c e d l o wh 2 sa n d h i g h g l u t a * h i o n e a f t e rt r e a t i n gt h ep a r e n ts t r a i nci b yu v a c e t a t em e d i a p l a t e sa n dd i f f e r e f i t d i f f e r e n t i a lm e d i u m p l a t e sc o n t a i n i n gn a 2 sa n dn a 2 s 0 3a st h eo n l ys u l f u rs o u r c e s w e r eu s e da sp r i m a r y s c r e e n i n gp l a t e s ，af i n em u t a n ts 9w h i c hp r o d u c e dl o wh 2 s w a sg o t t e n s 9d i f f e r e dl i t t l ef r o mci i nb a s i cf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s b u t 天津科技大学顾士学位论文 t h e p r o d u c t i o no f h 2 s d e c r e a s e db y4 0 o a f t e rt r e a t i n gs 9u s i n ge m s af i n em u t a n tm 6w a so b t a i n e dr e c u r r i n gt o a n t i m e t h i o n i n em e d i u mp l a t e s m 6d i f f e r e d1 i l l l ef r o ms 9i nb a s i cf e m a e n t m i o n c h a r a c t e r i s t i c s ，b u tt h ep r o d u c t i o no fg s h i n c r e a s e db y4 7 7 ，a n dt h ep r o d u c t i o n o f h z sd e c r e a s e db y3 0 o a g a i n f i n a l l y , 恤em u t a n tm 6w a sc o m p a r e dt o t h ep a r e n ts t r a i nci t h eb a s i c f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h et w os t r a i n sd i f f e r e dl i t t l e ，b u tt h ep r o d u c t i o no f h 2 so f m 6 d e c r e a s e db y4 6 1 t h a nci ，a n dt h ep r o d u c t i o no f g s hi n c r e a s e db y 3 9 8 ，s y n c h r o n o u s l y t h em u t a n tm 6 w a s j u s tt h es t r a i nw h i c hp r o d u c e e dl o w h 2 sa n dh i g hg l u t a t h i o n ew ew a n t e d i tc a nb eu s e df o rw i n ep r o d u c i n g ，a n d i m p r o v e d t h ef l a v o ro f w i n ea c c o r d i n g l y k e yw o r d s ：w i n e ；o r g a n i ca c i d ；h p l c ：w i n ey e a s t ；m u t m i o n ；m e t h i o n i n e h 2 s ；g l u t a t h i o n e 3 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 葡萄酒的营养价值和保健作用 葡萄滔是一种滋味美好的饮料，并且具有很高的营养价值和保健作用。 饮用葡萄酒，对健康有益。据测定，1 升葡萄酒含有2 5 1 0 4 1 8 4 焦的热量； 葡萄酒中的酒精在人体内产生的热量9 5 是可用的。葡萄本身就是一种营养 价值很高的水果，酿成葡萄酒后仍含有丰富的营养物质。现在已知葡萄酒中 大约含有6 0 0 种对人体有益的成份，其营养价值得到充分肯定。 葡萄酒中含有糖类、果胶质、醇类、有机酸、无机物质、微量元素和几 十种氨基酸和多种维生素。这些物质直接或间接地对人体有不同的益处，其 中有许多对人体有益的物质是其它食品中所没有的。所含果胶质、粘液质和 各种有机酸，矿物质都与人体代谢密切相关。葡萄酒不仅含有多种维生素f 其 中维生素b 2 含量比鲜牛奶高一倍以上) ，同时还含有人体必需的极为重要的 1 3 种微量元素( 钙、镁、磷、钠、钾、氯、硫、铁、铜、铝、锌、碘和钴) ；葡 萄酒中的葡萄糖、果糖和多种氨基酸，能直接被人体吸收。 葡萄酒中还含有刺激嗅觉神经和味蕾的醋酸、单宁酸等物质，可增进食 欲，增强体质：而其中的一些元素还能防止人体内某些病菌的繁殖。所以在 国外，葡萄酒是食用海味、生吃蔬菜时不可缺少的饮料。 葡萄酒可以帮助消化并促进新陈代谢。吃饭时饮用葡萄酒可以提高胃酸 含量，促进人体对食物中钙、镁、锌等矿物质的吸收。葡萄酒含酚，具有抗 氧化剂的作用，防治退化性疾病，如老化、白内障、免疫障碍和某些癌症。 本草纲目中早就明确指出：葡萄酒具有暖腰肾、驻颜色、御寒的主治作用。 晟近两年英法等国的科学家研究指出，葡萄酒中含有白藜芦醇，能起到 软化血管，促进血液循环，治疗心脑血管病症之功效。葡萄酒具有优美的风 味与色泽，酒精含量低，适量饮用可促进血液循环，缓解疲劳，增进食欲， 防止人体衰老，延年益寿，是全世界人们青睐的绿色食品，不属保健食品的 保健食品。 1 2 国内外葡萄及葡萄酒中有机酸研究状况 1 2 1 葡萄酒中的主要有机酸 使葡萄酒具有酸性特征的有机酸类是葡萄酒组分的主要单位，它与酒的 品质高低具有密切的关系。有机酸类的性质及其浓度，调节着“酸碱的平衡7 7 必然要影响葡萄酒的酸味，进而影响葡萄酒的风味。葡萄酒中的有机酸主要包 括“= r 黧、苹果酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸等。 ( 1 ) 酒石酸 刚舌 酒石酸是葡萄及葡萄酒所含有的特定有机酸。在自然界，除了葡萄植株 以外，很少找得到这种酸，所以又称葡萄酸。酒石酸是葡萄酒有机酸中最重 要的酸种。它是酸性最强、最容易离解、最能增加氢离子浓度的有机酸( 对 比于相同浓度条件下各种有机酸) 。葡萄酒的p h 大部分取决于酒石酸的含量。 酒石酸是抵抗细菌性分解作用最强的酸。在发酵过程中，由于酒中酒石酸钾 ( 即酒石酸氢钾，亦即酸性酒石酸钾) 的沉淀，而减少了酒内有关酒石酸的 浓度。葡萄酒感受了冷的作用。也会有酒石酸沉淀出来，也减少了酒内可溶 性酒石酸的浓度。至于中性酒石酸钙也会从酒中慢慢地沉淀出来，同样使酒 降低酒石酸的浓度。 有时，酒石酸可能偶尔遭受某些乳酸细菌的侵蚀，经过分解而形成乳酸， 同时增加了捶发酸度。这就是葡萄滔的“泛浑病”。当葡萄原料的酸度显得太 低时，可以人工添加某些酒石酸，这是有用的，也是许可的。如果酒中含有 酒石酸略嫌太高时，就使酒味变为粗硬，带有涩敛，因而降低葡萄酒的品质。 名产红葡萄酒或白葡萄酒一般品质较高，含酒石酸较少。 在葡萄的成熟过程中，如碰到干旱季节，酒会降低酒石酸的含量，特别 是在葡萄成熟很好的年景中，酒石酸会被葡萄果实含有的呼吸性酶所消耗； 如果碰到阴雨季节，就会增多葡萄果实中酒石酸的含量。此外，依照每年的 气候条件，葡萄植株会自行合成或多或少的酒石酸。有些酿酒年份，甚至以 含有较多的酒石酸为特征。 葡萄果实所含酒石酸为酒石酸的右旋型异构体。 葡萄逐渐成熟，其酒石酸含量逐渐减少，例如生葡萄含酒石酸1 5 9 l ，成 熟葡萄则降低为7 5 9 l ，这是新陈代谢的燃烧作用引起酒石酸浓度稀释的结 果。将成熟葡萄汁进行酒精发酵，其发酵醪所含酒石酸会变成沉淀而使酒石 酸浓度降低。主体发酵完毕，在后发酵期过冬，酒石酸大量沉淀出来。陈酒 中含有酒石酪的浓度，一般为2 5 4 9 l 。等到葡萄酒完成贮存老熟过程时，就 是酸继续略有减少，一般减少到1 5 2 5 l 。如果发生泛浑病，酒石酸必然会 从酒中沉淀出来。 ( 2 ) 苹果酸 苹果酸是植物界普遍存在的一种有机酸，也是葡萄果实中自然形成三种 有机酸之一( 酒石酸、苹果酸、柠檬酸) 。 葡萄果实原有苹果酸减少的原因是多方面的。在果粒成熟过程中，由细 胞呼吸作用引起的氧化分解或消失：在酒精发酵过程中由酵母引起的消失影 响；在葡萄酒产生乳酸发酵过程中由细菌引起的消失影响。所以分析葡萄粒、 葡萄汁、发酵醪及葡萄酒的苹果酸含量是一项重要的化验工作。它可以帮助 判断葡萄果粒的成熟情况，成品酒质的优劣情况。例如，当夏季变为寒冷的 灭津科技大学硕士学位论文 某些年份。所产葡萄酒的酸性口味，幼年葡萄漕的酸涩特征，都是苹果酸所 引起的结果。 丛生绿葡萄直到远年陈酒，经过各个成熟阶段，以及酒精发酵阶段、苹 果酸乳酸发酵阶段，原来的苹果酸含量要遭遇到一系列的减退或消失，如果 葡萄酒未经亚硫酸处理，那就可以减退到几乎等于零。 通过“苹果酸乳酸发酵作用”，可使葡萄酒减少酸味，脱去酸分，这是一 个普通的现象。这样，就可使幼年葡萄酒的口味变为绵软。这是名产红葡萄 酒发生老熟作用的基本事实，无疑是重要的。它使葡萄酒的含酸量与其它组 分的比例关系完全翻乱，它也使葡萄酒芳香性能发生变化，成色强度略为减 退并变更色调。 有入说，没有苹果酸乳酸发酵作用，就几乎不容易制得法国波尔多地区 的名产红葡萄酒。证明这个普遍现象倒具有重要效果。这种发酵作用的变化 方程式如下： c o o h c h o h c h 2 c o o h = c h s c h o h c o o h + c o z 苹果酸乳酸二氧化碳 二氧化碳逸散之后，滴定酸度就会降低，如以毫克当量升表示，将减少 苹果酸含量的一半。 在某种情况下，苹果酸乳酸发酵作用对于通常消费的葡萄酒来说，曾经 看成是一种有害的现象。但根据最近葡萄酒科学的研究结果，认为经过这种 与苹果酸有关的发酵之后，也会使酒质变为绵软，因而得到消费者的欢迎。 至少两年酒龄的红葡萄酒，含有苹果酸常小于2 0 0 m g l ，含有游离亚硫 酸以保证无菌性的甜白葡萄酒( 例如法国波尔多地区的甜白葡萄酒) 可能每 升含有苹果酸达到数克。中等成熟年景所收获的葡萄，在酿成葡萄酒后，往往含 有较多的苹果酸。 天然的苹果酸是左旋异构体。这是许多水果的主要酸种。水果没有成熟， 即成熟度愈生，苹果酸就愈多。水果逐渐成熟，苹果酸就逐渐减少。这是出 葡萄果实在成熟的过程中受到细胞呼吸作用所引起的减少现象。例如生葡萄 含苹果酸1 5 2 5 9 l ，到成熟时，就降低到2 - 4 9 l 。酒精发酵作用也可减少苹 果酚的含嚣，例如从2 - 4 e j l 减少到1 5 - 3 9 l 。 继续进行后发酵，就会伴生着“苹果酸乳酸发酵作用”发酵醪含有苹果 酸的浓度，因葡萄酒的品种而变化。经过硫熏的白葡萄酒，一般可以停留在 1 5 - 3 l 的水平上。红葡萄酒因为没有受到硫熏处理，所以苹果酸受到“苹果 酸乳酸发酵作用”而急剧消失。 葡萄酒如果受细菌的作用，产生“乳酸发酵作用”，将改变苹果酸的含量。 某些酿酒年景，由于夏季比较寒冷，收获的葡萄做成酒后，就表现生果 酸味，这是幼年葡萄酒的“生酸味特征”，这是苹果酸引起的口味。 日u 舌 所以测定苹果酸，对葡萄酿酒说来，是重要的。首先可以用来说明葡萄 的成熟程度，其次，在很大范围内，可以说明葡萄酒的品质。 ( 3 ) 柠檬酸 柠檬酸是葡萄酒的一种f 常组分。 任1 口j 匍询但株，栽培的也好，野生的也好，欧洲种也好，美洲种也好， 远东种也好，杂交种也好，都含有柠檬酸。不论生青葡萄或者成熟葡萄，也 都含有柠檬酸。 由贵腐病葡萄或局部烘干葡萄所得浓缩葡萄汁，亦含有多量的柠檬酸。 腐烂葡萄或虫伤葡萄往往含有最多量的柠檬酸。根据法国贝努氏的实验观测， 证明纯粹的酒精发酵作用也经常形成小量的柠檬酸，其含量可达 1 0 0 1 5 0 m g l 。 葡萄酒中柠檬酸的含量变化很大，相差1 倍到1 0 倍。红葡萄酒含有的柠 檬酸往往少于白葡萄酒的含量，这是因为在事实上当细菌使红葡萄酒发生“苹 果酸乳酸发酵作用”的同时，会平行地消耗现存的柠檬酸，消耗率几乎达到 全部柠檬酸含量的程度，而消耗后使其主要的变为挥发酸类，不再有柠檬酸 存在。许多乳酸菌可以发酵柠檬酸，使其变成醋酸。 柠檬酸具有最大程度的化学性能，可使高铁变为可溶性的络合物，存在 于阴离子状念在处理葡萄酒的“铁性破裂”时，般利用柠檬酸处理法，例 如每升匍铡吲舢柠檬酸1 0 0 m g ，往往足以阻止铁性破裂现象的产生。 在葡萄酒中添加柠檬酸是得到国际公认的，这是唯一许可外加的酸种： 其最高的剂量为l g l ，一般可以用到5 0 9 i o o l ，或相当于5 0 0 m g l 。 但是，在红葡萄酒中添加柠檬酸，使其防止铁性破裂或增加固定酸度， 对于此，应该提出保留意见。这是因为柠檬酸加在红葡萄酒中不易得到稳定 性，反而有可能被乳酸细菌所利用，增加了挥发酸度的含量。葡萄酒如果含 有较多的柠檬酸，例如大于5 0 0 m g l ，对于这种情况，很难断定它是否人工 加进去的，也不能根据柠檬酸的规定量来作为葡萄酒进出口的指标，因为法 国波尔多地区所生产的某几种骚多恩葡萄酒，天然含有柠檬酸0 8 1 9 l 。 利用柠檬酸来增加葡萄酒的固定酸度和改善葡萄酒的酸度，尤其是干白 葡萄酒的酸味，这是通行的做法。 ( 4 ) 乳酸 在酒精发酵过程中，葡萄汁变成葡萄酒，同时形成乳酸，这是普通现象， 但为量牧少：j8 0 4 0 0 m g l 。 除一个例外不算，全部酵母都具有发酵能力，生成右旋性乳酸，只有痕 迹量的左旋性乳酸。例如，对于酿酒酵母生成的左旋性乳酸经常小于总乳酸 4 天津科技大学硕士学位论文 量的1 0 ，发酵条件对生成总的乳酸有影响，但不会改变上述两个乳酸异构 体的比例关系。 凡是没有遭受细菌作用的葡萄酒，一般含有乳酸较少，不含超过 5 0 0 6 0 0 m g , l ，其中右旋性异构体约占6 0 9 0 。但是，情况就相反，在乳酸 来自“苹果酸乳酸发酵”的葡萄酒中，乳酸含量就较多，而且大部分为左旋 性异构体，约含乳酸总量的7 5 。 “苹果酸乳酸发酵”引起的变化，都生成左旋性乳酸；而六碳糖的乳酸 发酵( 来自异型发酵球菌) 则引导形成右旋性乳酸；也有这样两种异构体混 合在一起的，可由其它细菌来完成。 筒鱼来说，一个天然培养基，例如葡萄酒，经过纯粹的酒精发酵作用， 发酵醪内主要含有右旋性乳酸。此外，当还原糖受到细菌的侵袭作用时，例 如发生“乳酸性酸败病”，那么，乳酸的构型如何? 要看细菌的菌种为如何而 定，或为右旋，或为左旋，或为两者混合在一起。但右旋性乳酸的比率常常 是增加的。有人建议，在酸类含量太少的葡萄酒中，人工添加乳酸以增加酒 的酸度，这是合情合理的措施。当然，所用乳酸的质量，应该是食品级的。 乳酸是一个稳定的酸种，酸性相当强，其p k 为3 - 8 1 ，但乳酸的酸味较弱， 或者说，只能产生弱酸性口味。 ( 5 ) 琥珀酸 葡萄酒含有琥珀酸1 0 2 5 毫克当量l ，或相当于约o 6 1 5 9 l 。 琥珀酸主要来自糖分子的发酵作用，是酒精发酵的一种正常副产物。其 极少量则来自葡萄汁所含谷氨酸的变化。 瑞士1 9 6 4 年文献报道，在酒精发酵过程中，每生成1 0 0 9 酒精，可同时 形成1 乏a - - 6 4 0 m g 的琥珀酸。所以瑞士葡萄酒所含琥珀酸，要小于1 9 l 。意 大利葡萄酒测得琥珀酸o 5 1 1 8 9 l 。 琥珀酸在葡萄酒中是比较稳定的，可溶于水及酒精；能抵抗细菌性发酵 的破坏作用。琥珀酸的口味很复杂，既酸又苦，能参加酒昧的形成，这是葡 萄酒所含有机酸类中最富于味觉反应的一种酸。 另外，葡萄酒中还含有微量的葡萄糖酸、乙酸、草酸、抗坏血酸、糖醛 酸、半乳糖二酸、葡萄糖酮酸、柠檬苹果酸( 2 甲基苹果酸) 等，因为这些 酸含量微小，对葡萄酒口味的影响甚小，在此就不一一介绍。 1 2 2 葡萄成熟过程中有机酸的变化 葡萄在生长成熟过程中，总酸度呈逐渐下降的趋势。总固定酸的降低， 尤其在较暖地区的葡萄中，部分是由于这些酸类被葡萄呼吸代谢的结果，高 温可以促进这些代谢作用。l ( + ) 一酒石酸是葡萄中的主要酸，它对这种呼吸代 1 前言 谢作用有抗性，而含量位于第二位的l ( 一) 一苹果酸役有这种抗性。因此在较暖 的种植区中，一个给定品种的葡萄中酒石酸与苹果酸的比例随着成熟度的升 高而增大。但是，如果在温暖地区的收获过早，或是在较冷地区正常的收获 时刻，这种差别可能不存在。在正常温暖区的葡萄园中如果在收获期没有一 段较热天气的出现，或在较冷地区有一段较热天气的出现，葡萄成份在这个 方面可能呈现意外的差别。 酸度降低的另一个恒定不变的原因是果粒的长大。在成熟阶段开始前， 青果粒中的滴定酸度约为3 0 9 k g 。如果果粒增重1 倍而酸类不进一步合成， 酸浓度将降低至1 5 9 k g 。事实上，在一个系列的8 个品种中，在葡萄被认为 是完全成熟时，鲜果中以酒石酸计算的可滴定酸度只有3 7 7 7 9 k g 。在酒石 酸与苹果酸的比例中，早期酒石酸的比例较大，而在成熟的开始和初期阶段 随着苹果酸的上升而下降，然后在成熟期的最后阶段这个比例又重新上升。 虽然这是一种总模式，但是各品种的差距很大。较好符合这一模式的含酸品 种，在较罹的气候中，可能丧失几乎所有的| 节果酸而保留酒石酸( 例如翡翠 雷司令品种) ，或几乎等量地保留两种酸( 例如鸽笼白品种) 2 1 。含苹果酸量 高的品种，例如白玉霓或玛尔拜克( m a l b e c ) ，在较热地区的葡萄园中特别容易 变得口味平淡。这种关系对于酿酒者是很重要的，因为它与苹果酸乳酸发酵 及酒石酸的稳定性有关。其他存在的酸有柠檬酸和抗坏血酸，但是只在总酸 中占较小的比例，一般低于总酸的1 0 。 在成熟过程中，滴定酸度下降的第三个原因是，葡萄根能逆着浓度梯度 吸收一些阳离子，值得注意的是钾离子。葡萄根和植物细胞一般能通过需要 耗能的膜输送途径分泌质子，而将阳离子吸收到细胞内。在果粒成熟过程中， 随着钾离子浓度的升高，葡萄根或有关细胞内的p h 值也随着矿物质含量和这 些矿物质碱度的升高而升高。酒石酸和其他酸的一部分就这样被中和掉了， 其中有很大一部分是在成熟过程中被中和的。如同其他水果一样，葡萄和葡 萄酒中的钠的含量较低而钾的含量较高。酒石酸氢钾在酒中的低溶解度会导 致酒石沉淀，这需要用化学澄清方法来永久地消除这些沉淀【3 j 。 1 2 - 3 有机酸的分析进展 由于有机酸在葡萄酒中的重要性质，所以有机酸的检测是十分重要而且 必要的。总滴定酸和总挥发性酸的测定，通常是采用氢氧化钠滴定法。总滴 定酸通常是以酒石酸计量的，或是以硫酸计量的：挥发性酸是以醋酸计量的。 各种单一有机酸的检测方法有很多种，包括化学分析法、离子交换树脂分离 法、薄层色谱法和纸色谱法。但是这些方法样品处理复杂、分析时间长、准 确度低、重现性差。近年来，测定葡萄酒中有机酸最为成熟的技术就是h p l c 技术。h p l c 分析有机酸不仅简便快速，而且选择性好、准确度高。它的分 天津科技大学硕士学位论文 离模式与检测方法多种多样，可以根据样品的构成与性质来选择合适的色谱 条件f ”。 1 2 4国内葡萄及葡萄酒有机酸研究状况 在国内，各地葡萄酒生产厂家为了测定葡萄的成熟度，选择葡萄收摘日 期，控制葡萄和葡萄酒的质量，会对本地葡萄中的总糖和总酸进行测定：但 关于不同地区葡萄在生长成熟过程中各种有机酸的变化，至今未见报道。为 了弥补此处不足，本课题将对2 0 0 3 年份，中国的沙城、蓟县、汉沽、昌黎四 个产区的不同品种的葡萄进行实验，采用高效液相法，测定其生长过程中各 种有机酸的变化，进行综合分析，比较不同产区的优劣。 1 2 5 关于葡萄及葡萄酒中有机酸的研究内容 ( 1 )选择高效液相色谱法测定葡萄及葡萄酒中的有机酸，建立六种有机酸 的最佳色谱分离条件。 ( 2 )用外标法进行有机酸的定性和定量，绘制有机酸定量的标准曲线。 ( 3 ) 用不同的方法对酒样进行处理，选择酒样进入液相前最佳的处理方法。 并做有机酸的重现性和回收率实验，以验证方法的准确性和可靠性。 ( 4 ) 将实验室现有的，来自长城和王朝酿酒公司的，2 0 0 2 年份的1 5 种原 酒进行有机酸分析，比较干白与干红有机酸的差别，以及两厂家原酒中有机 酸的差别。 ( 5 ) 从沙城、蓟县、汉沽、昌黎四个葡萄产地，取2 0 0 3 年份葡萄成熟过程 中的葡萄样品，以及酿造过程中的酒样，进行有机酸的测定，了解葡萄成熟 过程中和葡萄酒酿造过程中各种有机酸的变化，并且对不同产地，不同品种 进行比较，总结出有机酸的不同对葡萄酒风味的影响。 1 3 国内外葡萄酒挥发性硫化物的研究状况 异味物质( 对葡萄酒质量不利的呈色、呈口味和呈气味的化合物) 的产 生是葡萄酒发酵生产中的一类重要的问题。异味物质主要包括醋酸、高级醇 ( 杂醇油) 和含硫挥发性化合物。酿酒酵母的发酵还受到酒中某些酚类的影 响p j 。酵母可以通过酶反应由植物中的酚类前体物质产生乙烯基酚类物质。 这些化合物具有刺激性的药味和酚的气味。下面着重讨论挥发性硫化物。 1 3 - + 友i 生硫化物的产生 重要的一类污染物质是挥发性硫化物。发酵过程中生成痕量的挥发性含 硫化合物一直是一个问题。这一组化合物包括挥发性很强的具有不愉快气味 的物质，所形成的气味通常描速为臭蛋味、臭鼬气味、大蒜味或洋葱味。虽 刖舌 然它们的生成水平只有每升数十至数百微克，并且只是在不正常的发酵中代表 很微弱的生化反应，但它们的感官刺激作用明显，对风味有破坏作用，在葡 萄酒酵母发酵中，硫醇、乙硫醇和甲硫醇的生成情况已有人用气相色谱法进 行了分析，分析中采用毛细管色谱柱和硫化物专用检测器。其他含硫化合物 ( 氧硫化碳、二硫化碳、二甲基二硫醚) 的生成情况最近也有文献报道 。 影响这些含硫化合物生成的因素目前还不清楚。 含硫化合物中挥发性最强的是硫化氢( h 2 s ) ，它具有臭鸡蛋的气味。许多 因素可以驱动或有助于硫化氢的产生。酵母在发酵中产生硫化氢的原因是多 方面的：葡萄皮上存在元素硫悼2 j ：发酵醪中游离a 氨基氮( f a n ) 的水平不足 1 3 - 1 6 1 ；葡萄汁中泛酸缺乏【1 7 】，或吡哆胺缺乏【1 8 、或半胱氨酸水平高于正常值 1 9 1 ；也有酵母菌株本身的原因1 9 a2 ，2 。添加亚硫酸对产生硫化氢的作用也有文 献报道 1 1 , 1 6 , 2 2 】，也有观点认为，用筛选的酵母菌株可以避免产生硫化氢 8 , 2 2 1 。 硫化氢的产生也可能是生物合成中硫酸盐还原不当的结果。硫酸盐的吸 收和还原是由甲硫氨酸水平调节的，而不是由细胞中还原硫的水平调节的。 因此，甲硫氨基酸代谢或生物合成的阻塞，将导致过量还原硫的生成，这种 还原硫后来会从细胞中释放到培养基中。泛酸缺乏会阻塞甲硫氨酸的生物合 成，从而会导致h 2 s 的形成。氮源缺乏也会阻塞氨基酸的生物合成和导致h 2 s 的形成。高浓度金属离子也可能导致h 2 s 的产生，如果培养基中存在高水平 的铜离子，发酵后就会因硫化铜的产生使酵母菌体呈现黑色。对金属离子的 抗性，部分是由于金属硫化物复合体的生成，因为这种复合体可沉淀，从而 可以从培养基中有效除去。 因此，甲硫氨酸的大量积累会降低硫化氢的生成，筛选高产甲硫氨酸的 酵母菌株可以降低硫化氢的生成量。 尽管酵母菌株本身对硫化氢形成有重要影响，但世界上就硫化物的生成 特性，来筛选更好的酵母菌株方面，还未能达到一致。在提出的许多可能性 中，仍然包括菌株的作用，究竟这些结果是特定的情况，还是普遍的现象至 今仍不清楚。类似地，在某些地区发现的有效的培养基添加剂在其他地区的 应用效果并不一致。这是因为研究者的焦点多在它们的处理方法上，而不是 在所使用的葡萄汁上。即使现在也难以阐明，为什么在初始葡萄汁中硫源不 足的情况下，有的发酵过程仍能产生硫化物。葡萄汁中维生素含量的分析仍 然是困难的，因而在一般情况下并不进行分析，即使已知泛酸缺乏是这一问 题的可能原因。 1 3 1 1 元素硫的影响 发酵过程中元素硫的存在与硫化氢生成之间的关系已经十分清楚了引。 在后来的研究中，很多研究者用不同的分析方法都得出了类似的结果 9 , 1 0 , i i 。 天津科技大学硕士学位论文 这些分析方法包括次甲基蓝显色法和硫化物专一性离子电极检测。这些早期 的研究工作引起了人们对葡萄园管理工作的重视，特别是在用喷洒硫粉来控 制霜霉病的方法上。现在已经认为在葡萄收获前6 周之内不能使用硫磺粉， 最好在进入成熟期( v e r a i s o n ) 之后都不使用。 直到最近人们才对葡萄中实际的含硫水平进行了测定，据发现在一些葡 萄园的样品中，残留的硫水平为1 5 m g l 1 2 。添加元素硫2 4 m g l 的发酵 结果显示，对于硫化物的生成量来说，酵母菌株和培养基( 配制的葡萄汁) 的影响要比所存在元素硫的影响大【l “。早期的研究所述的硫化氢生成来源于 元素硫，是因为在所用的硫水平很少时的情况【2 4 】。但是，在实践中发现，硫 化物水平的大幅度变化并非是少见的，尤其是在霜霉菌严重感染的地区，常 常可以预计到硫化氢产生的不利后果。在白葡萄酒生产中，果汁中存在硫磺 粉所导致的问题要轻的多，事实上利用发酵前小心沉降和换桶的方法可以避 免这f 十危瞄。 1 _ 3 1 2 氨基氮的影响 v o s 和g r a y ( 1 9 7 9 ) 最先研究了葡萄汁的氮源水平，尤其是游离氨基氮 ( f a n ) 对于形成硫化氢的影响【l ”。他们主要采用一个葡萄产区的一个葡萄品种 的葡萄汁，结果发现当f a n 的水平从l o o m g l 升高至3 0 0 4 0 0 m g l 时，h 2 s 的的水平从约从1 0 0ug m 普遍下降到几乎为0 。这些研究者认为，硫化物的 生成是在可供氨基氮水平较低的情况下，由酵母细胞外蛋白酶水解果汁中的 蛋白质，生成的氨基酸，进而释放出硫化物。这些研究者还报道，添加皂土 处理，并在发酵之前除去皂土后，降低了硫化物的生成量，但也导致了发酵 不完全。添加浓度为1 6 0 m g n l 和2 5 0 m g n l 的磷酸氢二铵液降低了某些葡 萄汁中硫化物的生成量，但这样导致了可供氮源远高于足够正常发酵需要的 水平( 1 4 0 1 6 0 m g n l ) 。 从以上研究可以清楚地看到，游离氨基氮的浓度并不是硫化物生成的唯 一凶系：间是在许多葡萄汁中还存在变化很广的第二种因素。对这些发现的 其他的可能的解释是，许多葡萄汁中缺乏泛酸或吡哆胺，或者说游离氨基氮 库中某些氨基酸的比例对于硫化物的产生有重要的影响。 1 3 1 3 亚硫酸盐和菌株效应 近来人们对导致硫化物产生的培养基条件进行了一些研究，尤其是利用 合成培养基进行了研究 2 5 , 1 6 , 2 6 , 2 7 。e s c h e n b r u c h 研究指出，硫化氢是在铵离子 耗尽和亚硫酸氢盐存在的情况下生成的，但是这与一般的工业发酵的情形不 符。在一般的工业发酵中，铵离子是在发酵过程前1 3 阶段耗尽的，这时无 论是添加的还是自然存在的亚硫酸铵盐都已残存很少了。j i r a n e k 研究发现， 9 前言 在亚硫酸氢盐影响硫化氢的产生方面也存在着菌株的差别，即使对于被认为 是不产硫化氢的酵母菌株也是如此。h e w i t s o n 和g i u d i c i 研究证明，在氮源缺 乏的培姜甘，不存在亚硫酸盐的情况下，可以由硫酸盐还原生成硫化氢。 1 3 1 4 维生素缺乏 w a i n w r i h g t ( 1 9 7 0 ，1 9 7 1 ) 研究了维生素中的泛酸和吡哆胺在甲硫氨酸和 半胱氨酸合成中必需的辅酶合成中的作用1 8 2 8 1 。他根据是绝对需求泛酸还是 能合成泛酸将几株酵母分成两类。对于某些常见的葡萄酒酵母菌株，其泛酸 的需求情况已经确定【29 1 ，但是仍然有一些常见菌株的泛酸或吡哆胺需求情况 还不清楚。 在许多工业发酵和硫化氢生成原因的实验研究中，仍然可能存在泛酸的 作用。添加5 0 - - 7 5 m g l 水平的泛酸到所有的试验果汁中可以消除泛酸缺乏的 影响。 13 1 5 其他因素 对于葡萄汁，有一些研究对在发酵过程中产生硫化物的氨基酸组分进行 了统计壮杯。o 旦并未发现硫化物的产生与个别氨基酸或氨基酸族之间有什么 对应关系。w a i n w r i g h t ( 1 9 7 1 ) 在数个季节中对有缺陷的葡萄汁中添加氨基酸 的影响进行过分析，但也未见到添加苏氨酸和甲硫氨酸的量与硫化氢生成水 平之间有对应的关系【l 。 一类未引起人们重视的主要成分是多肽，尤其是谷胱甘肽。将谷胱甘肽 添加到试验葡萄汁中的发酵表明，谷胱甘肽能在某些条件下抑制硫化物的生 成【3 0 】。 产生h 2 s 的另一个驱动力可能是再生氧化的辅助因子( n a d + 或n a d p 。) 的需要。在许多微生物中，硫酸根可以作为最终的电子受体。高水平的s 0 2 开始会因为抑制乙醛的还原而导致h 2 s 的产生。氨基酸、维生素、金属离子 含量和s 0 2 利用情况都是影响h 2 s 产生的因素。s 0 2 可以将h 2 s 转化为s ， 后者会从葡萄酒中沉淀出来，只有当后来环境有利于还原作用时，s 又重新 还原为h 2 s ，除非先将s 沉淀除去。生成h 2 s 的一个很重要的决定因素是酵 母菌株本身。某些酵母菌株在硫源充足的情况下，可以产生高水平的h 2 s ， 其原因至“产百清楚。一般情况下，较快速的发酵中产生较多的h ：s 。 复杂的含硫化合物，例如二甲基硫醚、甲硫醚、乙硫醇、二甲二硫醚和 二乙二硫醚也会由于酵母的代谢而产生。虽然导致这些化合物产生的因素还 没有彻底搞清楚，但含硫氨基酸的代谢在它们的合成中起着重要作用。如果 培养基中存在足够的金属离子，在适当条件下就可能出现这些含硫化合物的 合成，这可能是细胞中的生化反应对抗酒液中化学作用的结果。 天津科技大学硕士学位论文 1 3 2 葡萄酒发酵过程中的硫代谢 酵母属酵母可以利用硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物和硫代硫酸盐作为生物 合成的硫源。硫代硫酸盐在被利用之前首先分解为亚硫酸盐和硫化物，因此 两个硫原子都可以被利用1 3 “。亚硫酸盐的利用水平受到这种化合物毒性的限 制【3 ”。有机化合物，半胱氨酸、甲硫氨酸、高半胱氨酸和s 一腺苷甲硫氨酸也 能作为硫源【j “。 硫源的同化需要5 步酶反应( 图1 - 1 ) 。硫酸根是通过磷酸硫酸酐中间体 而被还原的。a t p 硫酸化酶催化a t p 和硫酸生物合成腺苷一5 一磷酸硫酸 酐( a p s ) 。a p s 激酶催化3 一磷酸腺苷一5 一磷酸硫酸酐( p a p s ) 的生 成。p a p s 还原酶负责亚硫酸的生成。亚硫酸还原酶是一种复合酶，催化亚硫 酸的6 个电子还原，生成硫化物。酵母属酵母中似乎存在两种不同的亚硫酸 还原酶，一种利用与载体结合的亚硫酸，另一种利用游离的亚硫酸【3 ”。5 种 不同基因的突变影响了亚硫酸还原酶的活性，这种影响可能涉及到酶的编码 亚基，或涉及亚硫酸还原酶活性需要的s i r o h e m e 的产生【3 1 ) 。在酵母属酵母 中，硫化物后来被转化成邻乙酰高丝氨酸，后者可以转化为高半胱氨酸。亚 硫酸在酵母属酵母中的代谢与其他微生物不同，它不是直接进入邻乙酰丝氨 酸【3 ”。因此半胱氨酸并不是由丝氨酸的硫酸化直接产生的。高半胱氨酸和半 胱氨酸可以通过转硫途径( 图l 一2 ) 相互转化。有趣的是，在任何硫酸盐还原 成亚硫酸盐和硫化物的过程中，并未观察到零价硫( 元素) 的形成。 “ 曩一r t ：“意】1 | # # t 一1 川、章m t 11 1 一= -浦薪蝌女j t ”、 ， * 系黪。蠹链圳 一+ *