（环境科学专业论文）多环芳烃pahs对海洋鱼类胚胎发育的毒性效应研究.pdf

蛋白。b a p 暴露的真鲷胚胎3 6 h 阶段在p i 范围5 o 左右，分子量范围6 4 - - 9 0 k d a 以及2 5 - - 3 0 k d a 区域内分别出现两组差异蛋白，在p i 范围6 o 一7 o ，分子量2 0 - - 3 0 k d a 区域内同样也出现了一组新蛋白。7 2 hb a p 暴露的真鲷胚胎在p i 范围7 0 1 0 o ，分子量2 8 - - 3 0 k d a 出现两组蛋白，并且蛋白量较高；p i 范围6 o 一7 0 ， 分子量1 0 一2 0 i a 也出现了一组表达量较高的新蛋白。 4 ) b a p 暴露的真鲷胚胎c y p l am r n a 表达与a h r 2 有着非常相似的趋势，而 a h r l 则与c y p l a 的表达没有相关性。b a p 暴露的真鲷胚胎在3 6 hc y p l a 与a h r 2 表达都被显著诱导，并且与暴露浓度有明显的剂量效应关系，二者同时在1 2 9 9 l 暴露组出现了三个时相内诱导的最大值，但二者1 8 , g l 暴露组的表达相对于对照 组没有明显变化。b a p 暴露的高浓度组c y p l a 和a h r 2 的m r n a 诱导表达在3 6 h 之 后开始降低，伴随着两者基因表达量的降低的同时，胚胎出现的高死亡率，而a h r l 的表达在三个时相内并没有显示出被抑制。a h r 2 的表达在各时间段内对照组和暴 露组表达均高于a h r l ，其中最高浓度暴露组a h r 2 的表达是a h r l 的4 0 倍，a h r 2 的表达最高值出现在3 6 h ，随后表达水平降低，而a h r l 表达的最高值则出现在 1 3 2 h ，此前暴露组和对照组表达量都很微弱。表明a h r 2 是a h r 主导的同工型基因， 并且c y p l a a h r 2 很可能是b a p 对胚胎发育毒性调控的主要因素。 关键词：真鲷；胚胎；苯并( a ) 芘；e r o i ) 活性；c y p l a l ；a h r i ；a h r 2 8 a b s t r a c t t h i sp a p e rs t u d i e dt h ed e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yo fp a h so nt h em a r i n ef i s he m b r y o s t w ok i n d so fm a r i n ef i s h e s ( h a p a l o g e n y sn i t e n sr i c h a r d s o na n d l a t e o l a b r a x j a p o n i c u s ) e m b r y o sw e r ee x p o s e dt ot h r e ed i f f e r e n tp a h s i no v oe r o dw a sm e a s u r e dt od e t e c t t h er e s p o n s e so fc y pia i np a g r u sm a j o re m b r y oe x p o s e dt ob a p ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l s o fa h r l ，a h r 2a n dc y p l am r n a sw e r ea l s od e t e r m i n e di nd i f f e r e n td e v e l o p m e n t a l s t a g e s ，a n d2 - d ew a su s e d t o a n a l y s et h e d i f f e r e n c eo fp r o t e i nt o s t u d y t h e d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yo fb a pt op a g r u sm a j o re m b r y o 1 ) d i f f e r e n c e so nt h es u s c e p t i v i t yo fe m b r y o sw e r es t u d i e da f t e rt h et h r e ep a il s e x o p s u r ea m o n gs e v e r a ld e v e l o p m e n t a ls t a g e s r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em o s t s u s c e p t i v es t a g e si nt h ep e r i o do fh a t c h i n gi sf r o mb l a s t u l at og a s t r u l a t i o n , h o w e v e rt h e e a r l yh a t c h e de m b r y o sw e r em o r es u s c e p t i v ec o m p a r e dt ot h ee m b r y o m cs t a g e ，t h et o t a l m o r t a l i t ya n dm a l f o r m a t i o np e r c e n t so fw h i c ha r em u c hm o r eh i g h e rt h a nt h eo t h e r s t a g e s s i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o n sw e r ef o u n di nt h em o r t a l i t yo ft h ee a r l yh a t c h e d e m b r y o sw i t ht h ee x p o s u r ed o s eo fb a p , w h i l et h e r ew e r en oe v i d e n td o s e r e s p o n s e r e l a t i o n sw i t ho t h e rt w op a h sc o m p o u n d se x p o s u r e av a r i e t yo fp h y s i c a la n d m o r p h o l o g i c a ld e f e c t sw e r eo b s e r v e d ，i th a sb e e nf o u n dt h a te m b r y o se x p o s e dt op h e i n d u c e ds y n d r o m eo fp e r i c a r d i a la n dy o l ks a ce d e m a , e m b r y o se x p o s e dt ob a ph a v e d i f f e r e n td e f e c t so fs p i n a lc u r v a t u r e ，w h i l ee m b r y o se x p o s e dt oa nh a v en os i g n i f i c a n t d e f e c t s t h eh e a r tr a t ea n dh a t c h i n gt i m eo fe m b r y o se x p o s e dt ot h et h r e ep a h c o m p o u n d sw e r ea l s od i f f e r e n t 2 ) i no v oe r o da c t i v i t yw a sm e a s u r e da t9d a y sp o s tf e r t i l i z a t i o n t h er e s u l t s h o w e dt h a tc y pia a c t i v i t yo ft h ee m b r y o sw a si n d u c i b l eb yb a pc o n c e n t r a t i o n sa s l o wa so 8 “g l ，w i t hm a x i m a li n d u c t i o no c c u r r i n ga tt h e1 8 r t g lb a pc o n c e n t r a t i o n i n o v oe r o dw a sd o s e d e p e n d e n tw i t hb a pe x p o s u r e ，a n di th a sp r o v e dt h a tc y p1a a c t i v i t yc a n s e r v ea sa ns e n s i t i v eb i o m a r k e ro ft h eb a p 9 3 ) i th a sb e e nf o u n dp r o t e i no fp a g r u sm a j o re m b r y oe x p o s e dt ob a pw a sm a i n l y a c i d i cp r o t e i nw h i c hm o s t l yd i s t r i b u t e db e t w e e np h 3 - 7 u s i n g2 - dm e t h o d t h em o s t o b v i o u sp r o t e i ne x p r e s s e di nt h ep r o t e i np r o f i l e so fe m b r y oe x p o s e dt ob a pa t3 6 hw e r e t w og r o u po fp r o t e i n s 、析t l ls i z ea b o u t6 4 - - 9 0 k d aa n d2 5 - - 3 0 k d a , p ，4 5 4 6 a n o t h e r g r o u po fn e wp r o t e i n so fs i z ea b o u t2 0 - - 3 0 k d aa l la p p e a r e d e m b r y oe x p o s e dt ob a p a t7 2 ha l s oh a dn e wp r o t e i ne x p r e s s e d “t hs i z ea b o u t2 8 - - 3 0 k d ap 17 o 一10 0a n d s i z ea b o u t10 - - 2 0 k d ap 6 0 - - 7 0 t h e s ep r o t e i n 4 ) t e m p o r a lp a t t e r n so fr s a h r 2a n dc y p iam r n a sw e r es i m i l a ri ne m b r y o s e x p o s e dt ob a p ，r e p r e s e n t i n gas i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nr s a h r 2a n d c y p i am r n al e v e l s ，b u tn o tb e t w e e nr s a h r la n dc y p l a i nc o m p a r i s o no f t e m p o r a lt r e n d so fb a p - i n d u c e da h r sa n dc y p iae x p r e s s i o n ，a n dd e v e l o p m e n t a l t o x i c i t i e s ，t h eh i g h e s te x p r e s s i o no fa h r 2a n dc y p i am r n aw e r ed e t e c t e da t3 6 h p r i o rt ot h ea p p e a r a n c eo fs e r i o u st o x i cm a n i f e s t a t i o n s ( h i g hm o r t a l i t y ) t h ea p p a r e n t d e c l i n ei ni n d u c t i o no fa h r 2a n dc y pia m r n a sw a so b s e r v e da f t e r3 6 h ，m e a n w h i l e m o r t a l i t ya p p e a r e d i n h i 曲d o s eg r o u p se m b r y o s o t h e h i g h i n d u c t i o no f c y p1a a h r 2m a y b ei m p o r t a n tf o rt h ed e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yo fb a p t h ea h r 2 m r n al e v e lw a sm u c hm o r eh i g h e rt h a na h r le v e ni nc o n t r o l ，a n dt h ed i f f e r e n c ei n t r a n s c r i p tl e v e l sb e t w e e na h r la n da h r 2b e c a m eg r e a t e ri nad o s e d e p e n d e n tm a n n e r k e y w o r d s ：p a g r u sm a j o r ，e m b r y o ，b e n z o ( a ) p y r e n e ，e r o d ，c y p l a ，a h r l ， a h r 2 l o 英文缩略语 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在 论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。 本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ： 议在b j 一 l 旧每器具e l 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保 留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论 文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位 论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 2 不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名： 修传 日期：1 n 年g 月 日 剔磁氢峋钆醐：岬年扩月日 第一章前言 成千上万种来自城镇居民及工业排放的痕量有机污染物如多氯联苯( p c b s ) 、 有机氯农药( o c p s ) 、多环芳烃( p a h s ) 、多氟化合物( p c o f s 、p c o p s ) 等源源 不断地排入海洋环境中，对海洋生态系统造成潜在长期的毒害并构成威胁 ( s t e g e m a na n d h a h n , 1 9 9 4 ) 。有机化合物在水环境中存在本身并不一定表现出毒性 作用，因而必然要在污染物暴露水平与机体组织内部的污染物含量以及早期的效 应间建立联系。许多能够对水生环境造成污染的有机物还没有被识别出来，而且 它们对水生生物的作用的研究也不清楚，因此化学污染物在水生生态系统中的存 在、效应及其归宿已经成为环境毒理学家广泛研究的热点。 1 多环芳烃( p a j l s ) 污染现状和毒理学研究 持久性有毒化学污染物( p e r s i s i t e n tt o x i cs u b s t a n c e s ，p t s ) 被认为是2 l 世纪影 响人类生存与健康的重要环境问题。无论是斯德哥尔摩公约中确定的1 2 类 p o p s ( p e r s i s t a n to r g a n i cp o l l u t a n t s ) 还是美国e p a 确定的1 2 类p b t ( p e r s i s i t a n t b i o a c c u m u l a t i v e & t o x i cc h e m i c a l s ) 以及环境内分泌干扰物e e d s ( e n v i r o n m e n t a l e n d o c r i n ed i s r u p t o r s ) 的研究都与持久性有毒化学污染物有关。联合国u n e p 制订 的持久性有毒化学污染物( p t s ) 研究清单目前包括2 7 种有毒化学污染物，多环芳 烃( p o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 被列入典型持久有机污染物( p o p s ) ， 受到科学界的广泛关注。 p a h s 通常指含有两个或两个以上苯环以线状或角状或簇状排列的稠环化合 物，是一类广泛分布于天然环境中的有毒有机物质，主要来源于有机物的不完全 燃烧或热解过程。p a h s 也是最早被发现和研究的化学致癌物( r o n a l k e ta 1 7 粥4 ) ， 由于这些污染物在全球普遍存在，具有生物累积性、难以降解、可远距离传输、 致癌致突变性和内分泌干扰等特性，它们所引起的环境与健康问题已经引起国际 环境保护组织、各国政府和民众的高度关注。1 9 7 6 年美国环保局提出的1 2 9 种“优 先控制污染物 多环芳烃类化合物有1 6 种( m a n o l ie ta 1 ，2 0 0 0 ) ；1 9 9 0 年我国提出 的水体中优先控制的6 8 种污染物中，多环芳烃类化合物有7 种。世界范围内每年 1 2 约有4 3 0 0 0 吨p a h s 释放到大气中，同时有2 3 0 0 0 0 吨进入海洋环境。目前人类活 动大大增加了进入环境中p a h s 的量( m e n z i e , 1 9 9 2 ) ，石油及其燃烧产生的p a h s 是工业化和城市化对环境影响的主要标志，在土壤、大气、沉积物与水环境中都 可以检测到p a h s ，各种消费品与食物中也被检测到含有p a h s ( 庞碱1 9 9 4 ) 。 p a h s 是海洋中常见的污染物，尤其在工业化程度较高的河口、港湾和码头。 多环芳烃在世界各近海区域中均可以被检测到，近海区域每年受纳的p a h 总量大 于2 3 x 1 0 5 吨，近海环境的p a h 主要来源于人工源，其中溢油和大气传输给近海 环境造成的p a h 污染最为严重( e i s l e r , j 粥7 ) 。在海洋环境中，p a h s 广泛分别在 海水、沉积物和海洋生物体内，尤其在海水微表层和底栖环境中，富集情况尤为 显著。尽管与其他化学污染物相比，p a h s 在海洋各介质中的绝对含量较低，但对 海洋生物的毒性却极为显著。基于p a l - i s 在海洋环境中广泛的分布、滞留时间长 和强烈的致癌作用，因此常被作为环境污染监测的重要指标。 天然环境中的p a h s 按其物理化学性质可分为两类：一类为带有2 3 个苯环 的低分子量的芳香烃，如萘、菲和葸等，这些化合物易挥发，对生物有一定的毒 性；第二类带有4 - - - 7 个苯环的高分子量芳烃，如芘、荧葸、苯并( a ) 芘等，这些 化合物沸点高，不易挥发，遗传毒性较高( 岳载等，2 0 0 3 ) 。 p a h s 极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很 大危害( s a e e de ta 1 ，1 9 9 5 ；p a t e r s o ne ta 1 ，1 9 9 0 ；b e he ta 1 ，1 9 9 1 ) 。p a h s 进入生物体 后经代谢活化而成为高毒性的代谢产物，能不可逆地损伤生物大分子( d n a 、蛋 白质、脂质) ，p a h s 代表一类有毒化合物，其在体内产生许多毒性反应，包括细 胞毒性、遗传毒性免疫毒性、致畸性和致癌性等a 2 p a h s 对鱼类及其胚胎的生态毒理学研究 随着国际生态毒理技术发展，各国都建立了本国的标准实验方法，并且由淡 水生物技术向各不同水域发展，由短期效应研究向着长期效应发展。例如能评价 水环境污染的鱼类长效应快速测定新技术斑马鱼胚胎仔鱼毒性实验技术，是由瑞 典生态毒理学家g o r a nd a v e 为首组织欧洲一些国家研究建立的，已被国际采纳。 研究污染物对鱼类胚胎不同发育阶段的作用可以为化合物毒理学研究提供特殊的 信息，如毒物最敏感的毒理学指标和最关键的暴露时间，从而分析综合污染水中 主要毒性物质，毒性作用机制。鱼类胚胎技术不仅具有成本低、操作简易、影响 因素少等特点。与成鱼试验相比，其丰富的毒性指标及较高的灵敏度使其具有更 广阔的发展空间，不久的将来极有可能取代传统的鱼类急性实验。除此之外，在 发育生物学和分子遗传学领域，鱼类胚胎已有大量研究成果发表，对探讨污染物 的致毒机理很有帮助，并初步判断污水中的毒性类型及潜在危害程度。 鱼类是脊椎动物中对有机污染最敏感的物种之一，其中个体的胚胎发育阶段 对污染物作用最敏感，遗传易感性更高，生理和器官形成方面更容易受到外界污 染的影响( p e t e r s o n , r e ，e ta 1 9 刃? w a l k e r , mk ，a n d p e t e r s o n , 足e1 9 9 4 ) 。多 环芳烃及同类污染物的毒性在不同物种间存在很大差异，这些差异很大程度上决 定于污染物的存在形态、暴露途径以及生物个体所处于生活史的不同阶段。p a h s 对成体动物的毒性效应已有大量的研究报道，然而p a h s 对于胚胎和幼体鱼类对发 育毒性研究较少，毒性机制不清楚。 2 1 硬骨鱼类胚胎发育模式 绝大多数鱼类为体外受精，只有少数鱼类有交接器。精、卵在水中保持受精 能力的时间很短，精子仅几十秒，卵子在1 2m i n 后就失去受精能力，有些鱼类 卵膜孔地区能产生一种物质吸引精子的活动。鱼类精子只有通过卵膜孔才能与卵 胚盘的质膜相遇，在此胚盘中有较长的微绒毛组成的精子传入部。此时由于皮层 反应，皮层颗粒排出物可阻塞卵膜孔，以阻止第二个精子的进入。同时壳膜举起 变硬，皮层和卵黄间的细胞质向动物极发生有节奏的收缩，使细胞质在动物极集 中为一盘状的胚盘。 了解鱼类胚胎发育对于胚胎毒理学研究有重要意义，鱼类胚胎发育过程中生 理和形态上的变化非常大，所以建立胚胎发育的模型对于深入了解胚胎毒性作用 机制相当重要。动物的胚胎发育的模型，在比较大量动物的发育过程后，在胚胎 学上建立了硬骨鱼类胚胎发育的基本模式。鱼类胚胎发育一般经历以下几个阶段： 受精、卵裂、囊胚、原肠胚和神经胚。 2 2p a h s 对鱼类胚胎的形态和生理方面的毒性效应 胚胎和幼体阶段的鱼类对于各种污染源类的p a h s 的暴露都极为敏感，有关 p a h s 对海洋鱼类毒性研究包括原油泄漏、木材防腐剂、沉积物和沙滩油污染等 1 4 ( c a r l s , m ，g e ta 1 1 9 9 9 ；h e i n t z , r a e ta 1 2 0 0 0 ；c o u i l l a r d , c 。m 。e ta 1 2 0 0 2 ；v i n e s , c a ，e ta t2 0 0 0 ) 。p a h s 对于鱼类胚胎的毒性研究研究表明p a l - i s 暴露导致鱼类胚胎 生理出现一系列的异常症状，包括卵黄囊水肿、心脏功能紊乱、脊髓的弯曲、颅 面和下颌结构发育不完全、神经细胞死亡、贫血、遗传突变等，通常产生上述缺 陷的胚胎在后续的发育阶段死亡率很高( w h i t e , p a ，e la 1 ，1 9 9 9 ；b a r r o n , m g ，2 0 0 3 ； b i l l i a r d , s m 2 0 0 2 ；b r i n k w o r t h , l c 。2 0 0 3 ；i n c a r d o n a , i p 2 0 0 4 ) o 斑马鱼胚胎暴露于t c d d 颅面结构出现一系列发育缺陷，所产生的效应与暴 露剂量正相关( h e n r y e ta 1 ，j 9 97 ，t e r a o k ae ta 1 ，2 0 0 2 ；胁肛么e la 1 ，2 0 0 4 ) 。t c d d 暴露的斑马鱼胚胎在总的毒性效开始表现的同步或之前已经出现了严重的血液动 力学上的变化，例如所观察到的躯干、头部和鳃部血流的减缓，以及心率的减慢。 并且在组织学上也观察到一系列的上皮组织损伤，包括：鳃和b a l l o o n i n g 发育的 停滞，肾小管、肝脏细胞、胰腺和主要脑区域的衰退或坏疽。间充质组织损伤包 括：头、躯干和卵黄囊的皮下组织水肿，围心腔和骨骼肌浮肿，浮囊发育缺失( h e n r y 甜a 1 1 9 9 7 ) 。各项研究显示t c d d 诱导的多种鱼类幼体先发的循环系统障碍是幼 体随后死亡的主要因素( e l o n e ne ta 1 ，1 9 9 8 ；h e n r ye ta t ，9 9 力s p i t s b e r g e ne ta 1 1 9 9 0 ；纥，妇，a n dp e t e r s o n , 1 9 9 4 ) 。 2 3p a l - i s 对鱼类胚胎毒性效应的机制研究 对于水生动物而言，普遍接受p a h s 毒性作用有两种途径：( 1 ) 通过激活芳香烃 受体a h r 调控涉及p a h 的主要代谢酶类基因表达，如细胞色素p 4 5 0 1 a ；( 2 ) 非极 性麻醉一生物组织对p a h s 的吸收主要依靠其疏水性，毒性的作用是通过非特异的 扩散到脂质双分子层( i n c a r d o n a , i p ，e la 1 2 0 0 6 ) 。通常认为结构简单的2 4 环 p a i l s 缺乏结构活性，通过直接扰乱膜功能或麻醉直接作用，不具有特异毒性；而 高分子量的p a h s 是芳香烃受体a h r 和细胞色素p 4 5 0 1 a 的强诱导剂，有癌和致突变 的毒性。一些p a h s 对鱼类早期发育阶段的毒性效应非常类似由t c d d 或平面卤代 芳烃( p h m h s ) 弓l 起的通过激活芳香烃受体a h i t 途径诱导c y p i a 和其他i 相或i i 相酶 类表达而产生一系列毒性( s a f e ，s ，2 0 0 1 ) 。 2 3 1 鱼类及胚胎中的p 4 5 0 1 a 及其对污染暴露的诱导表达 细胞色素p 4 5 0 酶系是一个基因超家族，主要组分包括两种细胞色素( 细胞色素 p 4 5 0 和细胞色素b s ) 、两种黄素蛋白( n a d p h 细胞色素p 4 5 0 还原酶和n a d h 细胞 色素b 5 2 1 i 原酶) 以及磷脂等，细胞色素p 4 5 0 酶系( c y p ) 中的p 4 5 0i p 4 5 0 i v 家族 是代谢外来化合物的主要酶系( 拶质关筝2 0 0 1 ) 。鱼类外源化合物的p h a s ei 生 物转化主要是在依赖c y tp 4 5 0 的m o 或m f o 系统下调节的。鱼类中对催化外源成分 生物转化的c y p 4 5 0 同工酶的分类是c y p l a 亚族，包括c y p l a l 和c y p l a 2 两个基 因在鱼类方面主要研究的是c y p l a ，而且研究发现在所检测的鱼类中迄今只证明 普遍存在c y p l a 基因( s i m o nc c o u r t e n a y , 1 9 9 9 ；s t e g e m a nz 2 0 0 0 ) 。 g o k s o y r 和h u s o y ( 1 9 9 8 ) 综述了关于c y p 4 5 0 系统的生化和毒理学方面的研 究，详细描述了鱼类c y p l a 诱导反应，并且讨论了c y p l a 诱导的生态毒理学过程 以及采用免疫化学技术测定c y p l a 诱导响应做为环境监测的生物标志物。尽管肝 脏是关于c y p 4 5 0 的最重要的器官，通过免疫组织化学印迹发现c y p l a 也在其它组 织表达。暴露于水体或食物中b a p 的m a m m i c h o g 中观察到c y p l a 特定的细胞表达 线路( v a nv e i d e t a l ，1 9 9 7 ) 。水体中的b a p 暴露导致鳃、心脏、肝脏、血管中约c y p l a 水平升高，而食物中的b a p 导致肠上皮的c y p l a 水平升高，由于接触环境污染物 而导致的c y p i a m r n a 的升高，从而使c y p i a 蛋白水平也升高。外源污染物包括 芳香烃和氯化烃的生物转化和解毒中的特征反应是诱导，p a h s 、p c b s 等都是 p 4 5 0 1 a 有效的诱导。p 4 5 0 1 a 的诱导是鱼类暴露于p a h s 、p c b 、二嗯英以及相关化 合物的早期预警信号及高度敏感的生物反应，而且p 4 5 0 1 a 的诱导与毒性终点有相 关性( w i r g i nzz1 9 9 4 ) 。鱼类胚胎c y p l a 对于污染物的暴露同样非常敏感，研究 发现淡水鲑鱼( 1 a k et r o u t ) 发育早期阶段血管内皮细胞对于t c d d 暴露能够产生 c y p i a 显著诱导。t c d d 暴露的剂量效应关系对于血管内皮组织的c y p i a 诱导和 早期阶段的死亡率二者相似，表明a h r 对于血管内皮组织调节作用可能是t c d d 诱导的水肿症状并造成幼体高死亡率的根源( g u i n e ye ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 2 3 2c y p l am r n a 表达水平、蛋白水平的主要检测方法 c y p l a m r n a 的水平将成衡量为c y p l a 诱导的有效手段之一，检测c y p l a m r n a 表达所涉及的实验包括n o r t h e r nb l o t 、d o tb l o t 、s l o tb l o t 、原位杂交、n u c l e a r r a i l o na s s a y s 和r e a l t i m ep c r ，相关的实验显示它们是灵敏的生物标志物( b u c h e l i a n d f e n t , 1 9 9 5 ) 。，c y p l a 蛋白质水平可以通过单克隆或多克隆抗体h q e l i s a 、 w e t e r n b l o t 或组织化学等免疫学技术的确定( b u c h e l ia n d f e n t , 1 9 9 0 。实时定量p c r 1 6 检测技术是近年来发展起来的新兴p c r 技术，其p c r 扩增和产物分析的全过程均 在单管封闭条件下进行，通过微机控制，实现了对p c r 扩增产物的实时动态检测 和结果自动分析，不需对p c r 产物进行后处理( w a l k e rn z ，2 0 0 2 ) 。实时定量p c r 技术将荧光共振能量传递现象，光学技术与常规p c r 相结合，从而实现了核酸的 精确定量。该方法的实验过程均在封闭状态下完成，可有效降低产物污染，灵敏 度、特异性均较高，而且简便快速，自动化程度高，实时定量p c r 技术常见的有 以下几类：t a g m a n 探针技术、杂交探针技术、分子信标技术、双链d n a 结合染料 技术等等。实时荧光定量p c r 技术自1 9 9 6 问世以来，发展到现在已经被广泛应用 到生物学各个领域，涉及到的范围包括d n a 、m r n a 和病毒荷载量的定量，核酸 多态性分析，基因突变分析等多个领域。对于海洋污染的生物监测方面，目前国 内外已经开展了相关的研究将r e a l t i m ep c r 技术应用于检测鱼类暴露于有机污 染、内分泌干扰物和重金属等而产生的基因表达差异( q i a n gg a o , e ta 1 2 0 0 7 ；q i n g l i z h a n g , e la 1 2 0 0 7 ：j a e s u n gr h e e , e ta l2 0 0 7 ) 。 2 3 37 乙氧基- 3 异吩嚼唑酮脱乙氧基酶( e r o d ) e r o d 为p 4 5 0 1 a 1 基因编码的同工酶，许多研究表明，p 4 5 0 1 a 基因表达水平 与p 4 5 0 1 a 编码的e r o d 的催化活性有量的关系( m i l l e r a ，i c a ，e ta 1 2 0 0 3j 如砌足 p e t r u l i s , e la l ，1 9 9 9 ) 。对于b a p 等对c y p i a 的催化活性影响，通常有两种方法， 一种是测定芳香烃羟基化酶( a r y l h y - - d r o c a r b o nh y d r o x y l a s e ，a h h ) 的活性，这 可通过测定b a p 的羟基化合物来指示，另一种则是测定鱼体肝脏e r o d 活性，而 e r o d 活性是确定鱼类c y tp 4 5 0 诱导反应最敏感的同功酶( p a y n e , j e ，1 9 9 6 ；c o l l i e r , z k ，e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。通过检测e r o d 可以分析p 4 5 0 1 a 1 的诱导，e r o d 能把 7 - e t h o x y r e s o r u f i n ( 7 乙氧基异吩嗯唑) 的0 【c h 氧化成0 【c o h ，产生的半缩醛能自 发的分解出r e s o r u f i n ( 9 羟基3 异吩唑酮) ，可通过荧光分光定量。 在近年来，菊脂，多环芳烃，硝基芳烃，多氯联苯，重金属离子对鱼类e r o d 活性的影响国内外已经有了大量的研究，且不同的污染物特别是p a h s 在一定程度 上都能对e r o d 活力起到诱导作用，所以e r o d 在污染物影响下的的激活程度，已 经成为较可靠的生物监测指标，用来评价污染物对生物体的影响，但是p a h s 在 e r o d 方面对于无脊椎动物的研究较少。 在正常环境中，生物体内e r o d 活性是相对较低的，但在外来某些特定的化学 污染物的诱导下，它们的活性异常增高，将生物体内的e r o d 活性作为环境中特定 污染物的监测指标已成为研究热点。暴露于痕量有机污染物的许多鱼类都被观察 到a h h 和e r o d 活性的上升，p a h s 、p c b s 、p c d d s 、p c d f s 导致c y p l a 催化活 性强提高。近期的研究发现，例如m 狐h s 和n 代杂环芳烃，它们在环境中普遍存 在，将显著促进p a h 污染环境中鱼的c y p i a 诱导( j u n g e t a l ，2 0 0 1 ) 。通常在c y p i a 蛋白水平和e r o d 活性间存在很好的相互关系，许多实际研究显示了许多接触污染 的鱼类肝脏c y p i a 蛋白的水平和活性都显著提高( p a n d e ro o s te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。而 e r o d 活性在暴露有机锡的b u l l h e a d e l l 和r a i n b o w t r o u t 中则表现为显著降低，p c b 诱导c a t f i s he r o d 活性升高也被低剂量的有机锡所抑制，同样在接触苯巴比妥的 g u p p i e s q u 发现a h h 活性降低( r i c ea n d r o s z e l l , 1 9 9 8 ) 。所有鱼类的a h h 响应来自2 3 个实验室研究和3 3 个实际研究中显示：8 8 的实验室研究和9 0 的实际研究观察到 a h h 活性的显著提高，而4 3 的实验室研究和3 9 的实际研究观察到强烈提高； 来自1 3 7 个实验室研究和1 2 7 个实际研究得到的各种鱼类e r o d 响应显示：8 8 的实 验室研究和9 0 的实际研究观察到e r o d 活性的显著提高，6 9 的实验室研究和 3 1 的实际研究观察到强烈提高( v a nd e ro o s t 冠2 0 0 3 ) 。 尽管某些化学物质会抑$ l j e r o d 诱导活性，但并不会影响e r o d 做为生物标志 物的使用( w h y t ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。结合c y p l a 蛋白质和m r n a 的表达水平，c y p l a 催 化活性的诱导可以用来做为海洋环境中许多痕量有机污染物潜在毒性作用的暴露 评价和早期预警生物标志物。c y p i a 诱导毒性的机制研究表明，e r o d 活性不仅可 以显示污染物的暴露，而且可以作为各种水平上生物个体的效应生物标志物，而 某些将影响酶活性的因素在阐述这些参数对污染物的响应时必须考虑到。 2 3 4 鱼类胚胎a h r 对p a h s 类污染物的毒性调控 芳烃受体a h r 是碱性螺旋一环一螺旋p a s 蛋白家族的其中之一，这个蛋白家 族还包括芳烃受体核转运因子a r n t 、a r n t 2 和a r n t 3 ( a hr e c e p t o rn u c l e a r t a n s l o c a t o r , a r n t ) ，缺氧诱导因子一l a ( h i f l a ) ，专一内皮p a s 蛋白1 ( e p a s a h i f 2 a ) ，s i n g l em i n d e d ( s i m ) 等其他因子。这些蛋白在感受和适应外界 环境的变化种起着重要作用( g u e t a l ，2 0 0 0 ) 。由于在调节机体对于环境污染物( 如 p a h 、t c d d 等) 的反应，芳烃受体( a h r ) 的信号传导途径已经在哺乳动物中被 详细的描述。未配合的a h r 以一种复杂形式( 至少三种伴护蛋白) 存在，两分子 的h s p 9 0 ( p e r d e we ta 1 ，1 9 8 8 ) 和一分子的芳烃作用蛋白a i p ( a h ri n t e r a c t i n g p r o t e i n ，彳及其他蛋e t ( c a r v e re ta 1 ，1 9 9 7 ；m e y e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这些伴护蛋白使 a h r 在细胞质中能够正确和受体结合，一旦和受体结合，a h r 转移到胞核与伴护 蛋白分离从而与a r n t 聚合。a h r a r n t 聚合体进入细胞核，并与增强子结合， a h r 羧基端的转录激活域与其他转录因子形成转录起始复合物，最后形成一种更 为复杂的配位体受体复合体，然后与d n a 上的特异部位结合，促进c y p l a l 、 c y p l a 2 、c y p l b l 或其他靶基因的转录( s c h m i d t a n d b r a d f i p 矗1 9 9 6 ) 。对c y p l a l 诱导最强的物质是t c d d ，多环芳香类化合物对生物体产生的毒性效应很大程度上 是由多环芳烃受体( a h r ) 所调节的，a h r 对于t c d d 等多环芳香类化学物质由 很强的亲和绑定能力( j u n s e im i m u r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。t c d d 对不同鱼类发育阶段产 生相似的毒性效应，这表明它对不同鱼类的作用有共同的机制( w a l k e ra n d p e t e r s o n , 1 9 9 4 ) 。在鱼类幼体中a h r 被认为涉及这种调节机制，研究发现t c d d 对 鲑鱼( t r o u t ) 和斑马鱼( z e b r a f i s h ) 幼体早期的毒性效应与a h r 的表达和激活有关 ( g u i n e ye ta 1 ，1 9 9 7 ；h e n r ye ta 1 ，1 9 9 7 ；t a n g u a ye ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 芳烃受体核转运因子( a r n t s ) 是转录调节因子碱性螺旋一环一螺旋p a s 家族 的成员，a r n t 蛋白可以与其他的p a s 家族成员( 如a h r 、h i f l 一a 和e p a s 一1 ) 形成一种二聚体，这种二聚体可以在环境和发育条件改变的情况下调节鱼类相应 基因的表达( g ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这种a h r a r n t - - 聚体在调节环境中的污染物如 p c d d s 和p c b s 对鱼类产生的效应上起了重要的作用，具体的信号转导途径已经在 哺乳动物中详细描述。 2 3 5 蛋白质组学在海洋环境评价中的应用 单一的分子生物标志物在复杂的污染环境下灵敏度欠缺，使得相关污染物的 风险评价模糊、不确定。海洋环境中对于污染物的暴露可以选用特异性蛋白的变 化来作为可靠的生物标志物，蛋白质组学做为基因组学在m r n a 表达水平上的补 充和延伸，蛋白质组学以双向电泳技术、液相色谱技术和生物质谱技术等为研究 手段，研究全基因组在某个细胞或组织中某个特定条件下所表达的全部蛋白质为