（发酵工程专业论文）工业酒精酵母活力检测方法的应用评价及高活力培养.pdf

摘要 摘要 酵母的质量是发酵过程中重要的因素，对酵母的活力进行准确、快速的评价，是近 几年来国内外一直致力的研究课题。在生产过程中，影响酒精酵母活力的因素很多，包 括菌株的差异，接种量的选择，酵母培养时的通氧情况，发酵过程温度与压力的控制等。 酵母特别是在培养成分贫瘠的培养基中培养，其活力对发酵时间、发酵强度等都有直接 的影响，进而影响酒精厂的经济效益。准确、及时地分析并培养出高活力的酵母对酒精 的生产有直接的意义。主要研究方法和结果如下： 1 、通过对三种测定啤酒酵母活力方法的比较，对工业酒精酵母活力的测定并不是 都遁用，可见不同的酵母菌种有着不同的性质。三种测定方法只有酸化力实验能准确的 判断酵母的活力，而且方法操作简单，只需要常规的实验设备，并且操作时问短，整个 过程只需3 5m i n ，对及时判定酵母的活力有指导意义。 2 、测定酸化力的最佳条件酵母泥浓度为1 0 、葡萄糖浓度为5 、温度为2 5 0 c 时， 酸化力g i p e 值稳定并以较大值体现。 3 、g i p e 值与酵母的产酒精能力相关系数为0 8 4 0 6 ，表明酸化力与酵母发酵产酒精 能力之间有较好的相关性，利用酸化力可以对酵母的发酵能力进行判断。 4 、结果表明当添加n a + 浓度0 0 0 5m o l l 、k + 浓度0 0 5m o l l 、m 9 2 十浓度0 0 0 2m o l l 、 c a 2 + 浓度o 0 0 5m o l l 时，酵母表现的活力高于不添加离子的空白培养基培养的酵母，分 别高5 4 7 、1 0 1 7 、7 8 1 、4 5 9 。 5 、酒精酵母生理代谢相关参数的变化情况表明，四种混合离子培养基培养的酵母 活力最大，比空白高3 5 6 1 ，并能维持高活力状态时间较长，这表明酒精酵母生长的 环境中添加4 种离子，具有彼此协调，相互促进的作用。 6 、通过实验得出以木薯粉培养高活力酵母的最佳条件为糖化时间4 0m i n ，尿素 0 2 5 ，钾离子浓度0 0 0 5m o l l ，钙离子浓度为0 0 0 2m o l l ，优化后活力最高时淀粉利 用率提高了2 7 3 。由酒精发酵实验可知，酵母的发酵能力不仅和活力有关，还和细胞 数有关，所以，酵母的培养既要高活力又要高细胞数，才能提高发酵效率。 关键词：酒精酵母；活力；酸化力；无机盐；木薯 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eq u a l i t yo fy e a s ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r si nf e r m e n t a t i o np r o c e s sf o r e t h a n o lp r o d u c t i o n i ti sk n o w nt h a tt h e r ea r em a n yf a c t o r s ，s u c ha st h ed i f f e r e n ts t r a i n s ， i n o c u l u ms i z e s ，a n do x y g e n ，t e m p e r a t u r ea n dp r e s s u r ec o n d i t i o n s ，w h i c hh a v ee f f e c t so ny e a s t v i t a l i t y a n di th a sb e e naf o c u sr e s e a r c ht oe s t a b l i s ha na c c u r a t ea n dr a p i de v a l u a t i o ns y s t e m f o rv i t a l i t yt e s to fi n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n sf o re t h a n o lf e r m e n t a t i o ni nt h ew o r l df o ry e a r s m o r e o v e r , t h ec u l t i v a t i o no fy e a s td i r e c t l ya f f e c t so nt h ef e r m e n t a t i o nc o u r s ea n df e r m e n t a t i o n i n t e n s i t yf o re t h a n o lp r o d u c t i o n ，e s p e c i a l yi n t h eb a r r e nb r o t h ，f o l l o w e db ye c o n o m i c e f f i c i e n c yo fe t h a n o lp l a n t sb e i n gd e l i n e d h e n c e ，i ti sm e a n i n g f u lt of o u n da n di n c u b a t et h e y e a s tw i t hh i g ha c t i v i t ya c c u r a t e l ya n dt i m e l yi nt h ea l c o h o lp r o d u c t i o n t h er e s e a r c hm e t h o d s a n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h r e ed i f f e r e n tm e t h o d sw e r eu s e dt oe v a l u a t et h ev i t a l i t yo fb e e ry e a s t i tw a sf o u n d t h a tt h e s em e t h o d sw e r en o ta l la d a p tt oe v a l u a t et h ey e a s ts t r a i n s v i t a l i t yf o ri n d u s t r i a l e t h a n o lp r o d u c t i o n a n di tc o u l db ec o n c l u d e dt h a td i f f e r e n ty e a s t sh a dd i f f e r e n tc h a r a c t e r i s t i c s a m o n gt h e s et h r e em e t h o d s ，o n l yt h ea c i d i f i c a t i o np o w e rt e s tc o u l dj u d g i n gt h ey e a s ts t r a i n s v i t a l i t yf o ri n d u s t r i a le t h a n o lp r o d u c t i o ne x a c t l y m o r e o v e r , t h i sm e t h o dw a sc o n d u c t e db y r o u t i n ee x p e r i m e n te q u i p m e n t sa n dw a ss i m p l eo p e r a t i o na n dt i m e - s a v i n g ：e n t i r ep r o c e s sw a s c o m p l e t e di n3 5m i n u t e s ，w h i c hc o u l de s t i m a t et h ev i t a l i t yo fi n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n sf o r e t h a n o lf e r m e n t a t i o ni nt i m e 2 t h eo p t i m u mc o n d i t i o nf o rt h ea c i d i f i c a t i o np o w e rt e s tw a s ( w w ) ：m u dy e a s t10 ， g l u c o s e5 ，2 5 。c u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，g i p ev a l u ew a ss t a b l ea n ds i g n i f i c a n t 3 t h ec o e 伍c i e n to fc o r r e l a t i o nb e t w e e ng i p ev a l u ea n dt h ey e a s t se t h a n o lp r o d u c t i o n c a p a c i t yw a s0 8 4 0 6 ，i n d i c a t i n gt h a tt h ea c i d i f i c a t i o np o w e ra n d t h ey e a s t se t h a n o lp r o d u c t i o n c a p a c i t yh a dg o o dc o r r e l a t i v i t y s ot h ea c i d i f i c a t i o np o w e rt e s tc o u l db eu s e df o re v a l u a t i n g y e a s t sf e r m e n t a t i o na b i l i t y 4 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw h e ns o m ei o n ss u c ha sn a 十( o 0 0 5m o l l ) ，k 十( 0 0 5m o l l ) ， m g 十( o 0 0 2m o t l ) ，c a 2 十( o 。0 0 5m o l l ) w a sa d d e dt ot h em e d i u m ，i n d u s t r ya l c o h o ly e a s t v i t a l i t yw e r e5 4 7 ，10 17 ，7 8 1a n d4 5 9p e r c e n th i g h e rt h a ni n c u b a t e di nt h eb l a n kc u l t u r e m e d i aw i t h o u ti o n s ，r e s p e c t i v e l y 5 c h a n g e so fp a r a m e t e r sr e l a t e dt ot h ep h y s i o l o g i c a lm e t a b o l i s mo ft h ei n d u s t r i a ly e a s t s t r a i n sf o re t h a n o lf e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a t ，t h ey e a s tv i t a l i t yi nt h ec u l t u r em e d i u m i n c l u d i n gf o u rk i n d sc o m m i x t u r ei o n sw a sm a x i m a l 3 5 6 1p e r c e n th i g h e rt h a ni n c u b a t e di n t h eb l a n k ，a n dc o u l dm a i n t a i nh i g hv i t a l i t ys t a t ef o ral o n gt i m e ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e s e4 k i n d so fi o n si nt h ey e a s tm e d i ah a v i n gt h er o l eo fi n t e r c o o r d i n a t i o na n dm u t u a lp r o m o t i o n 6 1 1 1 eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rh i g hv i t a l i t yo ft h ei n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n sf o re t h a n o l f e r m e n t a t i o nw e r ef o u n db ye x p e r i m e n t ，a n dt h er e s u l t sw e r e ：s a c c h a r i f i c a t i o np e r i o d4 0 m i n ， u r e a0 2 5 ( w w ) ，p o t a s s i u mi o n0 0 0 5m o l l ，c a l c i u mi o no 0 0 2m o l l u n d e rt h eo p t i m u m c u l t u r ec o n d i t i o n s t h es t a r c hu t i l i z a t i o nr a t i oh a si n c r e a s e d2 7 3 a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so f a l c o h o lf e r m e n t a t i o nt e s t f e r m e n t a t i o na b i l i t yo fy e a s tn o to n l yr e l a t e dt ot h ev i t a l i t yo fy e a s t b u ta l s ot h en u m b e r so fy e a s t s o i no r d e rt oi m p r o v et h ef e r m e n t a t i o ne f f i c i e n c y , t h e a b s t r a c t c u l t i v a t i o no fy e a s ts h o u l db eh i g hv i t a l i t ya n dh i g hc e l ln u m b e r s k e y w o r d s ：i n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n sf o re t h a n o lf e r m e n t a t i o n ；v i t a l i t y ；a c i d i f i c a t i o n p o w e r ；i n o r g a n i cs a l t s ；c a s s a v a 1 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 型整遂 日 期：细f 多f 7 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 勤垒 导师签名： 日 期： 1 绪论 1绪论 1 1 酵母质量评价方法 酵母的质鼍足发酵过程中重要的因素，质量差的酵母肯定不会有好的发酵能力。因 此，在生产过程中酵母质镀的分析测定对酿造生产是很重要的。传统的测定方法包括血 球计数版计数和咂甲基蓝染色，测定时间短，但是准确性和可靠性不高。平板培养法对 测定酵母的活性有很好的准确性，但是需要很长的培养时间，一般为1 8 2 4 小时。如何 对酵母的活力进行准确、快速的评价，是近几年来国内外一直致力的研究课题，研究出 了不少新的方法，如胞内p h 的检测、酸化力的检测、镁离子释放检测、蛋白酶a 的检 测、0 2 吸收率的检测、酵母味物质的检测等作为酵母活力的评价【l 】。综合起来主要分为 荧光检测法、酸化力检测法、镁离子释放实验及其他方法。 1 1 1 荧光检测法 荧光检测法的原理是，细胞内加入荧光多肽底物，此底物内含有荧光基团及抑制基 团，因而其本身不产生荧光。底物进入细胞后，由于细胞内的活性酶对多肽的水解作用， 解除了抑制基团对荧光基团的抑制，从而产生荧光。通过比较产生荧光的强弱可以区分 细胞的活性i jj 。 1 、胞内p h 法 用胞内p h 法来衡量酵母生理状态，有以下几个原因：首先，酵母细胞的生长与胞内 p h 有密切的关系，在利用呼吸能生长繁殖时，营养物质在胞内氧化释放的电子在位于 原生质膜上的电子传递链上传递的过程中，会伴随质子的外排，导致胞内p h 上升。其 次，发酵过程中，酵母利用a t p 提供能量时，在位于原生质膜上的a t p 酶的作用下， a t p 水解成a d p 和磷酸，此时也会伴随质子的外排，导致胞内p h 上升。第三，细胞膜 两侧的h 离子浓度梯度，是吸收营养物质的驱动力之一，麦芽糖和氨基酸等辅助因子通 过h 离子转移。第四，胞内p h 可以逆向调节在糖酵解与糖质增生过程中的关键酶。在 些调节过程中，c a m p 起着重要作用，而细胞内p h 可以调节c a m p 的形成。因此， 胞内p h 值的变化可以反映酵母的生理状态。 日本的t a k e oi m a i 【2 】等开发的i c p 法中，使用的荧光素底物为5 ( 6 ) 羧基荧光素。乙 酰化的5 ( 6 ) 羧基荧光素不产生荧光，然而，由于细胞液内的酯酶对乙酰化的5 ( 6 ) 羧基 荧光素的水解，最后产生的化合物带有荧光，细胞内含有发荧光的5 ( 6 ) 羧基荧光素。利 用p h 与荧光值的函数关系测出细胞的胞内p h 。活力强的细胞，即使细胞外p h 低，胞 内p h 也不会降低，但是，活力差的细胞，细胞外的p h 低，胞内p h 就会降低。 他们【3 】研究表明在低p h ( p h = 3 0 ) 条件下测定胞内p h ，胞内p h 值与细胞增殖的能力 成正相关。胞内p h 与细胞增殖的微小变化通过平板培养来反映他们的关系，通过对1 5 个样品的测定，胞内p h 值与菌落数呈良好的线性关系( r = o 9 6 0 ，p = 0 0 0 1 ) 。对于面包酵 母同样有很好的线性关系( n = 1 3 ，产o 9 5 0 ，p = 0 0 0 1 ) 。胞内p h 值与a t p 含量的关系，在 6 0 0 c 下处理1 0m i n 以上，细胞内a t p 数量下降，同时胞内p h 值也从6 2 下降到4 7 ； 江南人学硕+ 学位论文 不同浓度的酒精处理，随着酒精浓度的增加，胞内p h 值与a t p 含量出现相同的变化趋 势。因此，胞内p h 值可以用来预测细胞的活力。 董建军【4 】等人通过对不同样品胞内p h 的测定与发酵度比较，说明胞内p h 与活力有 紧密的关系。胞内p h 值高的酵母菌株，发酵性能好，活力高，反之，胞内p h 值低的 酵母菌株，发酵性能差，活力差。 2 、蛋白酶a 测定法 蛋白酶a 与酵母的衰老及死亡有关，其含量与菌种、通氧、酵母添加量及发酵过程 的各工艺参数控制有关，另外，与添加酵母的活性有很大关系。在其他工艺参数一致的 情况下，添加酵母的活性强，则发酵液及最终酒液中生成的蛋白酶a 少。目前，分析蛋 白酶a 主要采用荧光分析法，通过荧光强度可以评价蛋白酶a 的活力，再来评价酵母 的活性。 同本的k o g i n 5 1 等人用特制的合成多肽m o c a c a l a p r o a l a l y s p h e p h e a r g l e u ( d n p ) 一n h 2 作底物，酵母中的蛋白酶a 水解p h e p h e 键时，解除了2 ，4 二硝基酚( d n p ) 对荧 光基团m o c a c 的抑制作用，在激发波长3 2 8n n l 与发射波长3 9 3a m 下，产生荧光， 通过荧光强度可以评价蛋白酶a 的活力，再来评估添加酵母的活性。 房慧婧【6 】等用试卤灵标示的酪蛋白测定蛋白酶a ，在5 7 4n m 波长处检测吸光值。 与用亚甲基蓝染色得到的死亡率相比较，能预测酵母的死亡情况，但是对酵母的发酵能 力不能预测。 3 、荧光素直接分析法 z a n d y c k e 7 】等比较了不同的荧光素在测定酵母活力方面的应用。选择了7 种荧光燃 料，试验表明o x o n o l 能明显的区分细胞的死活。 t s u k a t a n i 8 】等用2 ，3 ，5 ，6 四甲基1 ，4 苯醌四唑盐研究了酵母的活力。2 ，3 ，5 ，6 四甲基 1 ，4 苯醌被酵母细胞还原为2 ，3 ，5 ，6 四甲基1 ，4 对苯二酚，然后，在碱性条件下随着 2 ，3 ，5 ，6 四甲基1 ，4 对苯二酚四唑盐还原为甲盐产生过氧化物氧离子，2 ，3 ，5 ，6 四甲基1 ，4 对苯二酚甲盐在4 4 0h i l l 下有最大吸光度。吸光度与1 0 1 0 5 2 0 1 07 个细胞m l 的细胞 浓度有很好的线性关系。在细胞培养过程中，吸光度与葡萄糖浓度变化呈现反平行的关 系，这说明吸光度的变化可以反应细胞的活性。 1 1 2 酸化力检测法 l 、酸化力检测 酵母的原生质膜不仅可用于证明活性，也可以用于证明其活力。引用酸化势实验可 测定原生质膜的质子流，而质子流与发酵性能相关。为了验证实验的准确性和重现性， 主要表现在两个参数的测定：水的酸化势w a p 和葡萄糖的酸化势g i p e 。w a p 反映酵 母细胞内储备碳源的情况，研究表明它与酵母细胞内肝糖的水平相关，而酵母细胞内的 肝糖水平会因受到饥饿、压力的影响而下降，在发酵开始时非常重要，它与细胞的分裂 复制能力有关，从而影响酵母的发酵性能。g i p e 表示的是酵母细胞利用胞外能量物质 的能力，通过葡萄糖降解促进质子流出，维持细胞质p h ，它与酵母的发酵能力有相当 高的相关性。 2 l绪论 酸化力试验是由o p e k a r o v a 和s i g l e r 发明的，由m a n s o n 和s l a u g h t e r 用束预测酵母 的发酵能力，尽管他们发现有限的相关性，但是他们没有足够的数据来评价这种方法的 可行性。k a r a 9 】等详细的研究了酸化力与酵母发酵能力的关系。用亚甲基蓝染色的方法 作为对照，得出酸化力与酵母发酵能力有良好的相关性( r = o 9 4 3 ，p - - 0 0 0 1 ，n = 3 7 ) ，酸 化力能准确的预测酵母的发酵能力。对不同的四种酵母测试都有好的相关性，表明了酸 化力试验的广泛应用性。 z a n d y c k e t l o 】等人测定具有0 、2 5 、5 0 、7 5 和1 0 0 活性的酵母样品，对该菌株的活 性和g i p e 的关联是肯定的( r = 0 9 4 1 2 ，p 0 0 5 ) ，表明该测定活性实验的有效性。从而况 明g i p e 反映了h + - a t p 酶的活性，也就是膜的完整性和膜机能的反映。在乙醇浓度达 到较高的水平时，乙醇体现出一种化学压力，乙醇会引起流出质子流的增加，这是因为 乙醇会增加膜的渗透性和不饱和脂肪酸的积累。不饱和脂肪酸比率的增加会导致原生质 膜的流化，引起原来结合离子的泄露和酶的释放。用不同浓度的乙醇处理酵母，g i p e 值在2h 后显著( 氏o 0 5 ) 下降，并持续下降至6h ，这验证了先前观察到的亚致死量的乙 醇浓度对原生质膜机能的影响。为研究g i p e 的电势与自由基的关系，将酵母悬浮于不 同的亚致死量浓度的h 2 0 2 中，然后测定g i p e 。结果显示，g i p e 下降显著( p 0 0 5 ) 。在 实验室菌株中未发现亚致死量的h 2 0 2 浓度对膜流变性的作用，说明h 2 0 2 对h + - a t p 酶 的活性有抑制作用。g i p e 可以说明提高麦汁溶氧浓度对h + - a t p 酶活性和酵母泥发酵性 能的影响。所以g i p e 反映了h + - a t p 酶的活性，还有原生质膜的渡变性和完整性，间 接反映了压力损伤和酵母的活力。 s i g l d 】等人于2 0 0 6 年对酸化力试验又进行了严谨的重新评价。对贮藏于4 0 c 不同 时问的酵母来说不同的测试温度、不同的细胞浓度和葡萄糖浓度、不同的细胞与葡萄糖 的比例，这些因素都对酸化动力学和酸化力值有很强的影响。相反，在迟滞期的酵母对 试验没有明显的影响。试验最好的结果是细胞浓度为1 4g 酵母泥1 0 0m l 水、葡萄糖浓 度为3 、2 5 0 c 。 2 、累加的酸化力测定法 累加的酸化力测定法( 简称c a p 法) 是p a t i n o 【l2 】等人在酸化力测定法( 简称a p 法) 基础 上，研究开发出来的。c a p 法针对a p 法存在的缺陷，进行了改进，采用累加的质子绝对 浓度的改变来代替发酵开始与发酵结束p h 值的变化。采用累加的质子绝对浓度的改变来 代替发酵开始与发酵结束p h 值的变化。但是只是酸化力试验数值的改变，随着p h 值的 升高该值会受到影响。 3 、滴定酸化力测定法 r o d r i g u e s t h j 等人研究了基于基于酵母代谢活力的测定方法活力滴定法。该方法把 酵母菌种接种于p h1 0 的培养基中，测定p h 从1 0 降到6 5 每分钟所消耗n a o h 溶液的 体积来计算酵母的活力。活力滴定法中p h 的降低主要是因为c 0 2 的产生和h + 的释放， 它们对细胞的活性产生抑制。除此之外，因试验过程中没有外源能量来源，产生的c 0 2 和释放的h + 作为细胞内能量被利用也涉及酵母的活力下降。因此，试验以间接的方式 反映了细胞内能量的利用水平。为了测试不同酵母生理状态所具有的活力，进行了一次 江南大学硕十学位论文 标准的限制性营养试验( 老化试验) ，且把活力滴定法与其它活力测定方法进行了对比。 对被测试酵母进行接种试验，以此说明活力滴定能否预测不同生理状态酵母在发酵能力 上的不同。对于贮存于1 2 0 c 和4 0 c 的酵母进行了活力滴定和酸化作用力试验。两种贮 存温度下酵母的活力都有所下降，然而，活力滴定比酸化作用力试验表现的更明显。发 酵能力的评价，对贮存酵母事先接种新鲜麦汁，发酵时问随接种酵f 哮的贮存时| j 增长而 增加，从而酵母的活力很好的说明了酵母的发酵能力。所以活力滴定显示了活力降低的 准确性并能预测发酵力的下降。 i s e r e n t a n t 【1 5 】等人在酸化力、累积酸化力等方法的基础上研究出了一种新的酸化力测 定方法滴定酸化力法( t a p ) 。测定方法与酸化力的测定方法相似，但是是添加o 1m n a o h 溶液使溶液p h 维持在6 3 ，添加n a o h 溶液的体积来反应酵母的活力。结果表明 t a p 方法在测定高活性的需氧的面包酵母和需氧的酿造酵母时有很好的区别性，但是 t a p 方法不能准确的测定这些高活性酵母的活力。t a p 方法对活力低的酵f 4 敏感性不 高，但是不能用t a p 方法测定出活力的酵母是不能用于发酵的。 1 1 3 镁离子释放试验 在研究酿造酵母的离子吸收和传输模式时，发现具有良好发酵状态( 如有较短的迟 缓期、较高的酵母数、较高的乙醇含量) 的酵母泥在接种麦汁后迅速释放镁离子、钾离 子和磷酸盐离子，然后再吸收这些离子。相反，发酵较差的酵母泥则在接种后吸收这些 离子。 m o c h a b a 1 。7 】等人依据以上的原理研究出一种新的测定酵母活力的方法镁离子释放 实验( m r t ) 。该方法为用离一t l , 机在4 0 c 和2 0 0 0 x g 的条件下，将2g 酵母泥离心5m i n ， 所得沉淀用8m l 无离子冰水洗涤一次。然后取o 1g 清洗过的酵母泥使之快速的悬浮于 1 0m l 新鲜麦汁( 1 6 。p ) 中，混合1m i n 后，用一个一次性针管和0 4 5i t m 的滤膜进行过滤。 再取1m l 镁离子基础试剂和lm l 镁离子颜色试剂混合，吸取1 0 “l 过滤的样本加入到 2m l 的镁离子分析混合液中混匀。使用1 0m m x 2 9m l 的比色杯和分光光度计于5 2 0n l 1 读取吸光度。取同批未加酵母的麦汁1 0m l ，使用o 4 5p m 的滤膜进行过滤后，加入镁 离子分析混合试剂，如上分析麦汁的镁离子含量。镁离子含量可通过下式进行计算： 镁离子含量= 样品吸光度标准吸光度2 o 实验室发酵规模的试验表明镁离子的释放水平与最终乙醇含量有良好的相关性。乙 醇产量较大的酵母在接种后释放明显多的离子。 酵母自溶状态的蛋白酶活性测试与镁离子释放的比较结果为蛋白酶活性较高的酵 母泥，其镁离子释放水平较低，然而，某些酵母泥在较低的蛋白酶活性时仍不释放镁离 子，而是吸收镁离子，其镁离子释放测试值低于零。这表明镁离子释放实验测试的为酵 母泥活力，而这与酵母活性并不相同。 生产规模最终乙醇含量与镁离子释放的关系，镁离子释放实验中释放较多数量镁离 子的酵母泥，会有良好的发酵状态，生成较高浓度的乙醇。释放镁离子较多的酵母泥， 其发酵后期双乙酰水平相对较低。 释放镁离子较多的酵母泥对糖的利用更为完全，释放镁离子较少的酵母泥质量差， 4 1 绪论 易导致发酵缓慢，迟缓期长。 实验室规模( 5 0 0m l ) 和7 l 产现场( 3 0 0 0 h l ) 的发酵实验，较进行的2l 和4 0l 发酵实 验对测试数据更具支持性。即具有良好生理状态的酵母比低活力的酵母释放更多的镁离 子。 1 1 4 其他方法 l 、肝糖与海藻糖含量测定法 肝糖是一种多聚糖，是细胞中的主要能源物质，在有氧的条件下，可分解代谢提供 细胞合成固醇和不饱和脂肪酸的能量。这些物质是合成细胞膜的主要物质，其含量的多 少与细胞的生长、繁殖及整个发酵过程有关。 测定肝糖含量的方法大致分成两类：( 1 ) t r e v e l v a na n dh a r r i s a n 法。这种方法被广泛 地使用，是非专一性法。( 2 ) 酶解法。这种方法是专一性法。 q u a i n t l s l 等人通过对上述两类方法的研究及改进，认为如下方法对于肝糖含量的测 定比较合理。他采用改进的t r e v e l y a na n dh a r r i s o n 提取法，接着用b e c k e r 法水解葡萄糖， 再用酶法分析葡萄糖。首先，用n a 2 c 0 3 提取酵母中碱溶性的肝糖，然后用高氯酸提取 酸溶性的肝糖。上述提取液分别用醋酸和氨水调：声p h 为5 0 。在提取液中加入淀粉糖苷 酶水解肝糖成葡萄糖，最后分析葡萄糖的含量，从而计算出酵母中的肝糖含量。 m o c h a b a 【1 9 1 等人用红外线反射光谱测定法( 简称n i r ) 来测定肝糖。这种方法的原理 是，夺一? 定范围内，样品中肝糖含量的多少与光的吸收有很好的相关性。他采用德国造 的b r a n & l u e b b ei n f r ap r o v e ri i 红外线探测仪，先把干酵母样品磨成粉，然后放入探测 仪中测量。通过与其他化学方法作比较，n i r 法的可靠性与化学法一样好，而且，n i r 法大大地节省了分析时间。 0 c o n n e r - c o x 2 0 】等认为用肝糖含量的变化来衡量酵母的活性更为合理。他们认为， 在有氧条件下，肝糖分解产生的能量供给发酵期间酵母合成其他物质时使用，如固醇、 不饱和脂肪酸的合成，因此，肝糖分解代谢的能力可以更好地显示出酵母细胞的生理状 况。 2 、腺苷酸激酶测定 d r i s c o l l t 2 l 】等人发明了一种检测酵母泄露和自溶的方法腺苷酸激酶测定。腺苷酸激 酶( a k ) 是胞内酶，质量好的酵母不会释放腺苷酸激酶，因此，可以作为酵母自溶的标志。 把这种方法应用于几种酵母测试，发现酵母的贮藏时间、温度和一般的生理条件有很好 的相关性。质量好的酵母只有很低的胞外腺苷酸激酶酶活( 镁。 如何提高酵母的质量是木薯酒精发酵的基础，高活力的酵母对于缩短发酵时间、提 高发酵强度等都有重要的意义。 1 4 立题意义 在已报道的检测酵母活力的方法中，很多的测试方法往往涉及较高的要求，需要精 密的仪器。因此，在大多数生产中，以次甲基蓝染色的方法被更普遍的使用，但是该方 法具有很大的局限性，只能区别细胞的死活，无法评估活力的强弱。找到一种既准确又 快捷的检测酒精酵母活力的方法对于实际的生产具有重要的意义。在生产过程中，影响 酒精酵母活力的因素很多，包括菌株的差异，接种量的选择，酵母培养时的通氧情况， 发酵过程温度与压力的控制等。酵母特别是在基本培养成分贫瘠的培养基中培养，其活 力对发酵时间、发酵强度等都有直接的影响，进而影响酒精厂的经济效益。为了有效控 制这些因素对酒精酵母的影响，需要能准确、及时地分析其活力。工业酒精酵母活力检 9 j ：南人学硕十学位论文 测，对酵母发酵水平及菌种在传代过程中的活力的损失作出提前判断，以减少生产过程 中的失误。 在生产过程中酵母的制备不可能用营养丰富的蛋白胨、酵母膏等营养物质，一般直 接以糖化醪为培养基制备洒母，像木薯、糖蜜、地瓜干等原料成分单一，缺少氮源、无 机离子等元素，使得酵母的活力低、细胞数少，不能满足发酵的需要。所以如何制备高 质量的酵母是各个工厂生产的关键环节。酒精酵母的活力从酒母开始就直接影响生产的 结果，出酒率不能保证直接影响工厂的经济效益。 本课题从这两方面着手，建立酒精酵母活力检测体系与以木薯为原料培养高活力酵 母，对酒精生产的工、i k 化应冉j 有着指导意义。 1 5 本论文的主要研究内容 1 酒精酵母活力检测方法的确定 2 以酸化力为指标，考察钠、钟、镁、钙等四种离子对酵母活力的影响 3 基于g i p e 方法的木薯原料基质中高活力酵母的培养 l o 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 试验菌种 菌种为江南大学生物工程学院生物资源与生物转化研究室保藏的酒精酵母。 2 1 2 主要试剂与原材料 葡萄糖 葡萄糖 蛋白胨( 鱼粉) 酵母粉 无水乙醇 双氧水 氯化钠 氢氧化钠 琼脂 镁诊断试剂盒 磷酸二氢钾 无水氯化钙 磷酸氢二铵 七水硫酸镁 磷酸氢二钠 木薯粉 中温0 【淀粉酶 糖化酶 2 1 3 实验仪器 j y 0 7 0 7 电子天平 7 2 1 分光光度仪 s b a 4 0 b 生物传感仪 超净工作台 h y g a 全温摇瓶柜 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 条状 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 s e v e n m u l t i 型p h f 琶导率离子综合测试仪 电热恒温培养箱 台式离心机 2 1 4 培养基 平板保藏及活化培养基( l ) ：蛋白胨2 0 ， 种子培养基( l ) ：葡萄糖2 0 ，蛋白胨2 0 ， 安徽丰源生物化学股份有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 英国o x o i d 公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 永和阳光 国药集团化学试剂有限公司 上海美兴化工有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 取白工厂 酶活力2 2 0 0 u m l 酶活力8 0 0 0 0 u m l 上海民桥精密科学仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 山东省科学院生物研究所 苏州净化设备厂 太仓市实验设备厂 上海梅特勒一托利多仪器有限公司 上海森信实验仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 酵母膏1 0 ，葡萄糖2 0 ，琼脂2 0 。 酵母膏1 0 ，自然p h 。 江南火学硕士学位论文 发酵培养基组成( l ) ：葡萄糖5 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏1 0 ，自然p h 为5 0 。 葡萄糖1 0 ( w v ) ，蛋白胨1 ( w v ) ，磷酸氢二铵0 2 ( w v ) 。 单一离子培养基【3 8 】： n a 离子培养基：在空白培养基中添加磷酸氢二钠，n a + 浓度分别为：0 0 0 5m o l l 、 0 0 1m o l l 、0 0 15m o l l 、0 0 2m o l l 。 k 离子培养基：在空白培养基中添加磷酸二氢钾，k + 浓度分别为：o 0 2m o l l 、0 0 5 m o l l 、0 1m o l l 、0 2m o l l 。 m g 离子培养基：在空白培养基中添加硫酸镁，m 9 2 + 浓度分别为：0 0 0 2m o l l 、0 0 0 5 m o l l 、0 0 1m o l l 、0 0 2m o l l 。 c a 离子培养基：在空白培养基中添加氯化钙，使c a 2 + 浓度分别为：o 0 0 2m o l l 、 0 0 0 5m o l l 、0 0 1m o l l 、0 0 2m o l l 。 培养基灭菌条件：1 l5 0 c 下灭菌2 0m i n 。 2 2 实验方法 2 2 1 酵母的制备 接一环生长良好的斜面酵母至1 0 0 5 0 0m l 的种子培养基中，3 0 0 c ，1 5 0r m i n ，于摇床 上培养2 4h ，至稳定期。 2 2 2 酵母酸化力的检测【6 】 1 ) 称取洗涤离心后的酵母4g 加水( 5 0m l ) 放到玻璃烧杯内，搅拌，笈蟛母悬浮， 1 0m i n 后，检测p h ( p h i 0 ) 。 2 ) 加入5m l 葡萄糖( 2 0 2 ) ，再放置搅拌1 0m i n 后检测p h ( p h 2 0 ) 。 3 ) p h l o 与p h 2 0 之差为g i p e 值。 以上测定在2 0 0 c 下进行。 2 2 3 活力滴定f 1 3 l 1 ) 酵母泥洗4 次，用4 0 c 水对酵母沉淀进行离心和重悬浮。 2 ) 被离心的酵母洗净称重后悬浮于2 7 0 c 浓度为o 9 的2 5 0m ln a c l 溶液中，然后 用n a o h 溶液把酵母悬浮液的p h 提到1 0 0 ，记下此时碱液的体积，并随时记录悬浮液 的p h 变化。 3 ) 活酵母开始酸化培养基后会引起悬浮渡p h 值的下降，记录p h 值随时间的变化， 直到p h6 5 时止。 4 ) 记录p h 从l o 降到6 5 所耗n a o h 溶液的体积和时间，以每分钟滴加n a o h 溶液 量来计算酵母的活力，计算公式如下： v t = e v t xl0 6 v 卜酵母的活力 o - n a o h 溶液的浓度 v 一所耗n a o h 溶液的体积 t - _ p h 从l o 降到6 5 所用的时间 1 2 2 材料o j 方法 2 2 4 镁离子释放试验i n i 1 ) 取0 1g 清洗过的酵母泥使之快速的悬浮于1 0m l 新鲜麦洲- ( 1 6 。p ) 中，混合1r a i n 后，用一个一次性针管和0 4 5t a m 的滤膜进行过滤。 2 ) 取1 0 “l 过滤的样本加入到lm l 的镁离子分析混合液中混匀，于3 7 0 c 水浴3m i n 终止反应，在5 4 61 1 1 1 1 下读取吸光度。 2 2 5 种子活化方法 接一环生长良好的斜面酵母至5 0 2 5 0m l 的培养丛中，3 0 0 c ，1 5 0r m i n ，于摇床上活 化2 4 h 。 2 2 6 考察离子对酵母的影响 按照1 0 的接种比例接入到1 5 0 5 0 0m l 的发酵培养基中1 5 0r m ，3 0 0 c 于摇床上培 养。每8h 取样检测，检测内容为酵母的酸化力、酵f 哮数、o d 、糖耗、p h 等，培养4 0 h 。 2 2 7 液化 采用1 ：7 的加水比调浆，调p h 为6 8 ，采用中温温蕉煮工艺，加酶量为1 0l a g 木 薯粉，液化温度定为8 5 0 c 。蒸煮完成后，迅速水冷至6 0 。c 调p h 为4 8 加酶糖化。 2 2 8 糖化 糖化酶的添加量为2 0 0 g 木薯粉，6 0 。c 下糖化，糖化结束后水冷至3 0 。c 左右。 2 2 9 培养条件的优化 1 1 适宜氮源的选择 选取蛋白胨、硫酸铵、尿素和玉米浆为氮源，分别添加2 、0 5 、