（发酵工程专业论文）反硝化菌DNF409水体脱氮规律研究及其narG基因的中断.pdf

华中农业大学硕士毕业论文 摘要 养殖水环境的日趋恶化已成为制约我国水产养殖业发展的重要因素，其中亚硝 酸盐污染已成为水产养殖业常见且难以预防的危害因素之一。生物反硝化法是理论 上解决水体氮污染的有效方法。 本研究的目的是通过系统研究反硝化菌d n f 4 0 9 的反硝化特性及在天然养殖水 体中的脱氮规律，获得用以指导其实际应用的各项参数：并采用基因打靶技术中断 该菌株硝酸盐还原酶的结构基因n a r g 基因，以改善其反硝化特性。具体研究结果如 下： 1 通过生理生化和1 6 sr d n a 序列分析，反硝化菌d n f 4 0 9 初步判断为芽孢杆菌属 ( b a c i l l u ss p ) 。生长的最适p h 为6 7 ，反硝化作用的最适p h 为7 8 。在生长的各 个阶段，菌株d n f 4 0 9 均具有较强的反硝化活性，最佳反硝化碳源为乙醇。 2 菌株d n f 4 0 9 可在天然养殖水体中高效进行反硝化作用。研究表明，2 8 1 2 3 0 ， 当水体c n ( 质量比) 大于等于8 0 ：1 ，菌体浓度达到1 0 8 c f u 1 , 时，硝态氮和亚硝 态氮的降解率可分别达至t j 9 4 7 9 和9 9 9 4 。表明该菌株在养殖水体的生物脱氮 方面具有广阔的应用前景。 3 利用e c o l i 与b a c i l l u s s p 的穿梭质粒p e g 4 9 1 ，构建了，l d ，g 基因中断载体p e g u d e 。 该质粒带有一个温度敏感型的复制子，并携带有两个长度分别为1 1k b 、2 1k b 且与n a r g 基因序列方向完全相同的同源臂，在同源臂之间及载体部分别含有可 在菌株d n f 4 0 9 中表达的抗性基因e r m ，c a t 。 4 将基因中断载体p e g u d e 电激转化至反硝化菌d n f 4 0 9 中，通过抗性筛选得到表 型为e r m c m s 的重组子d n f 4 0 9 e f ，并通过p c r 分析证实n a r g 基因已被正确 中断。 5 对基因中断菌株d n f 4 0 9 e f 进行反硝化能力检测，结果表明该菌株并未失去对 硝酸盐的还原能力。但它对硝酸盐及亚硝酸盐的还原作用与菌株d n f 4 0 9 相比， 均出现了一定程度的延后现象，初步说明硝酸盐的异化还原对亚硝酸盐的异化还 原存在一定的影响。该实验结果与预期结果不符，具体原因有待进一步研究探明。 关键词：反硝化；芽孢杆菌；硝酸盐还原酶；基因中断；n a r g 基因 反硝化菌d n y 4 0 9 水体脱氮规律研究及其n a r g 基因的中断 a b s t r a c t t h ed e t e r i o r a t i o no fa q u a r i u mw a t e rh a sb e c o m ea ni m p o r t a n tl i m i t i n gf a c t o ro f n a t i o n a la q u i c u l t u r ed e v e l o p m e n ti no u rc o u n t r y a n dt h en i t r i t ep o l l u t i o nh a sb e c o m ea l l u s u a lh a r m f u lf a c t o rw h i c hi sd i f f i c u l tt ob ep r e v e n t e di na q u i c u l t u r e b i o d e n i t r i f i c a t i o ni s o n eo ft h ee f f e c t i v em e t h o d st or e m o v en i t r i t ef r o mw a t e ri nt h e o r y i nt h i ss t u d y , w er e s e a r c h e dt h ed e n i t r i f i c a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h ed e n i t r i f t e r n a m e dd n f 4 0 9 ，w h i c hh a sb e e ni s o l a t e di nt h el a b o r a t o r y , i no r d e rt og e tt h ep a r a m e t e r s ， w h i c hc o u l db ew o r t h yi ni t sa p p l i c a t i o nt ot h eb i o d e n i t r i f i c a t i o n ；a n dt h eg e n e - k n o c k o u t p r o t o c o lw a s u s e dt oc o n s t r u c tn a r gg e n ed i s r u p t i o ns t r a i n ，w h i c he n c o d e st h ec a t a l y t i ca s u b u n i to ft h er e s p i r a t o r yn i t r a t er e d u c t a s e t oi m p r o v et h ec h a r a c t e r i s t i c so fd e n i t r i f i e r 一 ， ， d n f 4 0 9 t h er e s u l t sw e r es h o w e da sb e l o w ： 一- 1 d e n i t r i f i e rd n f 4 0 9w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u s 够b yp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l t e s ta n dt h ec o m p a r a t i v e1 6 sr d n a s e q u e n c e sa n a l y s i s t h eo p t i m u mp hv a l u eo fi t s g r o w t hw a s6 - 7a n dt h eo p t i m u mp hv a l u eo fi t s d e n i t r i f i c a t i o nw a s7 - 8 i t p o s s e s s e dh i 曲l ye f f e c t i v ed e n i t r i f i c a t i o nd u r i n gi t sw h o l eg r o w t hp e r i o d ，a n de t h a n o l w a st h em o s te f f e c t i v ec a r b o ns o u r c ea st h ee l e c t r o nd o n o r 2 d e n i t r i f i e rd n f 4 0 9c o u l dp o s s e s sh i g h l ye f f e c t i v ed e n i t r i f i c a t i o ni nt h ea q u a r i u m w a t e r t h ed a t as h o w e dt h a tw h e nt l l ea nr a t i o = 8a n dt h eb a c t e r i a ic o n c e n t r a t i o n r e a c h e d1 0 s c f u lt h eh i 曲e s td e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo f n i t r a t ea n dn i t r i t ew a s9 4 7 9 a n d9 9 9 4 r e s p e c t i v e l y , w h i c hd e m o n s t r a t e dt h ee x t e n s i v ea p p l i c a t i o no fd n f 4 0 9 t ob i o d e n i t r i f i c a t i o ni nt h ef u t u r e 3 t 1 l ev e c t o ro fn a r gg e n et a r g e t i n gp e g u d ew a sc o n s t r u c t e df r o ms h u t t l ep l a s m i d p e g 4 9 1 i th a d at e m p e r a t u r e s e n s i t i v er e p l i c o n 、c h l o r a m p h e n i c o lr e s i s t a n c eg e n ea n d t w of r a g m e n t sw h i c hw e r e1 1 k b 、2 1 k br e s p e c t i v e l ym a t c h i n gt h es e q u e n c eo f n a r g g e n e a n dt h ee r y t h r o m y c i nr e s i s t a n c eg e n e ，w h i c hc o u l db ee x p r e s s e di nd e n i t r i f i e r d n f 4 0 9 ，w a si n s e r t e di nt ot h et w of r a g m e n t s 4 n ev e c t o ro fn a r g g e n et a r g e t i n gp e g u d ew a si n t r o d u c e di n t od e n i t r i f i e rd n f 4 0 9b y e l e c t r o t r a n s f o r m a t i o n a ne r m 7c m i s o l a t ed n f 4 0 9 e fw a so b t a i n e da n dn a r gg e n e d i s r u p t i o nw a sc o n f i r m e db yp e r 5 t h ed e n i t r i f i c a t i o na n a l y s i si n d i c a t e dt h a ts t r a i nd n f 4 0 9 e fd i dn o tl o s et l l ec a p a b i l i t y o fn i t r a t er e d u c t i o n b u tc o m p a r e dw i t hs t r a i nd n f 4 0 9 ，b o t ht h en i t r a t er e d u c t i o na n d t h en i t r i t er e d u c t i o no fs t r a i nd n f 4 0 9 e fw e r ed e l a y e dt os o m ed e g r e ei nt h et e m p o r a l ， w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tt h e r em i 目血tb es o m er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h en i t r a t e r e d u c t i o na n dt h en i t r i t er e d u c t i o ni nd e n i t r i f i c a t i o np a t h w a y n er e s u l td o e s n t a c c o r dw i t ht h ea n t i c i p a t i o na n dt h er e a s o nr e m a i n st oe l u c i d a t e k e yw o r d s ：d e n i t r i f i c a t i o nb a c i l l u s ；n i t r a t er e d u c t a s e ；g e n ed i s r u p t i o n ；n a r gg e n e 华中农业大学硕士毕业论文 缩略名词表( a b b r e v i a t i o n s ) a m pa m p i c d l i n 氨苄青霉素 a n a e r o b i ca n l n l o n l u mo x i d a f i o n b a s ep a i r g e n ee n c o d i n gc h l o r a m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e c h e m i c a lo x y g e nd e m a n d d i s s o l v e do x y g e n e r y t h r o m y c l nr e s i s t a n c eg e n e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d k i l o b a s e s n i t r a t er e d u c t a s e n i 啊t er e d u c t a s e n or e d u c t a s e n 2 0r e d u c t a s e o p t i c a ld e n s i t y o r i g i no f r e p l i c o n r e s i s t a n c e g e n ee n c o d i n gr e c o m b i n a s e r e p l i c o n s e n s i t i v i t y s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r l s - a c e t a t e e d t ab u f f e r 瓢s e d l a b u 彘r t o t a ln i t r o g e n t 0 “蜀e l d a h ln i t r o g e n 厌氧氨氧化 碱基对 氯霉素抗性基因 化学需氧量 溶解氧 红霉素抗性基因 乙二胺四乙酸 千碱基对 硝酸盐还原酶 亚硝酸盐还原酶 n o 还原酶 n 2 0 还原酶 光密度 复制起始位点 抗性 重组酶基因 复制子 敏感性 十二烷基磺酸钠 t r i s 乙酸e d t a 缓冲液 t r i s - e d t a 缓冲液 总氮 总凯氏氮 m 删 d 必 ， 一 如 耐 铡 一 咖 妨 ：耋 ；| ! m ， m 脚 。 泌 眦 科 耐 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 程 如需保密，解密时问年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，劳表示了谢意 研究生签名：猫。j ，验 时闻： 。年。月陴日 筌名日期：薹口年口月牛日 签名日期：6 年芦扫月，怕 往：请将本襄直接装订在学盘论文的扉页和目录之同 华中农业大学硕士毕业论文 1 前言 1 1 研究背景 随着我国国民经济的不断发展，工、农业经济体系的不断完善，环境污染问题 日益成为人们关注的焦点。尤其是在经济发展与生态环境的冲突中，人们越来越受 到自然环境的警告。环境问题已经上升为全球问题。在环境问题中最为突出的是水 污染问题，水资源紧缺、水环境日趋恶化已经成为制约我国经济发展的重要因素( 李 军等，2 0 0 2 ) 。 氮和磷是废水中常见的无机营养物，它们是引起湖泊富营养化的主要因素。长 期以来，污水的处理均以去除有机物和悬浮固体为目标，并不考虑对氮等有机营养 物质的去除。随着污水排放总量的不断增加以及化肥、合成洗涤剂和农药的广泛应 用，废水中氮、磷等营养物质对环境所造成的影响也逐渐引起了人们的注意( 马文 漪和杨柳燕，1 9 9 8 ) 。氮对水体环境的影响最为突出的是水体( 特别是封闭水体) 的富 营养化。据2 0 0 4 年公布的中国环境状况公报报道：在2 0 0 4 年监测的2 7 个重点湖 库中，满足类水质的湖库2 个，占7 5 ；类水质的湖库5 个，占1 8 5 ；类水 质的湖库4 个，占1 4 8 ；v 类水质湖库6 个，占2 2 2 ；劣v 类水质湖库1 0 个，占3 7 0 。主要污染指标是总氮和总磷。其中西湖、鄱阳湖、镜泊湖，洪泽湖、南四湖， 昆明湖等属于轻度富营养化；东湖、巢湖、太湖、玄武湖、大明湖等属于中度富营 养化；昆明滇池属于重度富营养化。2 0 0 4 年全海域共发现赤潮9 6 次，累计发生面积 达2 6 6 3 0 平方公里，较2 0 0 3 年增加了8 3 o 。全海域共发生1 0 0 平方公里以上的赤潮3 4 次，其中5 0 0 平方公里以上的赤潮1 6 次，接近或超过5 0 0 平方公里的赤潮l o 次。有毒 赤潮生物引发的赤潮2 0 余次，面积约7 0 0 0 平方公里，主要有毒赤潮生物为米氏凯伦 藻、棕囊藻等。可见我国湖泊、水库及沿海海域普遍遭受污染相当严重，而且污染 程度有逐年增加的趋势。 目前，水环境污染和水质富营养化问题的尖锐化迫使越来越多的国家和地区制 定严格的氨氮排放标准。欧洲各国对废水的脱氮要求越来越严。如德国1 9 9 5 年要求 8 5 的污水处理厂达到三级处理标准，1 9 9 9 年要求污水厂出水每2h 取样的混合水样 中至少有8 0 满足总无机氮 0 2m g l 条件下，无反硝化作用的进行； 而g i l l h a m 和c h e r r y 在野外调查研究，经统计分析认为，地下水环境中反硝化作用 的d o 上限为2 0m g l ；d e s i m o n e 和h o w e s ( 1 9 9 8 ) 对地下水n 0 3 - - n 污染晕监 测分析发现，在d o 浓度为2 - 6m g ，l 条件下仍有反硝化作用的存在，但速率很小。 一般来说，在反硝化系统中，反应器内的溶解氧应控制在0 5m e t e 以下，否则会影 响反硝化的正常进行( 顾宗濂，1 9 9 8 ；何苗和张晓健，1 9 9 7 ；杜锡康和贾高雄，1 9 9 9 ) 。 1 4 2 新型生物脱氮理论 近年来，为了克服传统生物脱氮工艺流程复杂、能耗高、运行管理不便、产生 污泥量大等弊端，世界范围内兴起了对生物脱氮新途径的研究热潮。人们普遍开始 认识到，在现有的生物处理系统中，氮在废水处理过程中不能按照传统的脱氮理论 进行平衡。特别是在氮负荷较高、供氧困难或溶解氧较低，c n 比低、水温较高 ( 2 5 - 3 5 ) 等条件下，未知原因的氮流失现象更加明显。随着对传统硝化反硝化 理论的拓展，这些未知的氮流失现象得到了理论上的解释。许多研究表明自然界中 存在多种新的氮索转化途径，如好氧反硝化( a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n ) 、异养硝化 ( h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n ) 、厌氧氨氧化( a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ) 或者由自 养硝化细菌引起的反硝化( d e n i t r i f i c a t i o nb ya u t o t r o p h i cn i t r i f y i n gb a c t e r i a ) 等。 1 4 2 1 异养硝化一好氧反硝化生物脱氦 2 0 世纪8 0 年代后期以来，在生物脱氮生物学方面有了很大进展。r o b e r t s o n 等人 最先报道了好氧反硝化细菌和好氧反硝化酶系的存在，并证实了泛养硫球菌 t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a ( 现更名为脱氮副球菌p 口r a c o c c u sd e n i t r i f i c a t i o n s ) 在生长过 程中，0 2 和n o ；共同存在时，其生长速率比两者单独存在时都高( r o b e r t s o ne ta 1 ， 1 9 8 8 ) 。目前，越来越多的研究证明细菌好氧反硝化的存在，并发现了一些在有氧 条件下有较高反硝化率的细菌( 表1 2 ) ( 李平等，2 0 0 5 ；l u k o wa n dd i c k m a r m ，1 9 9 7 ) 。 从表1 2 中可以看出：许多茵属如产碱菌属( a l c a l i g e n e s ) 、副球菌属( p a r a c o c c u s ) 和假单胞茵属( p s e u d o m o n a s ) 部存在好氧反硝化现象。张亚光等( 2 0 0 4 ) 发现红球 9 反硝化菌d n f 4 0 9 水体脱氮规律研究及其n a r g 基因的中断 菌属( r h o d o c o c c u s ) 也存在好氧反硝化现象。这些好氧反硝化菌往往同时也是异 养硝化菌。这一发现为利用单一细菌、单个反应器在低氧浓度下处理高c n ( 1 0 ) 的废水提供了生物学基础。 表1 - 2 典型的好氧反硝化菌及其反硝化率 t a b l e l 2t y p i c a la e r o b i cd e n i t r i f i e ra n dt h ed e n i t r i f i c a t i o ne f f i c i e n c y 曲羁 曲诔0 2 婀球j 钉( m g t 匠船化弗终产物 l 删f 4 口h k o c k r 妇t r u m m l c r o - l r g v l a p a ，a 口￥ ，h d o _ m a 如- “埘1 c t md c bt 2 5 c f ld b 9 cl a t a 帕r r o r ld r 7 ，m m m 卜，2 0 a n t h r q p ld c bt 2 ， m * m 如| 耐l m 札w t r o d e n l t r l f i c u md s i w a e r a d c m t r t f l 翻md b l 只抽u r t f c a s sd 5 m2 9 4 4 - p d b 2 p a ”h 4a t c c ；t 0 2 7 pb u t a m o v o r a f 7 5 0 ， 7 5 0 l f i 6 0 l 7 5 0 l 7 如， 2 2 5 7 5 0j l _ i 3 0 l i 8 5 一2 4 5 l 0 0 9 2 1 0 0 6 0 0 1 7 矿 1 0 4 0 k 0 0 7 2 * 0 1 0 5 0 4 6 旷 0 2 耐 1 j 酽 0 1 2 8 c 0 2 15 丑 3 6 0 0 - n 2 n 2 n 1 n 2 n 2 n i n 2 n i 只 a f r a l nk s oi 10 、0 0 4 4 n 1 ，r - 舡州s u 2 9 2 o0 0 3 2 in 2 ，玎u t z e r lt r 2 1 2 5 1 0 1 0 8 0n 2 l y c k r o b a c t c r只l 卅_ 崩协d ( b1 6 f 0 1 6